专利名称：肝癌细胞表达下调基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人肝癌相关基因及应用。更具体地，本发明涉及利用肝癌细胞中表达下调的肝癌相关基因来检测肿瘤易感性的方法和试剂盒。
背景技术：
恶性肿瘤的死亡率在我国仅次于心、脑血管疾病名列第二。在恶性肿瘤中肝癌的死亡率列在肺癌、胃癌之后居第三位。目前对肝癌缺乏有效的诊治手段。人们普遍认为癌的发生是一种多因子多步骤的复杂事件，是多种癌基因激活和抑癌基因失活的结果。
我国每年约有11万人死于肝癌，其中男性8万，女性3万，占全世界肝癌死亡人数的45％。我国肝癌高发的趋势十分严峻，这是由于我国有1.2亿HBV携带者。肝癌的分子生物学研究是近年迅速发展起来的一个新领域，它对肝癌的发生、发展及其与乙型肝炎病毒的关系等提供了新的材料。目前对肝癌的致癌基因、抑癌基因的发现，以及肝癌与HBV的感染等方面研究进展较快。
正常人体原癌基因和抑癌基因互相制约，控制细胞正常的增殖、分化，组织的再生和个体发育。癌症的发生很大一部分是由于病毒或化学致癌物的作用使原癌基因激活成为癌基因，以及抗癌基因失活，引起细胞生长失控而形成。癌的发生涉及多种因素，分多阶段形成，因此可能有多个癌相关基因在不同时期的激活或抑制。癌相关基因的激活或抑制，表现在与正常组织或细胞相比，基因的表达异常，出现表达量升高或降低，甚至基因结构发生突变。
由于癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤(如肝癌)，目前人们已越来越关注肿瘤的早期诊断和基因治疗。然而目前为止发现的肝癌相关基因的数量还很有限。
因此，本领域迫切需要开发研究新的癌症相关的和/或具有抑癌功能的人蛋白，以及相应的检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的肿瘤相关蛋白-人肝癌相关蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供利用肝癌相关基因检测肿瘤易感性的方法和试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种体外检测待测细胞中肝癌相关基因表达水平是否下调的方法，它包括步骤(a)检测待测细胞中肝癌相关基因的表达水平，其中所述的肝癌相关基因是醛缩酶b；(b)将待测细胞中肝癌相关基因的表达水平与对照相比较，从而确定肝癌相关基因表达水平是否下调。
在另一优选例中，步骤(b)中判断下调的标准是肝癌相关基因的表达水平比正常人群中肝癌相关基因的表达水平低1.5-100倍。
在另一优选例中，步骤(b)中判断下调的标准是肝癌相关基因的表达水平比正常人群中肝癌相关基因的表达水平低3-50倍。
在另一优选例中，步骤(b)中判断下调的标准是肝癌相关基因的表达水平比正常人群中肝癌相关基因的表达水平低4-25倍。
在另一优选例中，步骤(a)中的待测细胞是肝细胞。
在另一优选例中，步骤(a)中的检测是通过核酸芯片检测法、半定量PCR法、定量PCR法、蛋白质芯片检测法、或抗原-抗体检测法进行。
在本发明的第二方面，提供了一种检测肿瘤易感性的试剂盒，它包括特异性扩增肝癌相关基因转录本的引物和说明书，所述的肝癌相关基因是醛缩酶b。
在另一优选例中，所述的引物具有SEQ ID NO9和10所示的序列。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的1-4对引物(i)Beclin1特异性引物，所述引物具有SEQ ID NO1和2所示的序列；(ii)Lis1特异性引物，所述引物具有SEQ ID NO3和4所示的序列；(iii)Pir51特异性引物，所述引物具有SEQ ID NO5和6所示的序列；(iv)RbAp48特异性引物，所述引物具有SEQ ID NO7和8所示的序列。
在另一优选例中，检测肿瘤易感性的试剂盒包括特异性结合于肝癌相关基因的表达产物的抗体和说明书，所述的肝癌相关基因是醛缩酶b。
在另一优选例中，检测肿瘤易感性的试剂盒包括检测肝癌相关基因的芯片和说明书，所述芯片选自下组(a)DNA芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样DNA，所述的点样DNA包括特异性结合于肝癌相关基因转录本的探针，所述的肝癌相关基因是醛缩酶b；(b)蛋白质芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样蛋白，所述的点样蛋白包括特异性结合于肝癌相关基因的表达产物的抗体，所述的肝癌相关基因是醛缩酶b。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了微矩阵杂交技术分析人肝癌组织与癌旁正常组织的基因表达差异。
图2显示了Beclin1，RbAp48，Aldolase b和Pir51四种基因在肝癌和癌旁正常组织中的表达检测。T为肝癌组织，N为癌旁正常组织。
图3显示了Beclin1，RbAp48，Aldolase b，和Pir51四种基因在肝癌细胞中的表达检测。
图4显示了Lis1基因在正常肝(N)，肝癌(K)和癌旁正常肝组织中(L)中的表达检测。膜上总RNA的量，分别为5μg/点，10μg/点，20μg/点。β-actin(β-肌动蛋白)基因的杂交结果为对照。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，新发现并分离了在肝癌中特异性低表达(甚至不表达)的肝癌相关基因-Aldolase b(醛缩酶b)，因此所述肝癌细胞表达下调基因可作为肝癌发生发展(尤其是早期诊断)的标记和基因治疗的靶标。
此外，本发明人还发现并分离了一组与肝癌相关基因及其编码的蛋白质，这一组基因(Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48)是在肝癌中特异性高表达，因此这些肝癌细胞表达上调基因也可作为肝癌发生发展(尤其是早期诊断)的标记和基因治疗的靶标。
具体而言，本发明涉及利用cDNA微矩阵技术筛选正常肝和肝癌中表达差异基因，获得了8400个基因的表达图谱。把正常肝组织和肝癌组织的基因表达谱进行对比，通过比较分析发现有256个基因表达上调，267个基因表达下调，这些基因的表达上调或下调都大于4倍。本发明中公开了5个经鉴定的基因在40％以上样品中表达有差异。这5个五个基因的差异表达百分率Lis1为40％，Beclin1为50％，RbAp48为50％，Pir51为60％，Aldolase b为70％。
本发明还采用Northern blot方法和RT-PCR方法检测上述基因在正常肝组织和肝癌组织中的表达。
在Northern blot方法中，先分离提取来源于同一病人的肝癌组织和癌旁的正常肝组织的总RNA，经含甲醛的1％琼脂糖电泳分离后，转移到尼龙膜上并固定，然后用基因的特异片段制备探针杂交，根据杂交信号确定基因的表达强弱。
结果显示Beclin1和RbAp48在50％以上所选肿瘤样品中表达水平显著上升，而正常肝组织中检测不到；Aldolase b在70％所选肿瘤样品中，其表达水平显著降低。
在RT-PCR检测方法中，先将分离制备的总RNA反转录合成cDNA，然后用我们表1提供的基因特异的引物，进行半定量PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，比较电泳条带的强弱，确定基因表达产物的高低。
结果显示，pir51基因在60％所选肿瘤样品中表达上调。Lis1基因在70％所选肿瘤样品中表达上调。
本发明人还在6种肝癌细胞系L02、Bel-7402、Bel-7404、SMMC-7721、HepG2、Huh7中用RT-PCR及Northern blotting杂交方法检测5种基因的表达情况。
结果发现Lis1在6种细胞中都有表达；Beclin1在L02，Bel-7402，HepG2，SMMC-7721中表达，在Bel-7404，Huh7中不表达；Pir51在L02，Bel-7402，Bel-7404，SMMC-7721，HepG2中表达；RbAp48在L02，Bel-7404，Huh7，HepG2，Bel-7402细胞中表达；而Aldolase b只在HepG2细胞中有微弱表达，其它肝癌细胞中不表达。这些结果与组织样品中的检测结果是吻合的。
因此，Aldolase b(醛缩酶b)是在肝癌中特异性低表达(甚至不表达)的肝癌相关基因，Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48是在肝癌中特异性高表达的肝癌相关基因。
定义如本文所用，术语“本发明的肝癌相关基因”指在肝癌中表达下调的醛缩酶b(Aldolase b)基因。有时，该术语还包括在肝癌中表达上调的Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48基因。
如本文所用，术语“本发明的肝癌相关蛋白”指在肝癌中表达下调的醛缩酶b(Aldolase b)蛋白。有时，该术语还包括在肝癌中表达上调的Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48蛋白。
如本文所用，“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。除非另外说明，该术语已包括能够与天然核苷酸类似方式发挥作用的天然核苷酸的类似物。
“亚序列”指含有更长序列核酸中一部分核酸的核酸序列。
“探针”或“核酸探针”指一种或多种核酸片断的集合，可检测它们与靶目标的杂交。探针被如下所述的标记，使得可检测它与靶目标的结合。探针是用一种或多种特定部分的基因组制备的，例如一种或多种克隆分离的完整染色体或染色体片断或聚合酶链反应(PCR)产物。探针可以用某种方式进行加工，例如通过封闭或去除重复的核酸或富含独特的核酸。因此术语“探针”不仅指可检测的核酸，还指应用于靶目标的可检测核酸。
“杂交”指通过互补碱基的配对而使两个单链核酸结合在一起。
“基本结合于”或“特异结合”或“选择性结合”或“特异性杂交于”，指在寡核苷酸和靶序列之间的互补杂交反应，并可包括微小的错配，这些错配可通过降低杂交介质的严紧度来实现检测所需靶多核苷酸序列。该术语还指在严紧条件下，一分子结合、复合或杂交与特定核苷酸序列，当该序列存在于复合的混合物中(如总细胞NDA或RNA)时。术语“严紧条件”指探针杂交于靶定亚序列而不杂交于其他序列的条件。严紧条件是依赖于序列的，并且在不同情况下是不同的。较长的序列可在更高的温度下特异性杂交。通常，选定的严紧条件是比在限定的离子强度和pH下推定序列的热解链温度(Tm)低约5℃。该Tm是在达到平衡时，有约50％与靶序列互补的探针与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。通常，对于短探针而言，严紧条件是这样的条件，其中盐浓度至少约0.02Na离子浓度(或其他盐)，pH7.0-8.3，且温度至少约60℃。严紧条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺而实现。
本领域的技术人员会理解，此处所述的具体探针的确切序列可以被一定程度地修改(修饰)，以产生与所公开的探针“基本相同”但保留基本结合于靶序列能力的探针。这些修改被本文各探针所覆盖。术语多核苷酸的“基本相同”指，与参照序列相比，一个序列有至少90％，更佳地至少95％序列相同性。
两个核苷酸序列被认为“相同”，如果以最大对应性排列时，两个序列中的核苷酸序列是相同的。如本文所用，术语“互补”指互补序列与参照序列的全部或一部分是序列的。
两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较，通常是将两个序列的序列在“比较窗”范围内进行比较，以鉴别和比较局部区域的序列相同性。如本文所用，“比较窗”指至少约20个邻接位置，通常约50-200，更通常约为100-150个邻接位置，其中在两个序列被最佳排列后，将一个序列与具有相同数目邻接位点的参照序列进行比较。
“序列相同性百分比”的确定，是通过将两个最佳排列的序列在比较窗内进行比较而得出的。其中与参照序列(不含有插入或缺失)相比，为了获得两个序列的最佳排列，在比较窗中的多核苷酸序列可含有插入或缺失(即缺口)。百分比的计算如下通过确定在两个序列中相同核酸碱基或氨基酸残基的数目，得到匹配位置的数目。然后将匹配位置数目除以比较窗中位置数目的总数，并将结果乘以100％，从而得到序列相同性百分比。
另一种表明核苷酸序列是基本相同的方法，是判断两个分子是否在严紧条件下杂交于同一序列。严紧条件是依赖于序列的，并且在不同情况下是不同的。
标记物标记核酸探针的方法是本领域技术人员熟知的。优选的探针是适用于原位杂交的探针。在杂交反应之前，核酸探针可以被可检测地标记。或者，使用结合于杂交产物的可检测标记物。这些可检测标记物是本领域熟知的，并且包括任何具有可检测的物理或化学性质的物质。
如本文所用，“标记物”是任何一种可通过光谱法、光电法、生物化学法、免疫化学法、或化学法检测的物质。可用于本发明的标记物包括放射性标记物(如32P，125I，14C，3H，35S)，荧光染料(如荧光素、罗丹明)，电子致密试剂(如)金，酶(如ELISA中常用的酶)，比色标记(如胶体金)，磁标记(如DynabeadsTM)等。不直接检测但可通过使用直接检测标记物而被检测的标记物例子，包括生物素、地高辛、以及已有标记抗血清或单抗的半抗原和蛋白质。
使用具体的标记物对于本发明而言并不重要，然而优选是的荧光标记物(如荧光素-12-dUTP等)。
如本文所用，直接标记的探针是附着有可检测标记物的探针。因为直接标记物已附着在探针上，因此随后不需要步骤将探针与可检测标记物关联起来。与之相反，间接标记的探针是携带随后(通常在探针与靶核酸杂交后)能结合可检测标记物的分子的探针。
此外，探针应能检测尽可能低的拷贝数，从而使分析的灵敏度最高，同时又能高于背景信号。最后，必需选择可提供高局部信号的探针，从而在将染色结果与染色体进行物理定位时可提供高空间分辨率，可用本领域技术人员已知的各种方法，将标记物偶联于探针。在优选例子中，核酸探针是用缺口翻译或随机引物延伸法标记的。
本领域技术人员会理解，本发明的探针没有必要对肝癌相关基因绝对特异。相反，探针是用于产生“染色反差”的。“反差”是由在基因组靶区域中探针浓度与基因组其他区域中探针浓度之比确定的。
如上所述，检测到肝癌相关基因的扩增是多种癌症存在与否以及预后的标志，尤其是肝癌。
在优选实施例中，通过将本发明的探针与靶核酸(如染色体样品)的杂交来检测肝癌相关基因的扩增。合适的杂交方式是本领域技术人员已知的，包括(但并不限于)各种Northern印迹法、原位杂交和定量扩增方法(如定量PCR和半定量PCR)。
在一优选例中，肝癌相关基因扩增是通过原位杂交鉴别的。通常，原位杂交包括下列主要步骤(1)固定待分析的组织或生物结构；(2)对生物结构进行预杂交以增加靶DNA的可接近性(acessibility)，并减少非特异性结合；(3)将核酸混合物与生物结构或组织中的核酸进行杂交；(4)进行杂交后的洗涤以去除在杂交反应中未杂交的核酸；和(5)检测杂交的核酸片段。根据具体应用，用于每一步骤的试剂及使用条件可以变化。
用于检测的样品的例子包括来自肿瘤的少量活检样品，尤其是肝细胞和肝组织。
在Northern印迹法中，逆转录的cDNA与对靶区域特异的探针杂交。将来自针对靶区域的探针的杂交信号强度，与对照信号强度进行比较，从而提供靶核酸的相对拷贝数的估测值。
检测方法用于检测某一基因在待测细胞中表达量的方法是本领域中已知的。代表性的例子包括Northern杂交、定量和半定量PCT(包括RT-PCR)、DNA芯片检测法、蛋白质芯片检测法、抗原-抗体检测法(如ELISA法)。此外，也可使用原位杂交法。上述这些方法都可用于本发明。相关的仪器和试剂可以购自Sigma等公司。
肝癌相关基因的核酸、蛋白和抗体基于本发明所揭示的肝癌相关基因与肝癌的相关性以及肝癌相关基因的序列信息，利用本领域的常规技术来产生肝癌相关蛋白或片段，并用相应的肝癌相关蛋白或片段来产生抗肝癌相关基因的抗体。
本发明的人肝癌相关基因(Aldolase b、Beclin1、Lis1、Pir51、和RbAp48)都是在本发明之前的已知蛋白，其基本信息如下所示
Aldolase b是葡萄糖和果糖代谢的关键酶，是肝脏特异表达的基因。
Beclin1是一个Bcl-2结合蛋白，在乳腺癌与卵巢癌中表达缺失，可能是乳腺癌的一个抑癌基因。另外，Beclin1在神经细胞中过量表达，可以抑制Sindbis病毒的复制，降低中枢神经系统的凋亡。
Lis1基因据报道与人无脑回综合症I的发生有关。Lis1蛋白在进化过程中高度保守，含有7个WD重复序列，可以介导蛋白与蛋白的相互作用。Lis1是血小板活化因子乙酰基水解酶的一个亚基。另外，Lis1也与微管蛋白(tubulin)结合直接影响微管的运动。过量表达Lis1可以通过影响纺锤体与染色体的结合进而影响细胞分裂。
Pir51是人Rad51重组酶的结合蛋白。真核细胞的Rad51蛋白在同源重组中起到很重要的作用，对细胞的增殖也是必须的。Pir51与Rad51结合来调节Rad51的功能。
RbAp48是一个Rb结合蛋白。RbAp48还是染色质组装因子的一个亚基，又是组蛋白去乙酰基酶复合物的一个成员。RbAp48还与CREB结合。RbAp48的功能非常复杂，目前为止，了解的还不是很清楚。
本发明的人肝癌相关基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
另一方面，本发明还包括对人肝癌相关基因DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人肝癌相关基因基因产物或片段。较佳地，指那些能与人肝癌相关基因基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人肝癌相关蛋白的分子，也包括那些并不影响人肝癌相关蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人肝癌相关基因基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人肝癌相关基因基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人肝癌相关基因或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人肝癌相关基因功能的抗体以及不影响人肝癌相关基因功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人肝癌相关基因基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人肝癌相关基因基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
基于特异性的抗肝癌相关蛋白抗体，本发明还提供了一种检测肿瘤或肿瘤易感性的方法，它包括步骤在适合形成抗体复合物的条件下，将含有特异性抗Aldolase b的抗体与待测个体的DNA样品进行接触；和检测形成的抗体复合物数量是否低于正常对照，其中形成的抗体复合物数量低于正常对照就表示该个体患有肿瘤或肿瘤易感性高于正常人群。
此外，该方法还可与在肝癌中表达上调的其他肝癌相关基因(如Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48)的检测相结合，例如在适合形成抗体复合物的条件下，将含有特异性抗肝癌相关蛋白(Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48)的抗体与待测个体的DNA样品进行接触；和检测形成的抗体复合物数量是否高于正常对照，其中形成的抗体复合物数量高于正常对照就表示该个体患有肿瘤或肿瘤易感性高于正常人群。
试剂盒本发明还提供了诊断肝癌相关基因异常的诊断试剂盒。在优选例中，一种试剂盒包括一种或多种针对肝癌相关基因的探针。该试剂盒还可含有封闭探针以及描述如何使用试剂盒来检测肝癌相关基因的说明材料。试剂盒还可含有下组中的一种或多种用于协助检测探针的各种标记物或标记试剂；用于杂交的试剂(包括缓冲液等)；以及阳性和阴性杂交对照等。
另一种优选的检测肿瘤易感性的试剂盒包括特异性扩增肝癌相关基因转录本的引物和说明书，所述的肝癌相关基因是Aldolase b。
另一种优选的检测肿瘤易感性的试剂盒包括特异性结合于肝癌相关基因的表达产物的抗体和说明书，所述的肝癌相关基因是Aldolase b。
另一种优选的检测肿瘤易感性的试剂盒包括检测肝癌相关基因的芯片和说明书，所述芯片选自下组(a)DNA芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样DNA，所述的点样DNA包括特异性结合于肝癌相关基因转录本的探针，所述的肝癌相关基因是Aldolase b；(b)蛋白质芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样蛋白，所述的点样蛋白包括特异性结合于肝癌相关基因的表达产物的抗体，所述的肝癌相关基因是Aldolase b。
此外，在上述各试剂盒中，都可额外地含有其他肿瘤相关因子(尤其是Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48)的特异性探针、或特异性抗体。
本发明的主要优点在于本发明首次发现了新的肝癌相关基因，不仅填补了检测的盲区，而且这些这些肝癌相关基因可作为肝癌诊断，基因治疗，药物治疗的靶点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1建立肝癌和癌旁正常肝组织的基因差异表达谱。
取在液氮中保存的肝癌和癌旁正常肝组织，按常规方法分离和提取总RNA。RNA的抽提用Trizol试剂(Life Teclonlogies，Inc，N.Y.，USA)。每50-100mg组织样品，加入1ml Trizol，匀浆，室温放置5分钟；然后，加入0.2ml氯仿，剧烈振荡，充分混匀，室温静置2-3分钟；12,000g，4℃离心15分钟；吸取上清于另一Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10分钟。12,000g，4℃离心收集总RNA，沉淀用75％乙醇洗涤一次，抽干，溶于无菌水中。总RNA经变性甲醛琼脂糖电泳检查无降价后，用于mRNA的制备。一次反应用200ug总RNA分离制备mRNA，mRNA的分离采用Oligotex mRNA minkit(Qiagen，Hilden，Germany)试剂盒。
cDNA微阵列采用LifeGrid 1.0微阵列膜购自Incyte Genomic公司，该膜含有约8千4百个cDNA的PCR产物和27个对照，按双点模式，印在一个12×22cm的尼龙膜上。来自肝癌和癌旁正常肝组织的mRNA分别在a-33P dCTP存在的条件下，用逆转录生成33P-标记的cDNA探针。标记掺入百分比不小于40％。每个cDNA探针与微阵列杂交的条件见LifeGrid 1.0微阵列的说明书。杂交过夜后的膜，室温晾干，由磷屏仪(Phosphor image)曝光并扫描，扫描结果即杂交信号的计算机分析解读由Incyte公司完成。
根据Incyte公司提供的计算机分析结果，获得了肝癌和癌旁正常肝组织8400个基因的表达图谱(图1)。把正常肝组织和肝癌组织的基因表达谱进行对比，去除在正常肝组织和肝癌组织中都表达缺失的基因，去除相同cDNA两个点差异大于2.5倍和一个点不到背景2倍的基因。最后，在正常肝组织和肝癌组织中，检测到有6542个基因表达。通过比较分析发现在肝癌中有256个基因表达上调，267个表达下调，这些表达上调或下调基因都是指大于4倍的表达差异。从这些表达差异的基因中，选择与细胞分裂、基因表达调控、信号传导、代谢等有关的基因进行验证。Beclin1，Lis1，Pir51，RbAp48，Aldolase b是在肝癌中高表达或低表达5个基因。
实施例2Beclin1，RbAp48，Aldolase b和Pir51四种基因在肝癌和癌旁正常组织中的表达检测按实施例1的方法制备总RNA，用SuperscripII反转录酶(Life TechonlogiesInc，N.Y.，USA)制备cDNA，反转录条件按试剂盒说明，在20ul反应混合物中加入3ug总RNA。然后进行PCR扩增。根据表1提供的引物，按表1所列的条件进行PCR扩增，获得相应基因的片段。
(a)Northern印迹分析同位素α-32P-dCTP标记基因的片段作为探针，进行Northern印迹分析每个泳道约15ug来自肝癌组织或癌旁正常组织的总RNA经含甲醛的1％琼脂糖凝胶电泳分离，然后转移到Hybond-N+尼龙膜上(Amersham Pharmacia Biotech)。80℃，烤膜1小时，使RNA固定在膜上。在ExpressHyb杂交液(ClonTechInc，California，USA)中，68℃杂交3小时。用含0.1％SDS的2×SSC，室温下洗膜一次，然后用含0.1％SDS的0.1×SSC，68度洗膜两次，每次20分钟，最后压片1到6天，-80℃，放射自显影。Northern blot的具体操作见Sambrook等人所著’分子克隆’实验室手册。
检测结果见图2，Beclin1、RbAp48和Aldolase b的检测是采用Northern blot的方法，pir51的表达水平太低，采用PT-PCR的方法。Beclin1和RbAp48在肿瘤样品中表达水平显著上升，而正常肝组织中检测不到；Aldolase b在70％所选肿瘤样品中，其表达水平显著降低。
(b)RT-PCR检测方法首先将分离制备的总RNA反转录合成cDNA，然后用我们表1提供的基因特异的引物，进行半定量PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，比较电泳条带的强弱，确定基因表达产物的高低。
结果显示，pir51基因在60％所选肿瘤样品中表达上调。
实施例3Beclin1，RbAp48，Aldolase b，和Pir51四种基因在肝癌细胞中的表达检测用与实施例2相同的RT-PCR方法检测了6种肝细胞系(L02，Bel-7404，SMMC-7721，Bel-7402，HuH7，HepG2)中Beclin1，RbAp48，pir51及Aldolase b的表达。
结果发现Beclin1在L02，Bel-7402，HepG2，SMMC-7721四种细胞中表达，在Bel-7404，Huh7二种细胞中不表达；RbAp48在L02，Bel-7404，Huh7，HepG2，Bel-7402五种细胞中表达，在SMMC-7721细胞中不表达；Pir51在L02，Bel-7402，Bel-7404，SMMC-7721，HepG2五种细胞中都表达，在HuH7细胞中不表达；而Aldolase b只在HepG2细胞中有微弱表达，其它肝癌细胞中不表达。这个结果与组织样品中的检测结果是吻合的，即Beclin1，RbAp48和Pir51在大部分肝癌细胞中表达，而Aldolase b在大部分肝癌细胞中不表达或低表达(图3)。
实施例4Lis1基因在肝癌和癌旁组织中的表达检测我们采用Northern点印迹法检测Lis1基因在肝癌和癌旁组织中的表达。按实施例1的方法制备总RNA，将各种来源的总RNA分别以每点5μg，10μg，20μg的量点在Hybond-N+尼龙膜上(Amersham Pharmacia Biotech)。80℃，烤膜1小时，使RNA固定在膜上。在ExpressHyb杂交液(ClonTech Inc，California，USA)中，68℃杂交3小时。用含0.1％SDS的2×SSC，室温下洗膜一次，然后用含0.1％SDS的0.1×SSC，68度洗膜两次，每次20分钟，最后压片1到3天，-80℃，放射自显影。Northern Dot Blot的具体操作见Sambrook等人所著的《分子克隆实验室手册》。
实验结果显示Lis1基因在肝癌组织中表达上调，正常肝组织和癌旁组织中不表达或低表达(图4)。
实施例5肝癌易感性检测试剂盒制备一试剂盒，它含有名称 Beclin1引物 浓度正向引物 SEQ ID NO1 干粉20D反向引物 SEQ ID NO2 干粉20DPCR反应液 含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液实施例6肝癌易感性检测试剂盒制备一试剂盒，它含有名称 Lis1引物 浓度正向引物 SEQ ID NO3 干粉20D反向引物 SEQ ID NO4 干粉20DPCR反应液 含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液实施例7肝癌易感性检测试剂盒制备一试剂盒，它含有名称 Pir51引物 浓度正向引物 SEQ ID NO5 干粉20D反向引物 SEQ ID NO6 干粉20DPCR反应液 含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液实施例8肝癌易感性检测试剂盒制备一试剂盒，它含有名称 RbAp48引物浓度正向引物 SEQ ID NO7 干粉20D
反向引物 SEQ ID NO8 干粉20DPCR反应液 含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液实施例9多检测因子的肝癌易感性检测试剂盒制备一试剂盒，它含有名称 Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48的引物 浓度正向引物 SEQ ID NO1，3，5，7 各干粉20D反向引物 SEQ ID NO2，4，6，8 各干粉20DPCR反应液 含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液实施例10肝癌易感性检测试剂盒制备一试剂盒，它含有名称 Aldolase b的引物 浓度正向引物 SEQ ID NO9 干粉20D反向引物 SEQ ID NO10 干粉20DPCR反应液 含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液取待检测男性病人的少量肝细胞，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从肝细胞中提取mRNA，反转录成cDNA。将实施例5-9肝癌检测试剂盒中的PCR引物稀释到1μmol/μl，以所获得的cDNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，比较电泳条带的强弱，确定基因表达产物的高低。
检测结果，Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48表达量上调以及Aldolase b表达量下调表示肝癌易感性高于正常人群。
实施例11多检测因子的肝癌易感性检测试剂盒制备一试剂盒，它含有名称 Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48浓度和Aldolase b的引物正向引物 SEQ ID NO1，3，5，7，9各干粉20D反向引物 SEQ ID NO2，4，6，8，10 各干粉20DPCR反应液 含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>肝癌细胞表达下调基因及其应用<130>035913<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1cttaccacag cccaggcgaa ac22<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>12cttagaagca ttgcggtgga cgatg 2权利要求
1.一种体外检测待测细胞中肝癌相关基因表达水平是否下调的方法，其特征在于，它包括步骤(a)检测待测细胞中肝癌相关基因的表达水平，其中所述的肝癌相关基因是醛缩酶b；(b)将待测细胞中肝癌相关基因的表达水平与对照相比较，从而确定肝癌相关基因表达水平是否下调。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中判断下调的标准是肝癌相关基因的表达水平比正常人群中肝癌相关基因的表达水平低1.5-100倍。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中判断下调的标准是肝癌相关基因的表达水平比正常人群中肝癌相关基因的表达水平低3-50倍。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的待测细胞是肝细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的检测是通过核酸芯片检测法、半定量PCR法、定量PCR法、蛋白质芯片检测法、或抗原-抗体检测法进行。
6.一种检测肿瘤易感性的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增肝癌相关基因转录本的引物和说明书，所述的肝癌相关基因是醛缩酶b。
7.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO9和10所示的序列。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有选自下组的1-4对引物(i)Beclin 1特异性引物，所述引物具有SEQ ID NO1和2所示的序列；(ii)Lis 1特异性引物，所述引物具有SEQ ID NO3和4所示的序列；(iii)Pir51特异性引物，所述引物具有SEQ ID NO5和6所示的序列；(iv)RbAp48特异性引物，所述引物具有SEQ ID NO7和8所示的序列。
9.一种检测肿瘤易感性的试剂盒，其特征在于，它包括特异性结合于肝癌相关基因的表达产物的抗体和说明书，所述的肝癌相关基因是醛缩酶b。
10.一种检测肿瘤易感性的试剂盒，其特征在于，它包括检测肝癌相关基因的芯片和说明书，所述芯片选自下组(a)DNA芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样DNA，所述的点样DNA包括特异性结合于肝癌相关基因转录本的探针，所述的肝癌相关基因是醛缩酶b；(b)蛋白质芯片，所述芯片具有基片和点样于基片上点样区的点样蛋白，所述的点样蛋白包括特异性结合于肝癌相关基因的表达产物的抗体，所述的肝癌相关基因是醛缩酶b。
全文摘要
本发明提供了一种对个体的肿瘤(如肝癌)易感性进行诊断的方法它包括步骤检测该个体的肝癌相关基因的表达水平，并与正常人群中肝癌相关基因的表达水平相比较，存在差异就表明该个体患肿瘤的可能性高于正常人群，其中所述的肝癌相关基因是醛缩酶b，所述的差异是表达下调。本发明还提供了相应的检测试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK1635143SQ200310124559
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月31日 优先权日2003年12月31日
发明者赵慕钧, 宋海, 夏双络, 王冀飞, 李载平 申请人:中国科学院上海生命科学研究院