专利名称：促红细胞生成素基因的克隆及其表达细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说涉及一种编码中国人的EPO基因组DNA，以及将中国人的促红细胞生成素基因转移到BHK细胞中和能够生产有生物活性的多肽促红细胞生成素的哺乳动物细胞系。
促红细胞生成素(Erythropoietin.EPO)是由肾脏产生的一种酸性糖蛋白类激素，作用于造血干细胞，促进红细胞的生成。1985年EPO基因已被克隆，国内外许多学者都进行了EPO表达的研究。所用的材料涉及EPO的cDNA、基因组基因以及EPO基因的PCR产物。表达载体所用的启动子有SV40及Ad-MLP等。所选用的细胞系有淋巴母细胞、CHO dhfr缺陷型细胞和COS-7细胞等。表达量从数十个毫单位每毫升细胞增减液到几千单位不等。肾脏疾病会引起促红细胞生成素合成不足，从而引起贫血。用基因工程方法从培养的细胞系中生产的重组的促红细胞生成素，可以用来治疗多种贫血疾病。如慢性肾功能性贫血、癌症病人放化疗后引起的贫血、以及手术后贫血的恢复等。经临床证实其疗效确实可靠，并基本上没有副作用因此具有非常好的应用前景。关于促红细胞生成素生产国内外已有多项专利申请，内容涉及EPO的基因、对EPO的基因的改造、以及在dhfr缺陷型CHO细胞表达EPO的方法等。
本发明的目的在于提供了一种用于定向筛选目的基因的基因文库的构建方法，并从这一文库中克隆了中国人EPO的基因组基因以及通过本发明构建了EPO表达细胞系；该细胞系可以用于生产，提取到有生物活性的促红细胞生成素，应用于临床，治疗各种贫血疾病。建立了利用非dhfr缺陷型细胞表达EPO基因的方法，可解决生产上缺陷型细胞较难培养的困难。
本发明的内容1 构建了基因组不完全文库，进行定向筛选，使EPO基因在文库中得以富集，顺利的获得了包括5′-调控成分及3′-侧翼序列12.5Kb长的中国人EPO基因组基因。见
图1。在EPO基因的编码区发现有两个核苷酸的差异，在第90位的核苷酸处有一个G的缺失，在第一个内含子666位的核苷酸处有一个C的插入。其序列详见表1。这两个核苷酸的差异改变了5′-调控区的ORF。表2列举了这4个ORF。
2 构建了在非dhfr缺陷型细胞中表达的EPO表达载体。
(1)将2.4Kb的EPO基因编码区插入到质粒pRSV/CAT中，构建了G418抗性的表达载体pRSV/EPO。这一载体带有RSV-LTR的启动子及SV40的一个内含子，可进行诱导表达。
(2)为了能在BHK细胞中进行加压培养，构建了带有潮霉素-B抗性基因和二氢叶酸还原酶基因(dhfr)的表达载体pHY/dhfr。通过与pRSV/EPO共转染，经潮霉素-B和G418双抗性筛选，可获得既表达EPO又表达dhfr的细胞株，在MTX的压力下可提高EPO的表达量。
3 EPO高效稳定表达细胞株的克隆。
用表达载体pRSV/EPO经脂质体法转染BHK细胞，经G418抗性筛选，获得了表达量为180单位/106细胞的克隆B8细胞株。对该细胞株进行第二次转染，将pHY/dhfr质粒导入细胞，经潮霉素-B筛选后，在MXT压力下，获得了表达量为1600单位/106细胞的克隆B812细胞株，该细胞株已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记注册编号为CGMCC NO.0306。这一细胞株经高密度培养，可获得超过20000单位/毫升的产量。即可以从每升细胞培养液中得到超过200毫克的名义产量。
本发明的优点1 克隆了中国人EPO基因，用基因组基因做表达比cDNA的表达量高。
2 构建的表达载体pRSV/EPO是在充分考虑了EPO基因的转录起始效率、内含子的拼接、5′-非翻译区和3′-非翻译区对表达效率的影响等因素，为高效表达提供了基础。
3 设计了pHY/dhfr表达载体，为在非dhfr阴性细胞中用MTX加压培养提供了基础。
4 获得了高效表达细胞株，表达量为1600单位/106细胞，在高密度培养时可获得超过200mg/升的产量。
用下面的实施例对本发明做进一步说明。
1 不完全文库的构建从一个中国人提供的血液中分离白细胞，提取基因组DNA，片断长度控制在100Kb以上，用BamHI进行完全酶切，回收10.5Kb的片断，纯化后，与入-EMBL3的BamHI臂相连接，用包装提取物进行体外包装，构建了中国人基因组不完全基因文库。文库效价为3×105从这人基因文库中可以定向筛选EPO基因。由于用BamHI对基因组DNA进行完全酶切，可以使EPO基因在文库中得以富集。
2 表达载体的构建质粒pRSV/CAT(购于Stratagene公司)，经Not I酶切去掉CAT基因，将EPO基因的2.4Kb片断与载体进行平端连接。连接反应条件载体与外源片断的摩尔比为1∶10，16℃连接过夜，取5μl转化大肠杆菌DH5α受体菌，用原位杂交的方法筛选阳性菌落，获重组质粒，经酶切鉴定方向及系列酶切分析，获得了重组的表达载体pRSV/CAT。选取带有dhfr基因的质粒pMT010/A+与带有潮霉素-B抗性基因的质粒p3′SS(购于Srtatagene公司)组建了表达载体pHY/dhfr。p3′SS用Bg1II和EcoR V双酶切，去掉1694的片断，pMT010/A+经Sal I酶切后用TDNA聚合酶于12℃20分钟补平，再用BgII切下900bp的dhfr基因，将dhfr基因与p3′SS的大片断以平-粘端的方式相连接，获重组质粒pHY/dhfr。
3 EPO高效稳定表达细胞株的克隆对培养的BHK细胞用脂质体(Lipofectin)方法转染表达载体pRSV/EPO，DNA的量为5μg，脂质体为20μl，加无血清MEM2ml，37℃6小时，换正常培养液，转染时细胞密度为30％，48小时后按1∶5的比例分细胞，用400mg/ml的G418筛选阳性细胞克隆，获得了表达量为180单位/106细胞的克隆B8细胞株。用pHY/dhfr质粒转染B8细胞，转染方法同前，经200mg/ml潮霉素-B筛选后，在MXT压力下，获得了表达量为1600单位/106细胞的克隆--B812细胞株。在高密度培养条件下，可获得超过200mg/升的产量。细胞系的培养条件37℃，5％的CO2浓度，细胞培养液为MEM培养液，10％的新生牛血清。高密度培养时使用无血清培养液。
图表说明表1中国人EPO基因全序列。
表2EPO基因的前4个ORF(小的开放阅读框)。
图1含有全长中国人EPO基因的克隆--λ-811的酶切图谱。
(1)左臂(2)右臂(3)EPO基因及其5′和3′侧翼(4)EPO基因图2EPO表达载体pRSV/EPO的图谱G418新霉素抗性基因RSV-LTRRSV的启动子intronSV40的内含子EPOEPO基因Amp氨苄青霉素抗性基因pASV40的多聚A区图3潮霉素-B抗性质粒pHY/dhfr的图谱dhfr二氢叶酸还原酶基因pSV40SV40的启动子pTKTK基因的启动子Hygromyc in潮霉素-B抗性基因TKpATK基因的多聚A区Amp氨苄青霉素抗性基因。
表1中国人EPO基因全序列。
示EPO基因的5个ORF
示EPO的编码序列gg ccc 示本基因与Lin FK的序列差异表2EPO基因的前4个ORF(小的开放阅读框)ORP1 80 ATG CCC CCC AGG GAA GTG TCC GGG AGC CCA GCC TTT CCC AGATAG(14aa)ORF2 201 ATG ACC CAC ACG CAC GTC TGC ACC CCC GCT CAC GCC GCG AGCCTC AAC CCA GGC GTC CTG CCC CYG CYC TGA(25aa)ORF3 293 ATG CAG ATA……AAA CCT GAC CTG TGA(163aa)ORF4 557 ATG AGG GCC CCC GGT GTG GTC ACC CGG CGC GCC CCA GGT CGCTGA (14aa)
权利要求
1.编码中国人的EPO基因组DNA，包括完整的编码区及5′和3′侧翼，在第90位的核苷酸处有一个G的缺失，在第一个内含子666位的核苷酸处有一个C的插入，这两个核苷酸的改变在5′调控区形成了4个以ATG起始的小开放阅读框架，该DNA的全序列如表1。
2.一种表达载体，它是由EPO基因的2.4Kb的编码区构建的如附图2所示的载体pRSV/EPO，它含有一个内含子，可以进行诱导表达。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征是如附图3所示的载体pHY/dhfr，是利用了B生基因进行筛选，与EPO表达载体pRSV/EPO共同使用，在非dhfr缺陷型细胞中表达EPO，并能通过MTX进行加压培养。
4.一种利用人的基因组DNA序列、构建表达载体、转染哺乳动物细胞系而能生产促红细胞生成素的细胞株，其特征在于该细胞是B812，保藏号为CGMCCNO.0306。
全文摘要
本发明涉及一种能够生产有生物活性的多肽促红细胞生成素的哺乳动物细胞系。利用基因工程技术从中国人白细胞中提取DNA，构建了基因文库，克隆了促红细胞生成素基因，通过特异的表达载体转染BHK细胞，获得了稳定高效生产促红细胞生成素的细胞克隆。本发明具有利用非dhfr缺陷型细胞生产促红细胞生成素的特点。
文档编号C12N15/85GK1168414SQ9711206
公开日1997年12月24日 申请日期1997年5月16日 优先权日1997年5月16日
发明者崔振中, 刘朋朋, 齐顺章, 沈恒, 陆廷夷, 张希 申请人:中国农业科大学