甲亢易感性检测方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及甲亢易感性检测方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]Graves'病（Graves'disease,⑶），又称毒性弥漫性甲状腺肿伴甲允，通常称为甲 亢，是一种甲状腺激素（TH)分泌增多的、遗传与环境共同起作用导致的器官特异性自身免 疫性疾病，是甲状腺功能亢进的最常见病因。甲亢临床上的典型特征包括弥漫性甲状腺肿、 甲状腺功能亢进的系列表现、眼症以及胫前黏液水肿和指端粗厚。甲亢在临床上目前为免 疫内分泌主要疾病之一，甲亢所引起的心衰、甲状腺危象的发生，常危及患者生命，致疾病 预后不良。最近的调查显示中国人群的发病率为〇. 25~1. 09%,估计患者约有1300万。亚 洲人群的发病率较欧美和非洲人群发病率略
[0003] 同胞对研究显示，同卵双胞胎患甲允的一致率达36%,异卵双胞胎患病 率为3%，甲亢发病的所有影响因素中遗传的比重占79%〔Brix，T.H.，Kyvik，K. 0. ,Christensen,K. &Hegedus,L.Evidenceforamajorroleofheredityin Graves'disease:apopulation-basedstudyoftwoDanishtwincohorts.JClin EndocrinolMetab86, 930-4(2001)〕。遗传因素在甲亢的发病机制中具有重要的作用。
[0004] 甲亢的发病率存在着明显的男女差异。好发于生育年龄的女性，女性发病率大约 是男性的5-10倍。在Turner综合征患者中甲允的发病率很高，而Turner综合征是由于X 染色体缺失或有其他异常导致的。研究也发现甲亢患者体内X染色体失活偏移发生率显著 高于同年龄段的健康个体。这些现象一致提示X染色对甲亢发病有重要的影响。
[0005] 近年来，单核苷酸变异（SNP)概念在多基因疾病研究中的广泛运用，同时，高通 量、低成本的SNP检测手段的不断出现也为SNP大规模快速分型提供了可能。这为在分子 水平上研究甲亢的发生和发展的机制开辟了全新的思路和手段。SNP的存在与否以及等位 基因频率存在人种及地域的差异，这就提示多基因疾病遗传异质性的存在，即同一疾病或 性状在不同的人群中可能是不同的遗传因素造成的。另外，不同人群中SNP类型和频率存 在的这种差异也与不同人群对药物及环境因素的反应性不同密切相关。
[0006] 甲亢作为一种遗传因素起较大作用的疾病，寻找易感基因基因进而阐明其遗传 机制已经成为目前研究的热点。虽然已有许多关于遗传变异与甲亢的研究，但没有证实 GPR174基因与甲亢相关性的报道，更没有证实本发明所述的GPR174基因SNP与甲亢相关性 的报道。
[0007] 综上所述，为了早期预防和诊断甲亢，本领域迫切需要寻找甲亢易感基因，并开发 用于甲亢疾病预警的方法和试剂盒。
【发明内容】
[0008] 本发明人运用Plink软件对X染色体的数据同常染色一样进行常规的Cochran Armitage趋势检验，没有发现X染色体上的易感基因。鉴于Plink软件常规Cochran Armitage趋势检验的方法对X染色体分析的缺陷，本发明人进一步用另外的两种方法(男 女分层分析和Clayton的方法)对X染色体进行分析。两种关联分析的方法都显示一组存在 着强LD关系的SNPs与⑶相关。这些关联的SNPs位于Xq21. 1区域，分布在GPR174基因及 其周围区域。P值最低的SNP是距离GPR174基因约155-kb的rs5912838(P1()gisti。_essim= 4. 60Xl(T8;PsnpMataix=L36Xl〇-9;OR=L80, 95%CI1. 48-2. 18)。推定填补分析并没有在Xq21. 1 区域发现P值更低的SNPs。在这些关联的SNPs当中，rs3827440是一个导致GPR174发生 非同义突变的SNP，它与P值最低的rs3827440之间存在着强的LD关系。虽然rs3827440 不是这一区域P值最低的SNP，但是它是非常值得研究的功能变异。
[0009] 在验证阶段的4, 564例患者和3, 968例性别匹配的对照中，对rs3827440进行分 型。统计结果验证了最初的关联，并且合并分析的P值达到了全基因组关联研究的显著性 水平（combinedPlogisticregression=5. 53X1CT21;combinedPsnpMatrix=4. 26X1CT22; 0R=1. 69, 95%C IL53-L86;表 3-6)。rs3827440 的OR值为 1.69 (95%C11.53-1.86)，在本发明的研究样 本中仅低于HLA区域的rs4947296。提示在中国人群中GPR174是一个重要的易感基因。
[0010]RS3827440是GPR174基因编码区的第519位C-T变异，造成第162位氨基酸由 脯氨酸转变为丝氨酸（P162S)。本发明的重测序结果显示5'非翻译区（5'UTR)区域的两个 SNPs(rs3810711与rs3810712)与rs3827440是完全连锁不平衡关系。RT-PCR结果显示 rs3827440的基因型与外周血GPR174的表达量相关。无论男性群体还是女性群体，TT或T 基因型都与GPR174的高表达相关(分别为P=0. 009和P=0. 029)。在男女混合人群中，携带 TT或T的群体GPR174的表达量显著高于携带CC或C的群体（P=0.002)。这些结果提示， rs3827440或者其他两个与之连锁的5'UTR区域SNPs(rs3810711与rs3810712)单独或 者共同影响了GPR174基因的表达量，从而影响了GD的遗传易感性。
[0011] 因此，本发明的目的就是提供一种辅助诊断（尤其是早期诊断）甲亢的方法及检 测试剂盒。
[0012] 本发明的另一目的是提供一种新的治疗甲亢的方法。
[0013] 在本发明的第一方面，提供了一种对个体的甲亢易感性进行诊断的方法，它包括 步骤：
[0014] 检测该个体的GPR174基因、转录本和/或蛋白，并与正常的GPR174基因、转录本 和/或蛋白相比较，
[0015] 存在差异就表明该个体患甲亢的可能性高于正常人群。
[0016] 在另一优选例中，所述的方法中检测的是GPR174的基因或转录本，并与正常 GPR174核苷酸序列比较差异。
[0017] 在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性：
[0018] 367 位C-T;
[0019] 其中，核苷酸位置编号基于SEQID N0:1。
[0020] 在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在G蛋白偶联受体174 (GPR174)的单核苷酸多态变异的方法，包括步骤：
[0021] (a)用GPR174基因特异性引物扩增样品的GPR174基因，得到扩增产物；
[0022]和
[0023] (b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：
[0024] 367 位C-T;
[0025] 其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO: 1。
[0026] 在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQID N0:2和3的序列。
[0027] 在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100_2000bp、优选为150_1500bp、更 佳地为200-1000bp，且含有SEQIDNO: 1中第367位。
[0028] 在本发明的第三方面，提供了一种用于辅助诊断甲亢或检测甲亢易感性甲亢的试 剂盒，它包括特异性扩增GPR174基因或转录本的引物，更佳地，所述的引物扩增出长度为 100-2000bp，且含有SEQIDNO: 1中第367位的扩增产物。
[0029] 在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：
[0030] (a)与SEQIDNO: 1中第367位的突变结合的探针；
[0031] (b)识别SEQIDNO: 1中第367位的突变的限制性内切酶。
[0032] 在另一优选例中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：
[0033] 367 位C-T;
[0034] 其中，核苷酸位置编号基于SEQID N0:1。
[0035] 本发明还涉及能特异性扩增GPR174基因或转录本、且所扩增的产物含有SEQID NO:1的第367位的引物在制备用于辅助诊断甲亢或检测甲亢易感性的试剂盒中的应用。
[0036] 在一个【具体实施方式】中，所述引物扩增出的产物长度为100_2000bp，优选为 150-1500bp，更佳地为 200-1000bp，更佳为 200-800bp。
[0037] 在一个【具体实施方式】中，所述试剂盒还含有：
[0038] (a)与SEQIDNO: 1中第367位的突变结合的探针；
[0039] (b)识别SEQIDNO: 1中第367位的突变的限制性内切酶。
[0040] 在一个【具体实施方式】中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：
[0041] 367 位C-T;
[0042] 其中，核苷酸位置编号基于SEQID N0:1。
【具体实施方式】
[0043] 本发明人经过深入而广泛的研究，对遍布X染色体上大量SNPs进行了测定和分 析。首次发现和证明了GPR174的基因组序列与甲亢密切相关，其中关联研究结果显示，在 GPR174的SEQIDNO: 1中第367位的SNP(367位C-T)(记为RS3827440)在对照组和病 例组中的分布存在显著性差异（P〈〇. 05)，因此可作为辅助性检测甲亢（或其易感性）的特 异性SNP。在此基础上完成了本发明。
[0044]G蛋白偶联受体 174(Gprotein-coupledreceptorl74,GPR174)基因位于染色 体Xq21. 1区域，由一个编码333个氨基酸的外显子组成，这个基因属于GPCR超家族，被归 为GPCR1类基因家族。GPCR超家族是跨膜蛋白，共同特点是有7个a-螺旋的跨膜区，在细 胞信号传导中起重要作用。至今已发现超过50%的药物的作用靶点都是GPCRs。最近，有研 究发现LysoPS是GPR174的配体。在体内，LysoPS是由免疫系统分泌，作为一个脂类介质 调控体内免疫进程。LysoPS与GPR174结合后可以刺激细胞外cAMP浓度的增加，并且这种 刺激作用是剂量依赖的。研究也发现，引起cAMP水平增高或者cAMP的类似物都会阻止体 内Thl类细胞因子的产生，但是Th2因子的产生不受影响，甚至提高。通常认为⑶是一种 以Th2类反应为主导的疾病。因此，cAMP水平增高导致的Th2类反应占主导有可能参与了 ⑶的病理过程。
[0045] 我们的研究显示易感等位基因导致GPR174基因表达水平的提高，而GPR174基因 表达水平的提高有可能导致胞外cAMP浓度的增高。我们的表达谱结果分析显示GPR174基 因广泛的表达于免疫相关的组织，并且在甲状腺中也有一定量的表达。这种表达模式提示 GPR174基因可能参与免疫过程，并且与甲状腺的结构或者功能有一定的联系，有可能在GD 的发病过程中起重要作用。
[0046] 本发明人通过对分布于整条X染色体的SNPs在中国人群中进行了关联分析，发现 GPR174基因上的rs3827440(SEQIDN0:1中367位C-T)与甲亢的易感性相关。rs3827440 是GPR174基因编码区的第519位C-T变异，造成第162位氨基酸由脯氨酸转变为丝氨酸 (P162S)。另外对GPR174基因中的整个外显子区域进行了测序，发现了许多频率较低的SNP 也与甲亢易感性相关。以rs3827440对甲亢的遗传贡献率最大。
[0047] 具体而言，本发明揭示了GPR17