专利名称：：对表面表达有mcsp的细胞的细胞毒性的介导的制作方法
技术领域：
：本发明涉及癌症的诊断和治疗，特别涉及对肿瘤细胞的细胞毒性介导；更特别涉及使用癌症缓解性抗体(CDMAB)来启动细胞毒性反应，可根据情况选择与一种或多种化疗剂联合使用。本发明进一步涉及使用本发明CDMAB进行结合分析。
背景技术：
：许多开发针对人转移性黑色素瘤细胞系的抗体的研究人员们各自独立鉴定出黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)。他们发现有一些抗体能与黑色素瘤细胞表面的特定抗原发生反应。由于各自独立开发，靶抗原出现多种叫法，后来统一确定为MCSP。因此MCSP又称为高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、人黑色素瘤蛋白多糖(HMP)、黑色素瘤相关蛋白多糖抗原(MPG)和黑色素瘤硫酸软骨素蛋白多糖(mel-CSPG)，现己鉴定出MCSP是各种特定抗体的抗原，其中一些抗体会在下文阐述。还发现MCSP与大鼠蛋白多糖NG2之间的同源性达80%以上，所以MCSP又称为大鼠蛋白多糖NG2。MCSP是一种糖蛋白-蛋白多糖复合体，由一个250kDa的N连接糖蛋白和一个大于450kDa的蛋白多糖成分组成。核心糖蛋白以游离或硫酸软骨素修饰的形式存在于黑色素瘤细胞表面。由于成功克隆到MCSP，所以它的一些结构特征被鉴定出来，它有3个胞外域，共包含10个半胱氨酸(5个可能的二硫桥)、15个可能的N连接糖基化位点和11个潜在的硫酸软骨素连接位点。跨膜部分有1个半胱氨酸，其功能还不清楚。胞质域有3个苏氨酸残基，可能是蛋白激酶C进行磷酸化的位点，不过至今还未发现MCSP被磷酸化。已发现大多数恶性黑色素瘤中都表达有MCSP，最初认为它在正常细胞和其它类型的肿瘤上很少见。早先得出此结论的研究曾采用免疫组化技术(IHC)，用抗MCSP抗体B5检测经甲醛或甲醇固定的正常组织和肿瘤组织上MCSP的分布。这一研究发现，所检测的22例黑色素瘤和2例星形细胞瘤中与抗体B5发生反应的分别为17例和2例，而检测的23例癌症中无一发生反应。检测的22例正常组织中，发现B5只与皮肤角化细胞、肺泡上皮、毛细血管内皮结合。另一项研究是利用抗MCSP抗体9.2.27和冰冻组织切片检测MCSP的组织分布。再次发现检测的所有黑色素瘤组织和细胞系中都发生反应，而6例不同类型的癌肿瘤中均无反应。7例胎儿组织中只观察到皮肤内有反应，主动脉中有微弱反应，而成人组织中，13例组织中只看到3例有反应。后续研究是利用识别MCSP不同表位的抗MCSP抗体9.2.27、225.28S和A0122和冰冻组织来检测MCSP分布。研究发现，所有抗MCSP抗体的染色图谱近似，并且与神经、间充质、上皮来源的正常细胞和恶性肿瘤都发生反应而以前认为是MCSP阴性结果。尤其是，抗体B5与检测的24例器官中的各种上皮、结缔、神经和肌肉组织都发生反应，并且所检测的34例各种类型的肿瘤中有28例发生反应。研究者解释说，出现这种差异是由于他们使用的IHC技术经过了改进，变得更加稳定，他们注意到固定方法的选择非常重要，并且猜测，MCSP抗原的一个重要特征是对IHC技术中的方法歩骤很敏感。为搞清楚MCSP在超微结构水平的定位，研究者们又开展了进一步研究。借助电子显微镜的免疫定位研究证实，MCSP几乎专一性存在于黑色素瘤细胞表面的微区——微端丝中，而微端丝可能在细胞-细胞接触和细胞-基质粘连中发挥作用。1996年，MCSP被克隆出后，即以MCSPcDNA作探针，对肿瘤细胞系和正常人组织中分别表达的MCSP进行了northern印迹分析。所检测的8例不同肿瘤细胞系中，只在黑色素瘤细胞系中观察到MCSP表达而在所检测的16例正常成人和4例正常胎儿组织中未发现MCSP表逸MCSP在组织中定位的不同研究结果所表现出的这种不一致说明，可能还需要进一步研究以阐明该抗原真正的表达图谱，或者对报道结果之间的差异作出解释。因为已知蛋白多糖能介导细胞-细胞和细胞-胞外基质(ECM)间的相互作用，所以MCSP在这些过程中发挥的作用业已研究清楚。研究显示，MCSP能促进ci4卜整合素介导的粘连及黑色素细胞的扩散。还有研究指出，MCSP核心蛋白发出信号，诱导pl3(T"募集及酪氨酸磷酸化，从而可调节细胞粘连和运动，帮助肿瘤侵入和转移。综合这些研究成果可见，MCSP可通过激活整合素和激发细胞骨架重排路径来促进黑色素细胞粘连。研究还发现MCSP可能通过其硫酸软骨素成分与膜3型基质金属蛋白酶(MT3-MMP)建立某种联系。有研究暗示，体内黑色素瘤表达的MT3-MMP有可能促进正在生长的肿瘤附近的ECM蛋白的降解，从而为肿瘤提供扩张空间。所以，MT3-醒P与MCSP之间可能存在促进黑色素瘤侵入的激活步骤。使用抗MCSP抗体进行的体外分析试验也已陆续展开，以査明MCSP在肿瘤侵入和转移过程中所起的作用。抗体9.2.27被用来评价MCSP在不依赖锚定生长(anchorage-ind印endentgrowth)中所发挥的作用。黑色素瘤细胞在含抗体9.2.27的软琼脂中进行培养，结果显示形成的细胞克隆数量特异性减少67-74%。这些研究结果暗示，MCSP可能参与细胞间相互作用，使细胞不依赖锚定生长。上述研究作者还通过测定牛主动脉内皮(BAE)细胞基膜上黑色素瘤细胞M14粘连的试验来检测9.2.27对MCSP的抑制效果。该试验中，对9.2.27与单克隆抗体W6/32(针对所有I类组相容性抗原)对照的疗效进行比较。将M14对照细胞和经抗体预先处理的M14细胞铺在BAE细胞基膜上。结果显示，9.2.27处理的细胞中，27%的细胞粘连受到明显抑制，而W6/32处理的细胞中没有观察到显著影响。通过扫描电子显微术在超微结构水平上证实用9.2.27进行细胞预处理所获得的另一更显著作用是细胞扩散受到抑制。针对黑色素瘤细胞开发的、经证实能特异性识别MCSP的许多抗体己进行了体外和体内试验来确定其抗癌效果。单克隆抗体9.2.27识别MCSP的核心糖蛋白成分，是最早用于研究其肿瘤抑制特性的抗体之一。Bumol等人就9.2.27与9.2.27-白喉毒素A(DTA)结合物对裸鼠黑色素瘤的免疫治疗效果开展了研究。最先进行的是体外细胞毒性试验，该试验通过向蛋白中掺入[35S]蛋氨酸标记来检测9.2.27和9.2.27-DTA结合物对M21人黑色素瘤细胞中蛋白合成的影响。结果显示，9.2.27-DTA结合物能显著抑制M21黑色素瘤细胞的蛋白合成不过未结合的DTA产生的影响更大一些。而单使用9.2.27所产生的影响极小。另外，又对9.2.27和9.2.27-DTA结合物抗裸鼠中人黑色素瘤的效果进行了研究。将M21肿瘤碎块植入小鼠皮下，让其生长3天，然后在第3天用9.2.27或9.2.27-DTA结合物治疗小鼠，并每隔3天治疗一次。比较受治小鼠和未受治对照小鼠的肿瘤体积。第18天(数据报告的最后一天)，与未治疗对照相比，分别经9.2.27治疗和9.2.27-DTA结合物治疗的小鼠显示其肿瘤生长抑制率分别为64%和52%。在最初的这项研究中，作者得出结论说，9.2.27和9.2.27-DTA结合物对裸鼠中M21黑色素肿瘤生长的抑制效果大致相同。虽然这项最早的研究报告说9.2.27能抑制体内肿瘤生长，但后续研究(包括前一研究作者开展的后续研究)却证实裸露的9.2.27在体内没有任何抗肿瘤效果。总而言之，研究9.2.27对人肿瘤疗效的实验已证实，虽然9.2.27能耙向癌细胞，但用裸露的9.2.27治疗不产生抗癌活性。随后，预期用9.2.27免疫结合物治疗的研究中，尝试在I期临床试验中加大9.2.27的剂量。经流式细胞术和/或免疫过氧化物酶染色技术确定其肿瘤与9.2.27反应的8例恶性黑色素瘤患者接受每周2次、剂量按1、10、50、100和200mg逐渐递增的抗体静脉注射。虽然患者未出现明显毒性症状，而且9.2.27靶定在转移性黑色素瘤结上，但是并未观察到临床反应。再后面的研究是将9.2.27与化疗药物阿霉素(DXR)结合，然后研究该结合物对体内和体外黑色素瘤的生长抑制效果。利用[:iH]胸苷掺入试验，检测DXR-9.2.27结合物对M21细胞的生长抑制效果。结果显示，该结合物对靶细胞M21的生长呈现依赖特定剂量的抑制效果，对MCSP阴性对照细胞系没有效果。没有进行体外试验来检测单使用7.2.27的效果。为搞清楚DXR-9.2.27结合物在体内的作用，给小鼠皮下注射M21细胞，让肿瘤生长8-10天。第10天开始静脉注射结合物，并每隔3天注射一次，持续30天。最后只在经DXR-9.2.27结合物治疗的小鼠中看到明显的肿瘤生长抑制效果，而分别单独使用DXR和9.2.27没有显示对肿瘤生长的抑制结果；9.2.27和DXR的混合物同样显示阴性结果。另外，还开展了一项有关9.2.27结合物效果的研究。Schrappe等人将化疗剂4-去乙酰长春花碱-3-羧基酰肼(DAVLBHY)与9.2.27结合后检测其对人神经胶质瘤的作用。向裸鼠皮下注射U87MG(人神经胶质瘤细胞系)，然后在第2、5、7和9天进行治疗。结果显示DAVLBHY-9.2.27结合物使肿瘤体积大大减小，而分别单独用PBS或9.2.27治疗的对照组中，肿瘤快速生长，与PBS相比，用9.2.27治疗的小鼠的肿瘤体积没有减小。据最初记载，针对人黑色素瘤细胞系M21的抗体225.28S与高分子量黑色素瘤相关抗原发生反应。该抗原分子随后证实是MCSP。一项早期的研究对225.28S(IgG2a)溶解人黑色素瘤细胞系的能力进行了检测，并与另一个抗MCSP的抗体653.40S(IgGJ予以比较。结果确定225.28S和653.40S能识别MCSP上相同或空间上邻近的抗原决定簇。体外试验发现抗体与补体结合后不能溶解黑色素瘤细胞。两个抗体在抗体依赖的细胞毒性试验中都可能介导黑色素瘤靶细胞溶解，其中225.28S的细胞溶解活性高于653.40S。但是，只有效应物/耙细胞比例显著高于其他研究报道的使用抗黑色素瘤抗原的抗体比例时才能发生黑色素瘤细胞溶解。研究作者得出的结论是，这些抗体与人补体结合不具有细胞溶解活性以及ADCC中发生溶解需要很高的效应物/耙细胞比例的研究结果暗示将单克隆抗体注入黑色素瘤患者体内可能不会破坏肿瘤细胞。作者建议，应用这些抗体进行免疫治疗时，其作用应只局限于做放射性同位素、化疗剂或毒性剂的载体。为弄清裸露抗体225.28S在I期临床试验中的治疗能力，开展了向2例黑色素瘤晚期患者静脉注射该抗体10mg的研究。虽然注射抗体并未产生临床毒副作用，但亦未出现阳性治疗反应。研究人员将抗体225.28S与一种尤其对正在分裂的细胞产生毒性的低分子量多肽——嘌呤硫素结合后检测其对人黑色素瘤细胞系Colo38的体外毒性作用。结果发现Colo38细胞与225.28S-嘌呤硫素结合物在一起培养24小时后，3H胞苷摄入受到抑制。另外，与结合物共培养7天后培养物中Colo38细胞的活性明显降低。虽然观察到体外毒性作用，但仍有一部分黑色素瘤细胞在225.28S-嘌呤硫素治疗后存活。作者暗示，恶性疾病可能得依靠作为毒性剂载体的抗不同肿瘤相关抗原的单克隆抗体鸡尾酒疗法来进行免疫治疗，这说明癌症治疗中仅使用225.28S结合物是不够的。225.28S-嘌呤硫素结合物的治疗效果是根据裸鼠体内人黑色素瘤的生长情况来评定的。首先向裸鼠皮下或腹腔植入Colo38细胞。腹腔植入的小鼠在第l、3和5天接受治疗，皮下植入的小鼠在第l、3、5和20天接受治疗。监控所有小鼠的生存情况。只在经225.28S-嘌呤硫素结合物治疗的腹腔植入小鼠中观察到生存期明显延长的统计学效果。仅使用225.28S^嘌呤硫素或225.28S和嘌呤硫素的混合物均没有提高腹腔或皮下植入小鼠的生存期。记录皮下植入小鼠的肿瘤体积，发现只有225.28S-嘌呤硫素结合物的治疗使肿瘤体积显著减小，而单使用225.28S治疗肿瘤体积没有减小。研究人员还将225.28S与化疗药物甲氨蝶呤(MTX)结合，并研究其对体内肿瘤生长的抑制效果。给裸鼠皮下接种人黑色素瘤细胞M21，然后第1、47、10和14天予以治疗，结果显示只有MTX-225.28S结合物能抑制肿瘤生长。而仅使用225.28s、氨甲蝶呤或225.28s和氨甲蝶吟混合物均不能抑制肿瘤生长。在一项研究中，225.28s被用来确定施用异种制剂是否对人有潜在毒性影响。向85例转移性皮肤黑色素瘤患者施用经1311、l2:'I、mIn或"Tc标记的完整抗体225.28S或其F(ab'h片段。抗体注射量为14-750yg。各患者均未观察到临床副作用。该研究也未报道有临床反应，不过，因为这项研究主要用于毒理检测，所以没有必要预测该项结果。225.28s被用来产生鼠抗独特型单克隆抗体，其包括产生MCSP镜象的抗体MF11-30。研究显示，醒Fll-30既能诱导同种系统又能诱导异种系统产生抗MCSP抗体。有两项临床试验中对晚期恶性黑色素瘤患者按递增剂量施用MMFll-30以检测其毒性和治疗反应。该两项研究中均未产生副作用，而且治疗耐受性良好。第二项试验中，有7例患者所产生的抗-抗独特型抗体的效价至少为1:8，血清中MCSP水平无显著变化，平均生存期为55周(16-95周之间)，而其余患者(所产生的抗抗独特型抗体的效价为l:4或更ffc血清中MCSP水平增加)的平均生存期为19周(8-57周之间)，前者明显高于后者。抗体763.74也抗黑色素瘤细胞并识别MCSP。还没有见到有关抗体763.74具有体外或体内抗癌效果的任何报道、但使用该抗体也可产生鼠抗独特型单克隆抗体。MK2-23属于这类抗体，具有抗MCSP抗体763.74限定的决定簇的内影像。临床前实验显示，MK2-23可免疫诱导同种宿主(BALB/c小鼠)和异种宿主(兔)产生抗MCSP抗体。MK2-23与钥孔血蓝蛋白(KLH)载体结合并与佐剂一并施用后，14免疫原性显著提高。临床试验中用區2-23免疫黑色素瘤患者，观察体液反应特征。将MK2-23与KLH结合并与卡介苗(BCG)混合后免疫25例IV期黑色素瘤患者，分别于第0、7和28天皮下注射2mg。如果抗抗独特型抗体的效价低，就再增加注射次数。在MK2-23免疫的患者中大约60%都产生了抗MCSP抗体，尽管抗体的亲和力和效价都比较低。研究发现，患者经區2-23免疫产生抗MCSP抗体后，生存期明显比未经MK2-23免疫的患者延长。产生抗MCSP抗体的患者的平均生存期为52周(19-93周之间)，而血清中没有阳性抗MCSP抗体的9例患者的平均生存期为19周(9-45周之间)。3例产生抗MCSP抗体的患者的病情出现部分缓解。虽然本研究结果的前景看好，但是用區2-23免疫的患者中仍有40%没有与阳性抗MCSP抗体发生免疫应答。而且，3例出现部分缓解的患者最后又全部复发。曾尝试用低剂量的环磷酰胺(CTX)对患者进行预处理，以增加區2-23的免疫原性，据文献报道，环磷酰胺通过选择性抑制某些抑制性细胞活性来提高细胞和体液对肿瘤相关抗原的免疫反应。但是，CTX预处理并没有使區2-23的免疫原性发生变化。单克隆抗体48.7是针对人转移性黑色素瘤细胞系M1733产生的一类抗体，据文献报道，它能与MCSP分子发生免疫反应。I期临床试验中联合施用了48.7与鼠单克隆抗体96.5后一抗体能抵抗人黑色素瘤上的转铁蛋白样细胞表面糖蛋白p97。5例患者接受了治疗，第1、10天注射mAbs96.5和48.7各2mg，第2天各10mg，第3-10天各25mg。结果显示，治疗耐受性良好；但是所有患者对治疗无临床反应，而且均出现疾病进展。另一项临床试验中对这两个抗体也进行了研究，其中，用带有放射性标记的两个抗体中任一抗体的Fab片段治疗3例黑色素瘤已转移到中枢神经系统的患者。向2例患者施以5mg标记有'311的48.7Fab片段，并使患者血脑屏障(BBB)渗透性开放，试图提高进入脑肿瘤的抗体量。虽然改变血脑屏障渗透性能增加Fab向肿瘤所在脑半球和脑脊液的释放量，但并未发现该抗体明显、持久地在肿瘤部位局部释放。研究者们猜测这可能是由于抗体剂量不足导致。Melimmune是兼具两个模拟MCSP不同表位的鼠抗独特型抗体，Melimmune-l(I-Mel-l)和Melimmune-2(I-Mel-2)牛寺点的制剂。I-Mel-l是针对抗MCSP抗体225.28(前面己讨论)产生的抗独特型抗体MFll-30的亚克隆。研究显示，I-Mel-1诱导兔发生抗MCSP免疫应答。I-Mel-2是针对抗MCSP抗体MEM136产生的抗独特型抗体，MEM136与MCSP上作用的表位和225.28不同。I-Mel-2也诱导兔产生抗MCSP免疫应答。包含1:1的I-Mel-1禾nI_Mel-2的Meli腿une制剂被用来对21例黑色素瘤被切除且未转移的患者进行I期试验。该项研究对一个机构的12名患者作了详细的免疫反应分析。按照两项治疗方案中的一项方案，向患者施与0.2-0.4mgmelimmune(I-Mel-l和I-Mel-2各0.1-2.Omg)。所有患者均产生抗I-Mel-1和抗I-Mel-2的抗体，其中10例患者产生的抗I-Mel-2的抗体反应峰大于I-Mel-1。但是，该研究不能证明诱导产生了MCSP特异性抗体，因为患者血清不能抑制带有放射性标记的225.28或MEM136与表达MCSP的Mel-21细胞结合。还进行了一项直接细胞结合试验，来检测患者血清中是否存在抗MCSP抗体；但是在基于FACS的试验中，免疫前血清和免疫后血清与M21细胞的结合没有差别。又在另一项临床试验中对I-Mel-2进行了试验，其中向26例转移性黑色素瘤患者肌内注射2mgI-Mel-2和100或250yg佐剂SAF-m，每两周注射一次，持续4周，然后每两月一次，直到出现疾病进展。通过抑制放射免疫分析法检测到5例患者产生抗MCSP抗体。在这5例产生阳性抗MCSP抗体的患者中，1例完全缓解，1例病情稳定另3例病情出现进鳳病情完全缓解的患者产生的抗MCSP抗体的效价最高(1:1500)。在先专利US5270202(及其相关专利:W09216646A1、EP0576570A1)i井授了一种针对抗人黑色素瘤相关蛋白多糖(亦称HMW-MAA)抗体MEM136的抗独特型抗体頂elpg2(亦称頂32)。文中指出頂elpg2抗体特异性靶向MEM136，建议将其用于诊断和治疗表达MPG抗原的相关疾病。虽然体外试验确定IMelpg2能抵抗肿瘤细胞侵入，但它并不是所试验的最有效的抗体，而且尽管出现Ab3应答，也不能证明它在体内具有抗肿瘤疗效。EP0380607B1讲授了一类针对Mab225.28的抗独特型抗体，它对H丽-MAA的一个未知表位有特异性。这类抗体被用于黑色素瘤自动免疫治疗。文中报道通过动物模型对针对225.28产生的MFll-30和IMelpgl以及抗独特型多克隆抗体予以评价，其中使用MF11-30对黑色素瘤患者进行了临床试验，但没有数据支持。MFll-30能诱导产生独特型抗体225.2&在用BM-Cycline处理MF11-30细胞系并检测支原体污染清除效果时，获得頂elpgl细胞系。虽然兔血清中能诱导产生抗IMelpgl抗体，而且该抗体能与Colo38黑色素瘤细胞结合，但并不表明它具有体内或体外抗肿瘤活性。US4879225讲授从不可溶的免疫复合物中制备抗体。该专利中，抗HMW-MAA的抗体Mab9.2.27被固定在蛋白A-琼脂糖上用作抗原，诱导产生抗Mab9.2.27的大鼠抗独特型抗体，多种与琼脂糖结合的细胞或细胞溶解产物复合物产生抗黑色素瘤细胞抗体。将与黑色素瘤细胞结合、但不与正常T细胞或B细胞结合的鼠单克隆抗体与9.2.27进行比较，从中选择与9.2.27特性类似的抗体，进一步表示为NR-ML-02、NR-ML-03、NR-ML-04、NR-ML_05、NR-ML_06。这些抗体在用9.2.27作捕获抗体、用可溶性SKMEL-28黑色素瘤膜作抗原的夹心ELISA试验中均表现为阳性。另外这些抗体还能识别黑色素瘤细胞并且可与平滑肌和内皮细胞反应。另外还产生61种抗蛋白多糖抗体，其中10种抗体识别与NR-ML-02/NR-ML-04相同的决定簇，3种抗体识别与NR-ML-03或NR-ML-05相同的决定簇；45种抗体识别的决定簇与该5种抗体确定的决定簇不同。US5084396中，这些抗体经放射性标记后与9.2.27比较携带黑色素瘤异种移植物的裸鼠中的肿瘤摄取量。结果显示，肿瘤对NR-ML-05和NR-ML-02产生的摄取量最大，9.2.27次之，NR-ML-02最小。这些发明既不能说明这些抗体能减小癌症的肿瘤负荷，也不能说明这些抗体能延长患癌症的哺乳动物的生存期。US5034223讲授一种通过用未结合的封闭抗体预处理来增加结合抗体向携带肿瘤相关抗原的组织释放量的方法。该方法中，先施用未标记的MabNR-2AD(仅对一例患者的B细胞淋巴瘤有特异性的抗独特型抗体)，然后再在临床上施用与technicium99(Tc_99)结合的抗匿W-MAA、9.2.27和NR-ML-05的抗体。由于这些研究是利用既没有细胞毒性、也没有放射性效果的Tc-99作报告同位素，虽然用这种方法可以提高抗HMW-MAA抗体的摄取量，但并没有证据证明抗肿瘤效果产生。US5580774讲授利用编码Mab9.2.27的抗体基因构建嵌合抗体。文中没有公开用该嵌合抗体进行癌症诊断或治疗的内容。US5493009和US5780029讲授针对抗HMW-MAA抗体763.74的鼠抗独特型抗体MK2-23及其结合物。文中记载，MK2-23可以直接与763.74结合而抑制763.74与黑色素瘤细胞Colo38结合。另外，MK2-23诱导产生的Ab3可以与H丽-MAA直接结合，并能竞争性抑制763.74与Colo38黑色素瘤细胞结合。在临床试验中用離2_23对IV期黑色素瘤患者进行自动免疫治疗。89%患者的免疫后血清与Colo38黑色素瘤细胞发生反应从而抑制763.74与Colo38细胞结合，这暗示患者血清中诱导产生了Ab3抗体。文中报告15例患者中有6例患者的转移病灶尺寸减小，但没有提供研究细节。患者血清中只有部分抗体的特异性予以确定，仍不清楚Ab3抗体的存在是否在一定程度上与观察到的临床反应有关，因为763.74抗体原本不具有抗肿瘤效果。US5866124讲授来源于匿2-23的针对抗HMW-MAA抗体763.74的抗独特型嵌合抗体MK2-CHy1及其衍生物。说明书第12/47页US5017693、US5707603、US5817774、US6248870、US5112954、US6238667等众多发明讲授了与抗HMW-MAA抗体结合的化合物，但没有揭示它们在癌症治疗方面的应用。重要地是，单独使用这些抗体就能产生抗癌疗效，它们并不需要通过结合来获得细胞毒性或抑制细胞的作用。这些专利和专利申请虽然鉴定出MCSP抗原和相关抗体，但要么没有公开本发明所分离的单克隆抗体，要么没有讲授或暗示本发明所分离的单克隆抗体的应用。
发明内容本发明人之前已取得名为〃患者个体特异性抗癌抗体〃的美国专利6，180，357，其涉及一种选择癌症治疗个性化抗癌抗体的方法。本文中，术语"抗体"和"单克隆抗体〃(mAb)可以互换使用，都是指杂交瘤细胞(如老鼠或人)产生的完整免疫球蛋白、免疫结合物，有些情况下也指免疫球蛋白的片段和它的重组蛋白，如嵌合免疫球蛋白和人源化免疫球蛋白、F(油')和F(ab')2片段、单链抗体、重组免疫球蛋白可变区(Fv)s、融合蛋白等。本领域技术人员应该很清楚，多肽中某些氨基酸序列的变化不会显著影响蛋白质的结构或功能。抗体分子重排中，一般可以容忍其骨架区核酸或氨基酸序列的修饰，这些修饰包括但不限于，取代(保守取代优先)，缺失或添加。另外，将标准化疗形式(如放射性核素)与本发明CDMAB结合起来在所述化疗方面予以应用也属于本发明的范围。CDMAB还能与毒素、细胞毒性组分(cytotoxicmoiety)、酶(如生物素结合酶)或血细胞结合在一起形成抗体结合物。本申请使用'357专利中讲授的制备患者特定抗癌抗体的方法来分离编码癌症缓解性单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些抗体能特异性针对一个肿瘤，从而使定制癌症治疗方案具备可行性。本文中，以下具有细胞杀伤(细胞毒性)或细胞生长抑制(细胞抑制性)特性的抗癌抗体称为细胞毒素。它们能辅助用于癌症分期和诊断，还能用于治疗肿瘤转移。个性化抗癌治疗的前景有望改变患者的治疗方式。临床设想如下在肿瘤发生时采集肿瘤样本并存到肿瘤库中。根据现有的癌症缓解性抗体组，进行肿瘤样本分型。先按传统方法对患者分期，然后可再用相应抗体进一步分期。可以直接用已有抗体对患者尽速治疗，或者用本文概括的方法或使用噬菌体表面呈现文库并结合本文公开的筛査方法制备肿瘤特异性抗体组后进行治疗。将制备的所有抗体加到抗癌抗体库中，因为有可能其他肿瘤也会产生某些与正在治疗的肿瘤一样的抗原表位。根据本方法制备的抗体可用于治疗能与其结合的癌症。基本上使用专利US6，180，357和专利申i青No.10/348，231中公开的方法，用患者乳腺癌活检细胞免疫小鼠获得小鼠单克隆抗体11BD-2Ell-2。人不同组织来源的一些细胞系的细胞表面表达有HBD-2E11-2抗原。乳腺癌细胞系MCF-7和卵巢癌细胞系0VCAR-3在体外对11BD-2E11-2的细胞毒性作用比较敏感。根据11BD-2E11-2对培养的MCF-7和0VCAR-3细胞产生细胞毒性的研究结果，进一步将11BD-2E11-2植入小鼠内，以查明它对这些癌细胞是否有抗癌活性(如专利申请No.10/762，129所述)。临床前异种移植肿瘤模型已公认为有效的疗效预测模型。在预防人乳腺癌体内模型中，11BD-2E11-2能防止肿瘤生长并减小肿瘤负荷(据专利申请No.10/762，129记载)。第51天(最后一次治疗后不久)，11BD-2E11-2治疗组中肿瘤平均体积为同型对照组体积的20%。治疗后持续监测280天。11BD-2E11-2治疗组中40%自移植后生存期在7.5个月以上。相反，治疗后6.5个月同型对照组的死亡率达100%。所以在较为成熟的人乳腺癌模型中，与对照治疗组相比，11BD-2E11-2使生存期增加、肿瘤负荷减小。为确定11BD-2E11-2在其他人乳腺癌模型中也有同样疗效，在所建立的一个乳腺癌模型中检测它对MDA-MB-468(MB-468)细胞的抗肿瘤活性(如专利申请No.10/810，744所述)。结果显示，与缓冲液对照相比，11BD-2Ell-2抑制肿瘤生长达250/0。所以，11BD-2E11-2在所建立的预防乳腺癌异种移植模型中能防止肿瘤生长。另外，它在至少两种不同的乳腺癌模型中表现出抗肿瘤活性。11BD-2E11-2治疗除在人乳腺癌模型中产生有益效果外，还在预防卵巢癌模型中表现出抗0VCAR-3细胞的抗肿瘤活性(如专利申请No.10/762，129所述)。该模型中用体重作为肿瘤进展的检测指标。移植后第80天(治疗结束后第16天)治疗组小鼠的平均体重占对照组的87.6%(p=0.015)。在一个较为成熟的人卵巢癌模型中，HBD-2E11-2与缓冲液对照治疗组相比，能延缓肿瘤进展，因此HBD-2E11-2治疗具有一定疗效。11BD-2E11-2因具有抗肿瘤活性而在几个不同癌症模型中成为备受瞩目的抗癌治疗剂。为确定11BD-2E11-2在其他人卵巢癌模型中也有同样疗效，在建立的一个卵巢癌模型中检测它对ES-2+SEAP细胞(经人胎盘分泌的碱性磷酸酶(SEAP)转染的ES-2卵巢癌细胞)的抗肿瘤活性(如专利申请No.10/810，744所述)。与缓冲液对照相比，11BD-2E11-2使治疗组中小鼠群的生存期延长。另外，11BD-2E11-2治疗组内1只小鼠在治疗后SEAP循环水平大大降ffcSEAP循环水平可用作肿瘤负荷指示因子。所以，11BD-2E11-2在建立的预防卵巢癌异种移植模型中能防止肿瘤生长。另外，它在两种不同的人卵巢癌模型中均表现出抗肿瘤活性。生化数据表明11BD-2E11-2的抗原是MCSP(如专利申请No.10/810，744所述)，先前的免疫组织化学分析及其他实验室开展的体外试验均已证实黑色素瘤细胞上表达有MCSP，并且指出MCSP与肿瘤粘连、侵入和转移有关。因此，11BD-2Ell-2在所建立的预防人黑色素瘤模型中被确定具有疗效。在预防黑色素瘤模型中，第55天(治疗结束后第5天)，11BD-2E11-2治疗组中肿瘤平均体积占缓冲液对照治疗组体积的58%(p=0.046)。在建立的模型中，疗程结束后，抗体11BD-2E11-2与缓冲液对照治疗组相比抑制肿瘤生长达491由于本次实验中动物数量有限实验结果没有达到显著水平(p二0.1272)，但趋势却一目了然。所以，11BD-2E11-2在建立的预防恶性黑色素瘤异种移植模型中能防止肿瘤生长，另外，11BD-2E11-2在两种不同的人乳腺癌和卵巢癌模型以及人黑色素瘤模型中均表现出抗肿瘤活性。为确认11BD-2E11-2表位可作为药物耙点，检测冰冻正常人组织中是否表达有11BD-2E11-2抗原(如专利申请No.10/810，744所述)。通过用11BD-2E1卜2染色的IHC技术发现，大多数组织，包括肝、肾和心脏等活的器官的细胞，都不表达11BD-2E11-2抗原。虽然几乎所有组织的血管平滑肌纤维被染色，但亦有某些组织上皮也被染了色。搞清楚乳腺癌患者体内11BD-2E11-2抗原的定位及分布对评价11BD-2E11-2的免疫疗效和设计有效的临床试验至关重要。为确定癌症患者的乳腺瘤中11BD-2E11-2抗原的表达位置，从来自8例(7份额外样本或者完全分离，或者不代表微阵列切片上的肿瘤)乳腺癌患者的肿瘤组织样本中筛选表达11BD-2E11-2抗原的样本(据专利申请No.10/810，744所述)。研究结果显示62%组织样本染色呈阳性，说明存在11BD-2E11-2抗原。患者样本内11BD-2E11-2的表达显示为癌细胞特异性表逸因为只有恶性细胞被染色。另外，3份(再从微阵列切片中完全分离出2份额外样本)乳腺癌患者正常组织样本中均没有出现11BD-2E11-2染色。根据癌症期或进展程度分析肿瘤时，从结果中看不出11BD-2E11-2阳性表达量随肿瘤期别增加而增加的趋势。但由于样本规模小，所以研究结果有一定局限性。由于11BD-2E11-2的抗原是MCSP(据专利申请No.10/810,744所述)，而且以前的免疫组织化学分析及其他实验室开展的体外试验均已证实黑色素瘤细胞上表达MCSP，所以进行实验来确定恶性黑色素瘤患者群体中11BD-2E11-2抗原的定位及其分布。这有助于评价11BD-2E11-2对黑色素瘤患者的免疫疗效和设计行之有效的临床试验。为确定癌症患者黑色素瘤中IIBD-2E11-2抗原表达的位置，对来自33例恶性黑色素瘤患者的肿瘤组织样本进行IIBD-2E11-2抗原表达的评估。研究结果显示67%组织样本染色呈阳性，说明存在IIBD-2E11-2抗原。患者样本内IIBD-2E11-2的表达显示为癌细胞特异性表达，因为只有恶性细胞被染色。另外，6份恶性黑色素瘤患者正常组织样本中均没有出现11BD-2E11-2染色。生化数据表明11BD-2E11-2所识别的抗原是MCSP(据专利申请No.10/810，744所述)。研究显示IIBD-2E11-2免疫沉淀蛋白被抗大鼠MCSP同源物的抗体识别，而抗MCSP免疫沉淀蛋白又被11BD-2Ell-2识别，从而支持了上述结论。这些IHC和生化结果均证实11BD-2E11-2与MSCP抗原结合。所以，确凿证据显示，11BD-2E11-2通过与MCSP上特定表位配接而介导抗癌作用。本文概述的其他生化数据也证实11BD-2E11-2所识别的抗原就是MCSP。这些抗体表位匹配结果表明11BD-2Ell-可能与具有两个主要结合部位的一个不连续表位结合。总之，该数据证实IIBD-2E11-2抗原是癌症相关性抗原，在人体内表达，在病理上与癌症靶点相关。另外，还证实IIBD-2E11-2抗体与人癌组织结合，并且适用于诊断、治疗预测或预后等分析。此外，由于该抗原在大多数非恶性细胞中不表达，所以其细胞定位可指示出细胞的癌症状态，利用这种定位观察方法可将该抗原及其基因或衍生物、蛋白或蛋白变体应用于诊断、治疗预测或预后等分析。目前已开发出许多不同的抗MCSP抗体，并己在许多体外和体内系统中进行了检测。在临床前模型中，除了一项研究结果不能重复外，其他结果均显示，裸露的抗MCSP抗体在几个不同的黑色素瘤模型和一个神经胶质模型中不能减小肿瘤或延长生存期；目前还没有用抗MCSP抗体对其他癌症类型展开研究。用裸露的抗MCSP抗体针对人进行的全部试验均未产生任何临床阳性结果。研究显示，裸露的11BD-2E11-2在鼠人乳腺癌模型中能延长生存期和减小肿瘤负荷。11BD-2E11-2在鼠人卵巢癌模型中也能抑制肿瘤进展和延长生存期。已将抗MCSP抗体与许多毒性或化疗剂结合，这些结合物经体内试验证实在鼠黑色素瘤模型中均能取得阳性结果。还没有关于抗MCSP结合物在人体内进行试验的报道，所以这些结合物的安全性还不清楚。不过，仅用单克隆抗体治疗没有什么毒性，即使有一些相关毒性，其耐受性也良好。所以如果用裸露的抗MCSP抗体治疗癌症患者可获得临床阳性结果，这将是人类的福音，是现行医疗技术的一大进步。11BD-2Ell-2不与毒性制剂结合，也有抗癌活性；所以可以避免施用抗体-毒素结合物所要考虑的特定安全问题。另外，已用许多抗MCSP抗体产生了抗独特型抗体，并对动物和人体进行了试验。小规模的非盲试验中，用抗独特型抗体免疫患者出现阳性抗MCSP免疫应答时，与没有产生特异性免疫应答的患者相比，患者的平均生存期延长。在所举的实例中，通过抗独特型抗体靶向MCSP可取得临床阳性结果。这一方法的弊病在于并非所有经抗独特型抗体免疫的患者都发生抗MCSP应答。所以如果直接施用抗MCSP抗体即可取得临床阳性结果，就能克服这种需要依靠患者自身免疫应答才能获得临床益处的问题。11BD-2E11-2正是这样一种能直接靶向MCSP、在公认能预测疗效的临床前异种移植肿瘤模型中表现出抗癌作用的抗体。总之，本发明讲授利用11BD-2E11-2抗原作为治疗剂靶点，向哺乳动物施用该治疗剂后能减小表达该抗原的癌症的肿瘤负荷(从而延缓疾病进展)，还可以延长该受治哺乳动物的生存期。本发明还讲授利用C匿AB(11BD-2E11-2)及其衍生物靶向其抗原以减小哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷，和延长携带有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的生存期。此外，本发明还讲授利用癌细胞中可检测到HBD-2E11-2抗原这一特点，对携带表达该抗原的肿瘤的哺乳动物进行诊断、治疗预测和预后。如果首次治疗对患者无效或者肿瘤发生转移，可以重复产生该肿瘤特异性抗体进行再次治疗。另外，可以将抗癌抗体与取自患者的血红细胞结合后再注射机体用于治疗肿瘤转移。目前转移性癌症还无法有效治疗，而且癌症一旦转移通常预示着死亡。不过，转移性癌症通常伴有大量血管生成，通过血红细胞输送，抗癌抗体能聚集在肿瘤部位。由于大多数癌细胞需要依赖宿主血液供应来维持生存，所以抗癌抗体与血红细胞结合后，甚至在转移前就能原位抑制肿瘤。另外，抗体也可以与淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞等其他血细胞结合。共有五类抗体，每一类抗体都与其重链功能相关。一般认为，裸抗体杀死癌细胞是通过抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)作用或者补体依赖性细胞毒性(CDC)作用完成。例如，老鼠IgM和IgG2a抗体能通过结合补体系统的C-1成分激活人补体，从而激活补体活化的典型途径，继而溶解肿瘤。人抗体中大多数有效的补体活化抗体通常是IgM和IgGl。老鼠的同型抗体IgG2a和IgG3能募集具有Fc受体的毒性细胞，从而通过单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞将细胞杀死。人同型抗体IgGl和IgG3由ADCC介导。抗体介导的癌细胞杀伤作用的其他机理可能是抗体能将细胞膜中各种化学键及相关糖蛋白或糖脂水解(即催化抗体)。还有两种普遍接受的有关抗体介导的癌细胞杀伤作用的机理。一是用抗体作疫苗，诱导机体产生对癌细胞表面抗原的免疫反应。二用抗体靶向生长受体，干扰其功能或者对该受体进行负调控使其功能丧失。癌症药物临床应用的基础是该药物能在风险可接受状况下使患者受益。生存通常是癌症治疗中追求的主要益处，但除延长生命外，还有一些其它公认的益处。在治疗不影响生存前提下，其他益处包括症状减轻、防止不利事件、延长复发期或无病生存期和延长肿瘤进展时间。这些标准已被普遍接受，例如美国食品药物管理局(FDA)等监管机关已批准能产生这些益处的药物(Hirschfeld等CriticalReviewsinOncology/Hematology42:137-1432002)。除这些标准外，还有其他已得到认同的可预示这些益处的终点。美国FDA出台的加快审批程序承认有一些可能预测患者受益的指标。2003年底，已有16种药物根据这一程序获批，其中4种获完全批准，即这些替代终点预测的直接益处在后续研究中得到证实。确定药物对固体肿瘤疗效的一个重要终点是肿瘤负荷，一般通过测定治疗反应对其进行评价(Therasse等，JournaloftheNationalCancerInstitute92(3):205-2162000)。固体肿瘤反应评价标准工作组(ResponseEvaluationCriteriainSolidTumorsWorkingGroup)(国际癌症专家小组)发布了进行上述评价的临床标准(RECIST标准)。根据RECIST标准中客观反应所示，与适当的对照组比较，经证实对肿瘤负荷有效的药物应最终使患者产生直接益处。一般来说临床前肿瘤负荷的评价和记录更加直截了当。因为临床前研究能转化为临床实践，所以临床前模型中延长生存期的药物最有可能在临床应用。与临床治疗产生的阳性反应类似，临床前减小肿瘤负荷的药物也可能对疾病产生明显的直接影响。虽然癌症药物治疗中延长生存期是追求的最重要临床结果，但其他一些益处也具有临床利用价值，显然，可能延缓疾病进展的肿瘤负荷减小就能获得直接益处，具有临床价值(Eckhardt等，DevelopmentalTherapeutics:SuccessesandFailuresofClinicalTrialDesignsofTargetedCompounds;ASC0EducationalBook,39thAnnualMeeting,2003，pages209-219)。因此，本发明的一个目的是使用一种从特定个体细胞中产生对癌细胞有毒性而对非癌细胞无毒性的癌症缓解性抗体的方法，以期分离杂交瘤细胞系和相应的单克隆抗体及所述杂交瘤细胞系编码的抗原结合片段。本发明的另一目的是讲授CDMAB及其抗原结合片段。本发明的再一目的是产生其细胞毒性通过ADCC介导的CDMAB。本发明的还一目的是产生其细胞毒性通过CDC介导的CDMAB。本发明的再一目的是产生其细胞毒性与其催化细胞化学键水解能力成函数关系的CDMAB。本发明的又一目的是产生在用于癌症诊断、预后和监测的结合分析法中所使用的CDMAB。本发明的其他目的及优点通过以下阐述、范例和特定实施例形式的说明将会显而易见。本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。若需要本专利或专利申请的含彩色附图的出版文本副本，可请求美国专利商标局提供并支付必要费用。图1:用11BD-2E11-2作探针与MDA-MB-231(泳道1)或0VCAR-3(泳道2)膜杂交所得的Western印迹图谱。膜蛋白在还原条件下分离。右边表示分子量标记。图2:去糖基化作用对11BD-2E11-2与MDA-MB-231膜结合的影响。11BD-2E11-2与分别置于仅有去糖基化缓冲液(泳道1)，包含PNGaseF(肽-N-糖苷酶)、0-内切糖苷酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡萄糖苷酶(泳道2)，包含PNGase、O-内切糖苷酶和唾液酸酶(泳道3)，仅含唾液酸酶(泳道4)，仅含0-内切糖苷酶(泳道5)和仅含PNGase(泳道6)中的MDA-MB-231膜结合的情况。图3用11BD-2E11-2免疫沉淀的膜蛋白MDA-MB-231的SDS-PAGE(A组)和Western印迹(B组)图谱。泳道1表示分子量标准，泳道2表示MDA-MB-231膜蛋白，泳道3表示11BD-2E11-2免疫沉淀物，以及泳道4表示同型对照免疫沉淀物。图4:探针分别为11BD-2E11-2(A组)、IgGl同型对照(克隆107.3，B组)、抗大鼠NG2(多克隆，C组)、正常兔IgG(D组)、抗MCSP(克隆9.2.27，E组)和IgG2a同型对照(克隆G155-228，F组)的蛋白Western印迹图谱。泳道1:11BD-2E11-2免疫沉淀物，泳道2:IgGl同型对照(克隆107.3)免疫沉淀物，泳道3:抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物泳道4IgG2a同型对照(克隆G155-228)免疫沉淀物，泳道5:MDA-MB-231膜和泳道6:仅样本缓冲液(阴性对照)。图5:11BD-2E11-2-HRP与MCSP肽阵列的结合强度(Boehringer灯光设备)。图6:针对几种癌细胞系和非癌细胞的11BD-2Ell-2、同型对照或抗EGFR抗体的典型的FACS直方图。图7:显示了11BD-2E11-2(A)和同型对照抗体(B)分别与冰冻正常人组织阵列中的心脏组织切片的结合图谱的典型显微照片。图中，11BD-2Ell-2没有使心肌纤维染色。放大倍数是200X。图8:显示了11BD-2E11-2(A)、抗肌动蛋白(B)和同型对照抗体(C)分别与冰冻正常人组织阵列中的骨骼肌组织切片的结合图谱的典型显微照片。11BD-2E1卜2没有使骨骼肌染色，但使血管平滑肌染色(箭头)。放大倍数是200X。图9:11BD-2E11-2(A)和同型对照抗体(B)分别与乳腺癌肿瘤(浸润性导管癌)结合的典型显微照片。A组中黑色箭头指向肿瘤细胞。放大倍数是200X。图10:显示了11BD-2E11-2(A)、阳性对照抗CD63(NKI-C3)(B)和阴性同型对照抗体(C)分别与冰冻人黑色素瘤组织阵列中的恶性黑色素瘤组织切片的结合图谱的典型显微照片。放大倍数是200X。图11:显示了11BD-2E11-2分别与冰冻黑色素瘤人组织阵列中的恶性黑色素瘤(A)和正常皮肤组织切片(A)的结合图谱的典型显微照片。11BD-2E11-2使恶性黑色素瘤显著染色而未使正常皮肤染色。放大倍数是200X。图12:预防MDA-MB-468乳腺癌模型中11BD-2E11-2或缓冲液对照对肿瘤生长的影响。虚线表示抗体施用疗程。数据点表示平均+/-SEM。图13:—项ES-2异种移植研究模型中携带肿瘤的小鼠经11BD-2E11-2或缓冲液对照抗体治疗后的生存期。图14:一项ES-2异种移植研究模型中携带肿瘤的小鼠在11BD-2E11-2或缓冲液对照治疗前、中、后的SEAP水平。图15:预防A2058恶性黑色素瘤模型中11BD-2E11-2或缓冲液对照对肿瘤生长的影响。虚线表示抗体施用疗程。数据点表示平均十/-SEM。图16:—项A2058恶性黑色素瘤模型中11BD-2E11-2或缓冲液对照对肿瘤生长的影响。虚线表示抗体施用疗程。数据点表示平均十/-SEM。具体实施例方式实施例1:通过Western印迹法鉴定结合蛋白为鉴定11BD-2E11-2抗体所识别的抗原，将表达该抗原的细胞膜进行凝胶电泳，并利用Western印迹法将其转移到膜上以确定通过该抗体检测到的蛋白(据专利申请No.10/810，744所述)。1、膜的制备先前的研究工作已证实11BD-2E11-2的FACS与乳腺癌细胞系MDA-MB-231(MB-231)结合。并且还证实11BD-2E11-2具有抗卵巢癌细胞系0VCAR-3的功效。所以，制备这两种细胞系的细胞膜进行抗原鉴忠另外Western印迹和免测沉淀研究也已证实11BD-2E11-2与制备的A2058细胞膜的结合图谱类似。用MB-231乳腺癌或OVCAR-3卵巢细胞的铺满培养物制备总细胞膜。去除细胞团中的培养基，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞。用分离缓冲液(Gibco-BRL，GrandIsland,NY)在振荡器上37。C、振荡20分钟使细胞分离。收集细胞，4°C、900g离心10分钟。离心后，细胞团重悬在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，4°C、900g再离心10分钟以洗涤。然后保存在-80°C。细胞团按3ml缓冲液/克细胞的量重悬在匀浆缓冲液中，缓冲液中按1片/50ml缓冲液的量加入Complete蛋白酶抑制剂"鸡尾酒"片(Roche，LavalQC)。裂解细胞前先用polytron匀浆器在冰上将细胞悬浮液匀浆粉碎。4°C、15，OOOg离心细胞匀浆液10分钟以去除细胞核颗粒。收获上清纟私分装到几管内，然后4。C、75，600g离心90分钟。小心弃除管内上清液，将各膜团重悬在大约5ml匀浆缓冲液中。然后将各管合到一个管内，4°C、75，600g离心90分钟。小心弃除管内上清液，并对细胞团称重。将含1%TritonX-100'的溶解缓冲液按3ml缓冲液/克膜团的量加到细胞膜团中。300rpm冰上振荡1小时，使膜团溶解。75，600g离心，将不溶物质离心成团。小心倒出含有膜蛋白的上清液用于蛋白质含量分析，并保存在-8(TC。2、SDS-PAGE禾nWestern印迹用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离膜蛋白。取20"g膜蛋白与含100mMDTT的SDS-PAGE样本缓冲液混合，然后加到8%SDS-PAGE凝胶的点样孔内。将预先染色的分子量标记(安大略省伯灵顿市Invitrogen公司)上样到对照泳道内。IOOV、电泳10分钟，然后电压调到150V，直到看到预先染色的分子量标记完全分离为止。按电渍法(40V、16小时)将凝胶中蛋白转移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)上。根据预先染色的标记是否从凝胶完全转移到膜上来估计转移情况。转移完后，用含50/。脱脂奶粉的Tris-缓冲盐水(含O.5%Tween-20)封闭膜，2小时。之后用含O.5%Tween-20的Tris-缓冲盐水(TBST)洗涤一次，置于经3%脱脂奶粉TBST稀释的5ug/ml11BD-2E11-2中2小时。再用TBST洗涤3次后，将膜置于与辣根过氧化物酶结合(HRP)的山羊抗小鼠IgG(Fc)(来自JacksonImmunologicals,WestGrovePA)中，之后用TBST洗涤3次，再置于HRP底物3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)(底物试剂盒购自安大略省伯灵顿Vector实验室)。图1清楚地显示出，11BD-2E11-2与MB-231(泳道l)和OVCAR-3(泳道2)膜蛋白的3个分子量区结合。与分子量(MW)标准比照，该抗体与分子量大约为150、240和280kDa的蛋白结合。其他所有研究都用MB-231膜进行，因为该细胞系反应更强一些。实施例2:确定11BD-2E11-2结合的抗原的糖基化为确定11BD-2E11-2抗体识别的抗原是否是糖蛋白，将MB-231膜置于PNGaseF(肽-N-糖苷酶)、0-内切糖苷酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡萄糖苷酶的不同组合中。用SDS-PAGE电泳分离膜，然后按Western印迹法与11BD-2E11-2杂交。图2为11BD-2E11-2与分别置于仅有去糖基化缓冲液(泳道1)，包含PNGaseF(肽-N-糖苷酶)、o-内切糖苷酶、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡萄糖苷酶(泳道2)，包含PNGase、0-内切糖苷酶和唾液酸酶(泳道3)，仅含唾液酸酶(泳道4)，仅含0-内切糖苷酶(泳道5)和仅含PNGase(泳道6)中的MDA-MB-231膜结合的情况。经糖苷酶处理的MB-231膜仍与11BD-2E11-2结合，但可以看到所有泳道中蛋白质分子量发生了变化，这说明11BD-2Ell-2识别的抗原是糖蛋白。实施例3:11BD-2Ell-2所结合的抗原的鉴定l.免疫沉淀本例中，将用11BD-2E11-2抗体与可溶性膜糖蛋白之间的免疫沉淀反应分离出相关配基，然后进行11BD-2Ell-2特异性抗原鉴定。取100uLProteinG.Dynabeads(DyrmlBiotech,LakeSuccess,纽约)用lml0.1M磷酸钠缓冲液(p朋.0)洗涤3次。将含100ug11BD-2E11-2的100ixL0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)加入洗涤后的珠子中，转动混合1小时。去除未结合的抗体，用0.5ml0.1M含0.l%Tween-20的磷酸钠(pH7.4)将外面包裹11BD-2E1卜2的珠子洗涤3次。再用lml0.2M三乙醇胺(pH8.2)洗涤2次。加入lml含0.02M二甲基庚二胺盐的0.2M三乙醇胺(pH8.2)，转动混合30分钟，使11BD-2E11-2与珠子化学交联。最后将珠子置于lml0.05MTris(pH7.5)中转动混合15分钟，使反应终止。将HBD-2Ell-2交联珠用lml含0.l%Tween-20的lmMKH2P04、10mMNa2HP04、137mMNaCl、2.7mMKC1溶液(PBS)洗涤3次。再用0.1M、pH3.0柠檬酸盐预洗提3分钟，然后用0.1M含0.l%Tween-20的PBS洗漆3次。用针对三硝基苯酚(不相干分子)的小鼠IgGi抗体(克隆107.3，安大略省Oakville市BDBiosciences公司提供，)作阴性IgG,同型对照，按上述同样方法制备另一套抗体交联珠。将11BD-2E11-2交联珠置于含1%BSA的0.lM磷酸钠溶液(pH7.4)中，转动混合30分钟进行封l迅然后用0.lM磷酸钠溶液(pH7.4)洗涤3次。将500ugMB-231细胞膜制备物置于11BD-2E11-2交联珠中，4。C转动混合2.5小时。再用lml含1%TritonX-100的lmMKH2P04、10mMNa2HP04、287mMNaCl、2.7mMKC1溶液将该免疫复合物结合珠洗涤3次。将11BD-2E11-2结合珠置于30uL0.1M柠檬酸盐(pH3.0)缓慢混合3分钟，洗提出11BD-2Ell-2结合蛋白。加入9uL1MTris(pH9)将洗提出的蛋白pH调为中性，保存在-80°C。用3ml含0.l%Tween-20的PBS洗涤11BD-2E11-2交联珠。将IgG,同型对照(克隆107.3)交联珠置于MB-231膜蛋白中，按与11BD-2E11-2珠同样的方法进行操作。利用MB-231膜蛋白按所述方法制备两批11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白后合在一起。IgGl(克隆107.3)同型对照珠也进行同样操作。将62%的免疫沉淀混合物(相当于620tigMB-231膜蛋白经免疫沉淀后所得蛋白量)上样到4-20%SDS-PAGE梯度凝胶的1个泳道孔内。将相当于20ugMB-231膜蛋白的107.3交联珠产物上样到相邻泳道内。在对照泳道中加入未染色的(安大略省伯灵顿Invitrogen)或预先染色的分子量标记。先100V电泳10分钟，再150V、60分钟。最后将凝胶置于SYPRORuby(安大略省米西索加市BioRad公司)中染色。在平行的Western印迹操作中，电泳分离出18%免疫沉淀混合物(相当于180tigMB-231膜蛋白经免疫沉淀后所得蛋白量)与等量IgGl同型对照(克隆107.3)交联珠产物。通过电渍法在40V、16小时下将凝胶中蛋白转移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)上。之后用含5。/。脱脂奶粉的TBST封闭膜2小时。然后用含3%脱脂奶粉的TBST稀释的11BD-2E11-2作探针与膜杂交2小时。用TBST洗涤3次后，将膜置于山羊抗小鼠IgG(Fc)-HRP结合物中1小时。再用TBST洗涤3次，然后置于HRP的底物TMB中。图3为11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白的凝胶和Western印迹图谱。凝胶上(A组)泳道1表示分子量标准，泳道2表示MB-231膜蛋白。在含有11BD-2E11-2免疫沉淀物的泳道中(泳道3)，有两条不同的带，分子量分别为240和280kDa，而含有107.3免疫沉淀物(泳道4)的泳道中没有出现这两条带。在对应的Western印迹图谱(B组)上，11BD-2E11-2与240和280kDa的11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白反应明显。11BD-2E11-2与另一条150kDa的11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白带同样反应明显；而在染色的凝胶上没有检测到这条蛋白带。11BD-2E11-2与11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白的反应情况与整个MB-231细胞膜上所呈现的情况类似(泳道2)。11BD-2E11-2与IgGl同型对照(克隆107.3;泳道4)免疫沉淀蛋白没有发生反应，这说明11BD-2E11-2与免疫沉淀蛋白的结合是特异性的，而并非杂蛋白所致。2.质谱分析用无菌解剖刀切出凝胶上相当于240和280kDa的11BD-2EU-2免疫沉淀蛋白区域(图3A组泳道3X然后应用MALDI/MS和LC/MS/MS质谱分析技术鉴定凝胶块中蛋白。在PROGEST工作站中用胰蛋白酶酶解样本，然后取一部分酶解后上清液进行MALDI/MS分析。用ZipTips自动点样(ProMS);用基质(a-氰基4-羟基肉桂酸)溶液(含60%乙腈、0.2%TFA)和C18填料洗提肽段。操作VoyagerDE-STR质谱仪(AppliedBiosystems，FosterCityCA)获得MALDI/MS数据，观察到的m/z数值提交给ProFound程序(Proteometrics程序包)进行肽质量指纹检索。运用ProFound程序査询当地保存的NCBInr数据库备份。采用nanoLC/MS/MS方法在MicromassQ-Tof2质谱仪上使用75umC18柱以流速200nL/min对另一部分酶解上清液进行分析。用当地的MASCOT备份检索MS/MS数据。利用MALDI/MS和LC/MS/MS鉴定的蛋白列于表1。表1.利用MDA-MB-231细胞膜的11BD-2E11-2免疫沉淀物鉴定的蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>两份样本均鉴定为黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)。3、确认通过检测已知的抗MCSP抗体是否与11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白发生反应来确定该抗原，反之亦然。同样采用前述方法制备免疫沉淀物，不同的是，另外增加了小鼠抗MCSP单克隆抗体9.2.27(IgG2a)(Chemicon，TemeculaCA)，和用作阴性IgG2a同型对照的抗三硝基苯酚(不相干分子)小鼠IgG2a抗体(克隆G155-178由安大略省0akville市BDBiosciences公司提供)。用SDS-PAGE分离相同的6块10%凝胶中的11BD-2E11-2免疫沉淀物、IgGl同型对照(克隆107.3)免疫沉淀物、抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物、IgG2a同型对照(克隆G155-228)免疫沉淀物和MB-231膜。按上述方法进行电泳、Western印迹操作。将膜置于含3%脱脂奶粉的TBST稀释的5ug/ml11BD-2E11-2、IgGl同型对照(克隆107.3)、抗MCSP(克隆9.2.27)、IgG2a同型对照(克隆G155-228)、兔多克隆抗大鼠NG2抗体(MCSP是大鼠NG2的人同源物；Chemicon，TemeculaCA)和正常兔IgG(Sigma,SaintLouisM0)中2.5小时。Western印迹图谱如图4所示。图4(A组)显示了11BD-2E11-2分别与11BD-2E11-2免疫沉淀物(泳道1)、IgGl同型对照(克隆107.3)免疫沉淀物(泳道2)、抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物(泳道3)、IgG2a同型对照(克隆G155-228)免疫沉淀物(泳道4)、MB-231膜、(泳道5)和仅样本缓冲液(阴性对照)(泳道6)结合的情况。MB-231膜和11BD-2E11-2免疫沉淀物中，11BD-2E11-2识别同样的3条带，分别约为150、240和280kDa。而在抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物泳道中仅有上面280kDa的带被识别。同型对照免疫沉淀物泳道均无反应，说明11BD-2E11-2与免疫沉淀物之间的反应是由于蛋白与11BD-2E11-2和9.2.27特异性结合和免疫沉淀蛋白所致。以IgGl同型对照(克隆107.3)为探针进行的平行杂交(B组)中，所有泳道都没有观察到反应，这说明在以11BD-2E11-2为探针进行杂交所观察到的反应是特异性的。C组显示出兔多克隆抗大鼠NG2抗体在平行杂交中的结合情况。抗NG2与UBD-2Ell-2免疫沉淀物(泳道l)中大约150和240kDa的两条带结合，但没有与其他泳道中相同分子量的蛋白结合。在平行杂交(D组)中，正常的兔IgG与IgG2a免疫沉淀物(泳道4)和MB-231膜(泳道5)中蛋白略微发生非特异性反应。所以C组(以兔抗NG2为探针)泳道中出现的相同反应应视为非特异性的。在平行杂交(E组)中，抗MCSP(克隆9.2.27)仅与抗MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物泳道(泳道3，箭头所示)中的一条带有很微弱的结合；在MB-231膜(泳道5)中没有看到这条带，说明9.2.27可能与该抗原的亲合力低，所以只有在例如免疫沉淀样本浓縮后才显出反应。以lgG2a同型对照(克隆G155-228)为探针进行的平行杂交(F组)中，所有泳道均未观察到反应，这说明在以抗MCSP(克隆9.2.27)为探针进行杂交所观察到的反应是特异性的。这些结果证明与HBD-2E11-2免疫沉淀蛋白被大鼠MCSP同源物识别，而抗MCSP免疫沉淀蛋白又被11BD-2E11-2识别。质谱鉴定结果和已知商业抗体所证实的结果共同证明11BD-2E11-2特异性抗原是MCSP。这也与实施例2的去糖基化实验证实MCSP核心蛋白是糖蛋白的结果一致。实施例4:抗体表位测定本实施例通过抗体表位测定实验来确定HBD-2E11-2识别MCSP分子的区域。根据MCSP的氨基酸序列合成重叠肽阵列，将阵列与纤维素膜逐步共价结合，得到确定的排列。各肽段长18个氨基酸，有9个氨基酸相互重叠。将肽阵列置于封闭缓冲液中几个小时。采用在Wilson和nakane方法基础上改进的高碘酸法将11BD-2E1卜2与辣根过氧化物酶(HRP)结合。将封闭后的肽阵列置于含lug/ml11BD-2Ell-2-服P的封闭缓冲液中。另一个实验中，用羊抗小鼠IgG-HRP温育的肽阵列作阴性对照。肽阵列用TBST洗涤后，与化学发光底物进行作用。化学发光反应时，用电荷耦合成像系统(CCD成像系统)对肽阵列上各点发光进行定量分析，得到各肽的信号强度值(Boehringer灯光设备;BLU)。本实验中低于7500BLU的信号视为背景。肽阵列的结合数据列于表2。表2,11BD"2S1和HCSP肽阵列的培合驟号氣綦酸序鄉肚U.醫,鹏梦鹏mi&L■■seeS70112804945避8袋!01,!2湖131禱,A窗TOSC腿SS紋1516微、，繊微20嫩,鹏诚jraT，M21ragMJW鼸鉱战玄鼸亀遷CjtEf兹絲IWyiQ固23WETOX^膽鼸磁狩舊3378124<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>图5表示该结合数据的示意图。11BD-2E11-2与肽ft26(SEQIDNO.1)的结合最强，与tt71(SEQIDNO.2)结合较弱，仅稍高于背景，可以看到，11BD-2E11-2被肽#3(SEQIDNO.3)、恥6(SEQIDNO.4)、#170(SEQIDNO.5)、#251(SEQIDNO.6)、#252(SEQIDNO.7)柳256(SEQIDNO.8)所识别。这些结果表明11BD-2E11-可以与具有两个主要结合位(肽#26和#71)的一个不连续表位及其他许多位点结合。实施例5如专利申请No.10/743,451所述，杂交瘤细胞系11BD-2E11-2已根据布达佩斯条约于2003年11月11日保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),地址马纳萨斯Blvd.大学10801，VA20110-2209，保藏号PTA-5643。根据CFR1.808规定，保藏人应确保专利授权后公众获取保藏材料不再受限制。抗体制备单克隆抗体11BD-2E11-2的制备在CL-1000瓶(安大略省0akville市BDBiosciences公司)中培养杂交瘤细胞(PTA-5643)，收集后，按1周两次反复接种，最后根据标准的抗体纯化步骤用纯化柱ProteinGS印harose4FastFlow纯化(AmershamBiosciences,Baied，Urfe，QC)。如专利申请10/348，231所述，在细胞毒性分析试验(表2)中，将11BD-2E11-2与众多阳性对照(抗Fas(E0S9.1，IgM，ka卯a型，20ug/ml，eBioscience，SanDiego,CA)、抗Her2/neu(IgGl，kappa型，10iig/ml，安大略省马克姆InterMedico公司)、抗EGFR(C225,IgGl，kappa型，5yg/ml，Cedarlane，Hornby,0N)、环己酰亚胺(IOOpM，安大略省Oakville市Sigma公司)和N認3(0.1%，安大略省0akville市Sigma公司))和阴性对照(107,3(抗TNP，IgGl,kappa型，20ug/ml，安大略省0akville市Sigma公司BDBiosciences公司XG155-178(抗-TNP，IgG2a，kappa型，20ug/ml，安大略省Oakville市Sigma公司BDBiosciences公司XMPOll(抗原特异性未知，IgG2b，kappa型，20ug/ml)，J606(抗果聚糖，IgG3，kappa型，20ug/ml)，IgG缓冲液(2%))进行比较。用乳腺癌(MDA-MB-231(MB-231)，MDA-MB-468(MB-468)，MCF-7)、结肠癌(HT-29，SW1116,SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(OVCAR-3(0VCAR))、前列腺癌(PC-3)和非癌(CCD27sk，Hs888Lu)细胞系进行试验(均来自弗吉尼亚州马纳萨斯市ATCC)。Live/Dead细胞毒性检测试剂盒购自MolecularProbe公司(Eugene,0R)，在操作该试剂盒时根据其产品说明书作了如下改动检测前按预定的合适密度将细胞接种到孔板内。2天后，将纯化后的抗体或对照用培养基稀释，然后取lOOul转到细胞孔板内，置5%0)2恒温箱培养5天。之后将孔板倒空，并吸干液体。室温下用多通道塑料挤瓶将含MgCl2和CaCL的DPBS分加到各孔内，轻敲3下，再倒空并吸干液体。将含MgCh和CaCl2的DPBS稀释的荧光钙黄绿素染料加到各孔内，置于37°C、50/oC(V恒温箱内30分钟。用PerkinElmerHTS7000自动荧光读板机读取孔板数据，然后用微软Excel软件分析数据，结果列于表3。表中数据表示四个实验各重复三次的平均结果，并以下列方式定性表示4/4实验大于细胞毒性阈值(+++)，3/4实验大于细胞毒性阈值(++)，2/4实验大于细胞毒性阈值(+)。表l中未标记的细胞表示矛盾或效果低于细胞毒性阈值。11BD-2E11-2对乳腺癌细胞和卵巢癌细胞有特异性细胞毒性，对正常细胞没有影响。化学细胞毒性剂能产生预期的细胞毒性，而这里包括的其它许多抗体在生物细胞分析试验的限制下也可以达到预期效果。总而言之，以上实验显示11BD-2E11-2抗体对两种癌细胞类型表现出细胞毒性。该抗体的活性具有选择性，因为并非所有类型的癌细胞都对该抗体敏感。另外，该抗体不对非癌细胞产生细胞毒性(治疗中须考虑的一个重要因素)，说明该抗体具有功能特异性。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>如专利申请10/348，231和10/810，744所述，用流式细胞技术(FACS)评价11BD-2E11-2与上述癌细胞和正常细胞系组及以下卵巢癌细胞系^2780-0&A2780-s>C-140V200&Hey、OCOl、0VCA-429和ES-2+SEAP)的结合。FACS所用细胞的制备先用DPBS(不含Ca2+和Mg"洗涤细胞单层，然后在37。C用细胞分离缓冲液(安大略省伯灵顿INVITROGEN公司)将细胞培养板上细胞洗脱。离心收集后，将细胞重悬在4。C含MgC12、CaC"和2。/。或25呢胎牛血清(FBS)的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(洗涤培养基)中计数，并等分成适当细胞密度，再将细胞离心成团，重悬在4"C含有20ug/ml试验抗体(11BD-2E11-2)或对照抗体(同型对照或抗EGFR)的染色培养基(含MgC12、CaCl2和2。/。胎牛血清的DPBS)中，置于冰上30分钟。在加入与AlexaFluor488结合的第二抗体前细胞先用洗涤培养基洗涤1次。然后加到含AlexaFluor488结合抗体的染色培养基中20或30分钟。之后细胞再洗涤最后一次，并重悬在含14g/ml碘化丙啶或1.5%多聚甲醛的染色培养基中。向流式细胞仪FACScan上样，用CellQuest软件(安大略省Oakville市BDBiosciences公司)评价获取的细胞。通过调节FSC和SSC检测器电压和振幅增益，设定细胞前向角(FSC)和侧向角(SSC)。运行先后以纯化的同型对照抗体染色、再以AlexaFluor488结合的第二抗体染色以使细胞荧光强度峰相同、平均值均约为1-5单元的细胞，来调节检测器的三个荧光通道(FL1、FL2和FL3)。结合FSC设门和碘化丙啶排除法(使用的话)，获得活细胞。每份样本获得约10，000个活细胞，分析结果列于表4和5c表4和5列出了平均荧光强度相对同型对照增加的倍数，定性表示为小于5(-);5-50(+);50-100(++);大于100(+++)，以及括号内为染色细胞的百分比。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>图6所示为11BD-2E11-2抗体的典型直方图。11BD-2E11-2与乳腺癌细胞系MDA-MB-231(表4)和包括ES-2+SEAP在内的几个卵巢肿瘤细胞系(表5)特异性结合。11BD-2E11-2也与非癌细胞结合，但这种结合并不产生细胞毒性。这一非显而易见的研究发现进一步证明结合并不一定意味着抗体是与其相关抗原结合的隐含。这暗示抗体在不同细胞中的配接情况决定细胞毒性，而不是仅仅决定抗体^口口o实施例6:正常人组织染色本实施例通过IHC研究旨在査明11BD-2E11-2抗原在人体内的分布。之前已摸索了IHC的最佳操作条件，以此确定其他实验条件。11BD-2E11-2单克隆抗体的制备和纯化步骤如上所述。据专利申请No.10/810，744所述，采用冰冻人正常器官组织阵列(纽约Watervliet市Clinomics公司)使抗体与20个正常人组织结合。将玻片用冷丙酮(-2(TC)处理10分钟后，置于室温。然后用4"C冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗3次，每次2分钟，再在3%过氧化氢中清洗10分钟以抑制内源性过氧化物酶活性。接着用PBS漂洗3次，每次5分钟，之后置于Universal阻断剂(安大略省多伦多Dako公司)中室温5分钟，HBD-2E11-2、抗人肌肉肌动蛋白抗体(克隆HHF35，安大略省多伦多Dako公司)或同型对照抗体(针对黑曲霉葡萄糖氧化酶，哺乳动物组织中不存在、也不诱导产生这种酶；安大略省多伦多Dako公司)用抗体稀释缓冲液(安大略省多伦多Dako公司)稀释到作用浓度(抗肌动蛋白抗体2ug/ml，其他抗体5yg/ml)，室温下过夜l小时。玻片用PBS清洗3次，每次2分钟。用所提供的结合服P的第二抗体(安大略省多伦多DakoEnvisionSystem公司)检测或观察第一抗体的免疫反应活性，室温30分钟。然后再用PBS清洗玻片3汰每次2分钟。加入DAB(3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐，安大略省多伦多Dako公司)色原底物溶液，让免疫过氧化物酶室温染色10分钟。然后用自来水清洗玻片，使显色反应终止。再用Meyer苏木精(安大略省Oakville市SigmaDiagnostics公司)复染色，然后用乙醇(95-100%)逐级脱水，并用二甲苯清除。使用封片剂(安大略省多伦多DakoFaramount公司)将玻片封住。用倒置显微镜Axiovert200(安大略省多伦多加拿大Zeiss公司)进行显微镜检，NorthernEclipse成像软件数码成像并保存。最后由病理学家对结果进行分析、评分和解释。表6概括出正常人组织阵列经11BD-2E11-2染色后的结果。从表中可看到，主要有2类组织被染色。有一组组织完全为阴性，包括正常甲状腺、支气管和左心室心肌(图7)。第二组组织包括组织切片中染色为阳性的组织，但限于血管平滑肌纤维和/或上皮组织(图8)。这些结果说明11BD-2E11-2特异性抗原并未在正常组织上广泛表达，而且该抗体也仅与人的有限几个组织结合。11BD-2E11-2对正常人组织的染色结果与先前报道的抗MCSP抗体B5的情况类似；先前的研究显示B5与皮肤角化细胞、肺泡上皮和毛细管内皮结表6:冰冻人正常组织上11BD-2E11-2的IHC结果<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>缩写SMF:平滑肌纤维，Bg:背景染色，PD:部分分离，F:folded,CD:完全分离。实施例7:人乳腺癌组织染色本实施例通过工HC研究来确定11BD-2E11-2抗原与人乳腺癌之间的关系(据专利申请No.10/810，744所述)。对肌动蛋白(阳性对照)和抗黑曲霉葡萄糖氧化酶(一种哺乳动物组织中不存在也不能诱导产生的酶)抗体(阴性对照)进行比较。本研究中使用源自15例乳腺癌患者和5份未长肿瘤的乳腺组织样本的乳腺癌组织阵列(纽约Watervliet市Clinomics公司)。各患者信息包括年龄、性别和诊断结果。IHC步骤同实施例6。表7概括了乳腺癌组织阵列经11BD-2E1卜2抗体结合后的染色情况。各阵列包含了15例患者个体的肿瘤样本。总体上，进行试验的8例(其中7份组织样本或者完全分离，或者不具有代表性)患者中62%显示为11BD-2E11-2抗原阳性。而3份(又有2份组织样本完全分离)正常乳腺组织样本均未呈现11BD-2E11-2阳性(图9)。从结果中看不出11BD-2E1卜2阳性表达量随肿瘤期别增加而增加的趋势。但由于样本规模小，所以研究结果有一定局限性。11BD-2E11-2染色具有癌细胞特异性(图9)。从11BD-2Ell-2的染色图谱来看，抗体对患者样本中的恶性细胞具有高度特异性，因而成为备受瞩目的药物靶点。11BD-2E11-2对乳腺癌组织的染色结果与先前报道的抗MCSP抗体B5类似。先前的研究显示B5与60%乳腺癌肿瘤组织结合。表7:冰冻人正常组织和乳腺癌组织上11BD-2E11-2的IHC结果<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>本实施例通过IHC研究来确定11BD-2E11-2抗原与人黑色素瘤癌之间的癌症关系。比较抗CD63抗体(NIK-C3;MEDIC0RP，MontrealQC);阳性对照)和抗黑曲霉葡萄糖氧化酶(一种哺乳动物组织中不存在也不能诱导产生的酶)抗体(阴性对照)。所使用的恶性黑色素瘤组织阵列源自35例恶性黑色素瘤患者，IO份样本源自恶性黑色素瘤患者的正常皮肤组织(马里兰州Bethesda市TriStarTechnologyGroup有限责任公司)。IHC操作步骤除以下改动外基本同实施例6:加入用于免疫过氧化物酶染色的AEC(安大略省多伦多Dako公司)色原底物溶液室温下显色10分钟。用自来水清洗玻片，使显色反应终止。用Meyer苏木精(安大略省0akville市SigmaDiagnostics公司)复染色后，玻片用蒸馏水清除。表8概括了黑色素瘤癌组织阵列经11BD-2EU-2抗体结合后的染色情况。各阵列包含采自35例患者个体的肿瘤样本和10例患者的正常皮肤。总体上，进行试验的33例(其中2份组织样本完全着色)患者中67%表现为11BD-2Ell-2抗原阳性(图IO)。另外，取自恶性黑色素瘤患者的6份(4份组织样本不具有代表性或不能用)正常皮肤组织样本均未呈现阳性(图ll)。11BD-2E11-2染色具有癌细胞特异性(图11)。HBD-2E11-2的染色图谱显示，抗体对患者样本中的恶性细胞有高度特异性，因而称为备受瞩目的药物耙点，并且证实11BD-2E11-2可用作潜在药物。表8:冰冻人正常皮肤和黑色素瘤组织上11BD-2E11-2的IHC结果<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>縮写meta:转移性，NR:没有代表性，CD:完全分离，NA:不能用。实施例9:建立体内MDA-MB-468肿瘤实验根据专利申请No.10/810，744所述并参照图12，向6-8周的老年雌性SCID小鼠后颈部皮下注射含200万个MDA-MB-468人乳腺癌细胞的生理盐水lOOul。每周用卡尺测量肿瘤生长体积。当群体中大多数肿瘤体积达到lOOmm3，小鼠随机分成2个治疗组，每组5_6只。11BD-2E1卜2或缓冲液对照的母液在用含2.7mMKC1、ImMKH2P04、137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀释液稀释后，按10mg/kg/剂腹腔注入300"1。然后按同样方式一周注入3次、共10齐U，直到注入后第66天。大约每七天用卡尺测一次肿瘤体积，直到研究结束或动物个体达到加拿大动物保护协会(CCAC)终点。研究期间记录动物体重。研究结束时，根据CCAC指南对所有动物实施安乐死。随机化时各组的肿瘤平均体积和标准偏差大致相同。各组间体重无统计学差异，说明是真正的随机化。如图12所示，在为期3周的疗程结束时，与缓冲液对照相比，抗体11BD-2E11-2抑制肿瘤生长达25%(p=0.52)。尽管非显著性差异，但与缓冲液对照相比，研究期间可以观察到肿瘤体积减小的趋势。所以，研究显示11BD-2E11-2在乳腺癌模型中有疗效。实施例10:建立体内ES-2+SEAP肿瘤实验据专利申请No.10/810，744所述并参照图13和14，将1000万经转染后稳定表达人胎盘分泌碱性磷酸酶(SEAP)的ES-2+SEAP人卵巢癌细胞腹腔注入6-8周老年雌性athymic裸鼠体内。将1000万卵巢癌细胞重悬在500pl无血清的a-MEM中。第7天，3只小鼠死亡，说明肿瘤生长。然后小鼠随机分成2个治疗组，每组8只。11BD-2E11-2或缓冲液对照的母液在用含2.7mMKC1、lmMKH2P04、137rnMNaCl和20mMNa2HP04的稀释液稀释后，按10mg/kg/剂腹腔注入250ul。然后每天施用一次，施用5剂后，再每隔一天施用一次，施用5齐lj，前后总共施用10齐ij。研究期间或者动物个体达到CCAC终点前，通过所测定的SEAP循环水平来推测肿瘤负荷，并在尸检后对肿瘤负荷进行目测评估。研究期间记录动物体重。研究结束时，根据CCAC指南对所有动物实施安乐死。随机化时分析血浆SEAP循环水平(用来表示肿瘤负荷)。11BD-2E11-2治疗组和缓冲液对照治疗组之间，SEAP平均水平没有显著性差异。但各组内肿瘤摄取率发生变化。如图13所示，抗体11BD-2E11-2使治疗组群体生存期有延长的趋势。如图14所示，一只接受11BD-2E11-2治疗的动物的SEAP循环量已减小到可几乎忽略不计的水平。自注入后60天左右SEAP循环一直维持在低水平。实施例11:体内A2058人黑色素瘤的预防肿瘤实验参照图15中数据，向4-8周老年雌性SCID小鼠后颈部皮下注射IOOpI含75万A2058人黑色素瘤癌细胞的生理盐水。小鼠随机分成2个治疗组，每组5只。注射后当天，11BD-2E11-2试验抗体或缓冲液对照的母液在用含2.7mMKC1、lmMKH2P04、137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀释液稀释后，按20mg/kg/剂腹腔注入300u1。然后按同样方式每周施用抗体或缓冲液对照一次，持续施用7周。用卡尺每7天测一次肿瘤体积，直到第10周，或者动物个体达到加拿大动物保护协会(CCAC)规定的终点为止。研究期间记录动物体重。研究结束时，根据CCAC指南对所有动物实施安乐死。如图15所示，与缓冲液对照相比，11BD-2E11-2治疗使肿瘤生长减慢。第55天(治疗结束后第5天)，11BD-2E11-2治疗组的肿瘤平均体积占缓冲液对照组的58%(=.046，非配对t检验法)。所以，与对照相比，11BD-2E11-2在乳腺、卵巢和黑色素瘤的人体内癌症模型中对癌症有疗效，并且能减小肿瘤负荷。实施例12:建立体内A2058人黑色素瘤的肿瘤实验参照图16，向老年雌性SCID小鼠的后颈部注入100iU含50万A2058人黑色素瘤癌细胞的生理盐水。每周用卡尺测一次肿瘤体积。当群体中大多数肿瘤体积达到100mm3，小鼠随机分成2个治疗组每组5-6只。11BD-2E11-2或缓冲液对照的母液用含2.7mMKC1、lmMKH2P04>137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀释液稀释后按20mg/kg/剂腹腔注射300ul。然后按同样方式每周施用抗体或缓冲液对照3次，共施用10齐l」，直至注入后第44天。用卡尺大约每七天测一次肿瘤体积，直到研究结束或动物个体达到CCAC终点。研究期间记录动物体重。研究结束时，根据CCAC指南对所有动物实施安乐死。随机化时各组的肿瘤平均体积和标准偏差大致相同。各组间体重无统计学差异，说明是真正的随机化。如图13所示，在治疗期结束后，与缓冲液对照相比，抗体11BD-2E11-2抑制肿瘤生长达49%(p=0.1272;非配对t检验法)。尽管结果属于非显著性差异，但与缓冲液对照相比，研究期间可以观察到肿瘤体积减小的趋势。所以，11BD-2E11-2在乳腺、卵巢和恶性黑色素瘤模型中显示出疗效。总之，11BD-2E11-2在多个人癌症模型中产生的益处(与对照治疗相比，延长生存期和/或减小肿瘤负荷)暗示该抗体对包括人在内的哺乳动物的癌症治疗具有药理和制药方面的益处。确凿证据显示11BD-2E11-2是通过与MSCP上表位配接来介导抗癌作用。本发明中，所述表位称为"MSCP抗原性部分(antigenicmoiety)"，其特征为能与杂交瘤细胞系11BD-2E11-2编码的单克隆抗体、其抗原结合片段或抗体结合物结合。实施例3中显示，11BD-2E1卜2抗体可用于免疫沉淀MDA-MB-231细胞等表达的相关抗原。另外，还可能借助FACS、细胞酶联免疫吸附或IHC等技术将11BD-2E11-2抗体用于检测是否存在表达与该抗体特异性结合的MSCP抗原性部分的细胞和/或组织。因此，通过FACS、细胞酶联免疫吸附或IHC检测技术，免疫沉淀的11BD-2E11-2抗原可以抑制11BD-2E11-2与这些细胞或组织结合。另外，与11BD-2Ell-2抗体一样，其他抗MSCP抗体也可用于免疫沉淀和分离其他形式的MSCP抗原，而且同样利用上述检测法，该抗原也可用于抑制这些抗体与表达该抗原的细胞或组织的结合。本文中提到的所有专利和出版物代表本发明所属
技术领域：
的技术人员的技术水平，并视同以一一具体指明的引用方式全部并入文本。应当理解，虽然本发明按一定形式予以阐述，但并不限于本文所述和所显示的特定形式或布局。本发明可在其范围内做出各种变更，而且并不限于本说明书所言和所显示的内容，这对本领域技术人员来说是不言而喻的。本领域的技术人员很容易理解，本发明能够实现和取得已述及和虽未述及却切实存在的目的、预期结果和有益效果。本文所述的寡聚核苷酸、肽、多肽、生物相关化合物、方法、步骤和技术均代表优选实施例，它们只是作为典型实例而非对发明范围作出限制。本领域技术人员会想到属于本发明精神涵盖范围和所附权利要求范围所限定的变更及其他应用。虽然已对本发明作出说明并给出具体的优选实施例，但是本发明要求保护的范围并不局限于这些具体的实施例。实际上，对本发明上述实施方式做出的各种本领域技术人员显而易见的改动都包含在所附权利要求的范围内。权利要求1.一种治疗癌症患者的方法，其包括向所述患者施用抗癌抗体或其片段，该抗体是根据癌症治疗所使用的抗癌抗体的制备方法制备所得，所述抗体或其片段的特征在于对癌组织细胞有细胞毒性，而对非癌细胞基本上为良性；其中，将所述抗体或其片段与药物可接受的佐剂混合后，按有效量施用以介导所述癌症的治疗；所述抗体是分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段，它能与所述癌组织表达的抗原性部分结合，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体鉴别特征的抗体结合。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或嵌合抗体。3.根据权利要求1所述的方法，其包括将所述抗体或其抗原结合片段与选自毒素、酶、放射性化合物和血细胞的成分结合，形成抗体结合物；向所述患者施用所述抗体结合物或结合片段；其中，将所述抗体结合物或结合片段与药物可接受的佐剂混合后，按有效量施用以介导所述癌症的治疗。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述抗体或其片段是人源化抗体或嵌合抗体。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过抗体依赖性细胞的细胞毒性来介导。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过补体依赖性细胞毒性来介导。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过催化细胞化学键水解来介导。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过针对肿瘤细胞上癌症抗原产生免疫应答来介导。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过靶向细胞膜蛋白以干扰其功能来介导。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过使细胞蛋白构象变化从而产生细胞杀伤作用启动信号来介导。11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述制备方法利用含有取自特定个体的癌细胞和非癌细胞的组织样本进行制备。12.—种治疗癌症患者的方法，其包括向所述患者施用抗癌抗体或其片段，该抗体是根据癌症治疗所使用的抗癌抗体的制备方法制备所得，所述抗体对癌组织细胞有细胞毒性，而对非癌细胞基本上为良性；其中，所述抗体是分离出的、由保藏于ATC(;保藏号为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体或其抗原结合片段，将它与药物可接受的佐剂混合后，按有效量施用以介导所述癌症的治疗。13.根据权利要求12所述的方法，所述抗体或其片段是人源化抗体或嵌合抗体。14.根据权利要求12所述的方法，其包括将所述抗体或其片段与选自毒素、酶、放射性化合物和血细胞的成分结合，形成抗体结合物；向所述患者施用所述抗体结合物或其片段；其中，将所述抗体结合物与药物可接受的佐剂混合后，按有效量施用以介导所述癌症的治疗。15.根据权利要求14所述的方法，所述抗体或其片段是人源化抗体或嵌合抗体。16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过抗体依赖性细胞的细胞毒性来介导。17.根据权利要求12所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过补体依赖性细胞毒性来介导。18.根据权利要求12所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过催化细胞化学键水解来介导。19.根据权利要求12所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过针对肿瘤细胞上癌症抗原产生免疫应答来介导。20.根据权利要求12所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过靶向细胞膜蛋白以干扰其功能来介导。21.根据权利要求12所述的方法，其中，所述抗体或其片段的细胞毒性是通过使细胞蛋白构象变化从而产生细胞杀伤作用启动信号来介导。22.根据权利要求12所述的方法，其中，所述制备方法利用含有取自特定个体的癌细胞和非癌细胞的组织样本进行制备。23.—种介导对细胞表面上表达有MCSP抗原性部分的人肿瘤细胞的细胞毒性的方法，其包括使所述肿瘤细胞与分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段接触，所述抗体或抗原结合片段是分离出的、能与所述表达的MCSP抗原性部分结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATC(;保藏号为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体鉴别特征的抗体结合，所述结合后即产生对细胞的细胞毒性作用。24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述分离出的抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或嵌合抗体。25.根据权利要求23所述的方法，其中，将所述分离出的抗体或其抗原结合片段与选自细胞毒性组分、酶、放射性化合物和血细胞的成分结合，形成抗体结合物。26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述分离出的抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或嵌合抗体。27.根据权利要求23所述的方法，其中，所述分离出的抗体或其抗原结合片段是鼠源抗体。28.根据权利要求23所述的方法，其中，人肿瘤组织样本从选自乳腺、卵巢或黑色素瘤组织的组织中的瘤获得。29.—种确定存在表达MCSP抗原性部分的细胞的结合分析法，该MCSP抗原性部分能与分离出的、由保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合，该结合分析法包括提供细胞样本；提供分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能与所述表达的MCSP抗原性部分结合，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCG保藏号为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体鉴别特征的抗体结合；将所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述细胞样本接触；以及确定所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述细胞样本结合；从而确定存在表达能与所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合的MCSP抗原性部分的细胞。30.根据权利要求29所述的结合分析法，其中，人肿瘤组织样本从选自乳腺、卵巢或黑色素瘤组织的组织中的瘤获得。31.—种从样本中分离或筛选表达能与分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合的MCSP抗原性部分的细胞的方法，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体鉴别特征的抗体结合，该方法包括提供细胞样本；提供分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能与所述表达的MCSP抗原性部分结合，所述抗原性部分的特征在于能被具有保藏于ATCG保藏号为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体鉴别特征的抗体结合；将所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述细胞样本接触；以及确定所述分离出的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述细胞样本结合；从而确认存在表达能与所述分离出的、由保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合的MCSP抗原性部分的细胞。32.根据权利要求31所述的方法，其中，细胞样本从选自乳腺、卵巢或黑色素瘤组织的组织中的瘤获得。33.—种通过对哺乳动物中的人肿瘤予以治疗来延长生存期和/或延缓疾病进展的方法，其中，所述肿瘤表达能与具有保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体鉴别特征的单克隆抗体或抗原结合片段特异性结合的抗原，该方法包括向所述哺乳动物按有效量施用所述单克隆抗体以减小所述哺乳动物的肿瘤负荷，从而延缓疾病进展和/或延长生存期。34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述抗体与细胞毒性组分结合。35.根据权利要求33所述的方法，其中，所述细胞毒性组分是放射性同位素。36.根据权利要求33所述的方法，其中，所述抗体将补体激活。37.根据权利要求33所述的方法，其中，所述抗体介导抗体依赖性细胞的细胞毒性作用。38.根据权利要求33所述的方法，其中，所述抗体是鼠源抗体。39.根据权利要求33所述的方法，其中，所述抗体是人源化抗体。40.根据权利要求33所述的方法，其中，所述抗体是嵌合抗体。41.一种MCSP的表位，其包括表达出的MCSP抗原性部分，该MCSP抗原性部分能被具有保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体鉴别特征的单克隆抗体或它的能与所述表达出的MCSP抗原性部分特异性结合的抗原结合片段特异性结合。42.—种抗体-抗原复合物，其包括权利要求41所述MCSP的表位，该表位能被具有保藏于ATCC、保藏号为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体鉴别特征的单克隆抗体或它的能与所述MCSP表位特异性结合的抗原结合片段结合。43.根据权利要求42所述的抗体-抗原复合物，其中，该抗体是嵌合抗体。44.根据权利要求42所述的抗体-抗原复合物，其中，该抗体是人源化抗体。45.根据权利要求42所述的抗体-抗原复合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段与选自细胞毒性组分、酶、放射性化合物和血细胞的成分结合，形成抗体结合物。46.根据权利要求41所述的表位，其中，SEQIDNO.1所示肽序列LEFTLTTQSRQAPLAFQA被特异性结合。47.根据权利要求41所述的表位，其中，SEQIDNO.2所示肽序列CGGPAQDLTFRVSDGLQA被特异性结合。48.根据权利要求41所述的表位，其中，SEQIDNO.1所示肽序列LEFTLTTQSRQAPLAFQA和SEQIDNO.2所示肽序列CGGPAQDLTFRVSDGLQA被特异性结合。49.丰^fe禾J^求48戶;M的表位，其^i^与至^^^条选自SEQIDNO.3所示肽序列TL1MARLASAASFFGEN、SEQIDNO.4所示肽序列ACEGLTFQVLGTSSGLPV、SEQIDNO.5戶标月W^JVLRGAPGTEVRSFTQAQL、SEQIDNO.6所示肽序列KTGKHDVQVLTAKPRNGL、SEQIDNO.7所示肽序列LTAKP艦LAGDTETFRK、SEQIDNO.8戶际月游列PGGQPDPELLQFCRTPNP的月游列J口口°全文摘要本发明涉及癌症的诊断和治疗，特别涉及对肿瘤细胞的细胞毒性介导；更特别涉及使用癌症缓解性抗体(CDMAB)来启动细胞毒性反应，可根据情况选择与一种或多种化疗剂联合使用。本发明进一步涉及使用本发明CDMAB进行结合分析。文档编号C07K16/00GK101107267SQ200580040303公开日2008年1月16日申请日期2005年3月24日优先权日2004年9月24日发明者大卫·S·F·杨,海伦·P·芬得利,艾莉森·L·费里,苏姗·E·哈恩申请人:阿里乌斯研究公司