专利名称：一种检测少儿综合疾病遗传易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体地说，本发明涉及一种检测少儿综合疾病遗传易感性的试 剂盒，通过对疾病遗传风险相关的基因进行检测分析来评估少儿综合疾病遗传易感性。
背景技术：
基因检测分析技术已迅速成为预测人类疾病健康的重要工具。基因技术能将人类的健康状态和生理病 症、遗传突变的因素、疾病的倾向和状态等关联起来。DNA序列由于碱基插入、缺失、错配引发的遗传因 子突变，以及个体DNA表达式的上下调节等都是和健康状态及疾病的机理有关的生物信息。例如，"老年性痴呆"是一种出现于老年期的持续性智能损害。遗传基因是老年性痴呆的重要风险因 素，其中AP0E基因e4亚型与老年性痴呆患病风险密切相关。如果携带2个拷贝AP0E e4等位基因(e4/ e4)， 便属于高风险人群。在没有采取预防措施的情况下，65岁以下患老年性痴呆的可能性是60%到75%。而相 比之下，在AP0E基因e4等位基因检测结果呈阴性的人群中，老年性痴呆的发病危险不足10%。被测试者 可以根据基因检测结果，采取积极预防措施，使发病年龄至少可以推迟10年。又如，研究显示P0N1基因的Glnl92Arg多态性与冠心病严重性、冠状动脉粥样硬化进展程度、血脂 水平和降血脂药物治疗效果都有相关。通过检测中国北方地区49例老年冠心病患者和38例健康老年对照 者的P0N1的Gln/ Argl92基因多态性，研究发现冠心病组与健康组比较各基因型分布差异具有显著性意 义。B等位基因在冠心病组比例为0.56，在健康组为0.37，冠心病组的B等位基因比例明显高于健康组。 B等位基因是中国北方地区冠心病发病的危险因素。说明P0N1基因Gln/Argl92遗传多态性与中国北方地 区冠心病发病明显相关。通过检测P0N1基因的Gln/ Argl92遗传多态性能够得到被检测者的冠心病易感 性，可以根据检测结果尽早采取预防措施，减小发病的可能性。再如，p53突变和DNA甲基化在一定程度上预示了直肠癌的病理存在，进行基因检测可以在被测者身 体尚未显现任何症状的情况下发现早期直肠癌，及早采取措施进行治疗，延长生命。ALDH2基因的rs671 多态性改变(G/A)缺陷导致机体对乙醛的代谢能力下降，引起饮酒的不适感，脸红综合症等，容易导致 酒精中毒。通过基因检测分析可以预知个人是否会发生酒精中毒情况，可以进行提前预防。相对于已经发 生酒精中毒再进行补救，基因检测可以更好地保障生命健康。同样对于一些药物的使用，基因检测可以得 知个体对药物药效与毒副作用的敏感性，基因检测的结果可以作为医师用药的参考。发明内容基于基因检测分析技术可用来评估个体疾病遗传易感性的基础上，本发明提供一种检测少儿综合疾病 遗传易感性的试剂盒。本发明所述的试剂盒主要用于检测与药物性耳聋、支气管哮喘、儿童肥胖、代谢性疾病等，及改善抗 氧化能力、解毒能力、炎症反应、维生素利用、叶酸代谢能力、骨骼发育相关的基因，为被测少儿提供一 份相关基因分型检测报告和个体化的健康发育指导报告，帮助少儿在发育过程中预防哮喘、药物致聋、肥 胖和营养失衡等问题的发生。该试剂盒包括检测N0S3、 CTLA4、 ENOS、 ERCC1、 ERCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTR、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 OPG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQ01基因上28个SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、反应缓冲液、去离子水等)。 本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对N0S3、 CTLA4、 EN0S、 ERCC1、 ERCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTR、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 OPG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQOl基因上28个SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这28个SNPs 位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。特异性引物对可用常规的 合成技术进行合成。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对N0S3、 CTLA4、 EN0S、 ERCC1、 ERCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTR、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 0PG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQ01基因上28个SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检 测出这28个SNPs位点基因型的Taqman探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。特异 -性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。所有可用于荧光定量PCR法检测本发明中所述的28个 SNPs位点的探针均在本发明范围内。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应使用检测试剂盒，每个SNP位点分别进行一次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积 lOjxl，包含浓度为20ng/nl的DNA模板2fil、 lpl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. Uil 25raM dNTP混合 液、0.6^1 25mM MgCl2溶液、(5units/nl) Taq DNA聚合酶、20|xM的引物每一条各0. 225^1、 10pM的荧光探针每一条各0. 25(^1,去离子水5. 325nl 。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95'C、 10分钟，进行60个循环的 95。C、 30秒，60°C、 l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCK仪上读取样品荧光量。步骤3: SNP基因型分析熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针的不同炎光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。实施例2.对少儿进行综合疾病遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。步骤2:基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DM的N0S3、 CTLA4、 ENOS、 EKCC1、 EKCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTR、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 OPG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQ01基因上28个SNP位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这 些SNP位点的基因型。步骤3:综合疾病遗传易感性的分析通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具综合疾病遗传易感性的分析报告单，并由医师向被检者详 细说明和解读综合疾病遗传易感性分析报告单。
权利要求
1. 一种检测少儿综合疾病遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测NOS3、CTLA4、ENOS、ERCC1、ERCC2、MTHFR、MTRR、MTR、MS4A2、XRCC1、ALDH2、TNFA、CCL5、PARP1、OPG、VDR、PON1、AGT、CCND1、UCP2、ADH2、ADBR2、APOB、CYP11B2、CYP1A1、CYP2E1、CETP、NQO1基因上28个SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对NOS3、 CTLA4、 EN0S、 ERCC1、 ERCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTR、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 OPG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQ01基因上28个SNP位点而设计， 能特异性扩增出包含这28个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的特异性荧光探针对是指针对N0S3、CTLA4、EN0S、 EI CC1、 ERCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTK、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 0PG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQ01基因上28个SNP位点而设计， 能通过荧光定量PCR技术特异性检观纟出这28个SNPs位点基因型的Taqman探针对。
全文摘要
本发明公开了一种检测少儿综合疾病遗传易感性的试剂盒。该试剂盒包括同时检测NOS3、CTLA4、ENOS、ERCC1、ERCC2、MTHFR、MTRR、MTR、MS4A2、XRCC1、ALDH2、TNFA、CCL5、PARP1、OPG、VDR、PON1、AGT、CCND1、UCP2、ADH2、ADBR2、APOB、CYP11B2、CYP1A1、CYP2E1、CETP、NQO1基因上28个SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与少儿综合疾病遗传易感性密切相关的单核苷酸多态性位点基因型来评估少儿综合疾病遗传易感性。
文档编号C12Q1/68GK101275161SQ20071003859
公开日2008年10月1日 申请日期2007年3月29日 优先权日2007年3月29日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司