专利名称：人黑色素瘤细胞相关的长非编码rna的rna干扰靶点rna及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学专业领域，涉及属于人源IncRNA的一种新型IncRNA、其RNA 干扰(RNA interference, RNAi)靶点序列和短发夹 RNA (short-hairpin RNA, shRNA)序列、 shRNA编码的小分子干扰RNA (small interference RNA, si RNA)、编码shRNA的正义及反义 链DNA、编码shRNA的真核重组质粒、以及在制备诊断黑色素瘤疾病试剂及制备治疗黑色素 瘤疾病药物中的用途。
背景技术：
人体中编码蛋白质的基因大约有2-3万个，仅占人类基因组的2%，其余98%不 编码蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的，是生物体中的垃圾，通常被称为“垃圾 DNA”(junk DNA)。但目前的研究表明，这些垃圾DNA大多可转录产生非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA)。根据成熟转录本大小的不同，ncRNA可分为小分子ncRNA(如siRNA、mi RNA, pi RNA 等)，中等长度 ncRNA (70-200nt)和长 ncRNA (long ncRNA, IncRNA,彡 200nt)。目前， ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA，而对IncRNA的研究还处于起步阶段。由于序列内 部存在过多的终止密码子，IncRNA不能被翻译成蛋白质，他们通常是以RNA转录本的形式 行使其生物学功能，如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇代谢等，越来 越多的证据表明IncRNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现IncRNA 与细胞的癌变有着极为密切的联系，起肿瘤抑制基因作用的IncRNA表达下降或者缺失会 导致肿瘤的发生，已经发现IncRNA与肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴 细胞白血病等肿瘤疾病有关。这些研究结果都表明IncRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥 着重要的作用，肿瘤相关IncRNA的发现可能会对肿瘤的诊断及基因治疗产生重大的影响。 通过大范围分析肿瘤和正常组织的IncRNA，可以鉴定与肿瘤特异相关的IncRNA，使其成为 潜在的病理诊断标记。通过引入针对具有癌基因特性的IncRNA的shRNA可以有效地表达 特异性的siRNA并抑制IncRNA作用的发挥，比其他的治疗手段的毒副作用会更低。相反， 通过病毒载体或质粒载体过表达具有肿瘤抑制基因作用的IncRNA，进而抑制其调控的特定 靶基因的表达，也可以达到抑制肿瘤生长的效果。因此，发现肿瘤特异性表达的IncRNA对 基于IncRNA的肿瘤诊断和治疗具有十分重要的意义。
发明内容
恶性黑色素瘤是一种产生黑色素的高度恶性肿瘤。恶性黑色素瘤多发于欧美白 种人，发病率占全部恶性肿瘤的_3%，但呈明显上升趋势，针对恶性黑色素瘤的诊断和 治疗的生物分子的发现具有重要的应用价值。本发明的目的是提供一种人黑色素瘤细胞 相关相关的长非编码 RNA (long non-coding RNA, IncRNA)-lncRNA_HN3、其 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)靶点 RNA 和短发夹 RNA (short-hairpin RNA, shRNA)、shRNA 编码的小 分子干扰RNA (small interference RNA, siRNA)、编码shRNA的正义及反义链DNA及转录shRNA的重组质粒；本发明的再一目的是提供所述人黑色素瘤细胞相关的IncRNA及shRNA、 siRNA和转录shRNA的重组质粒的用途。本发明以人恶性黑色素瘤细胞yusac为材料进行与PSF蛋白结合的IncRNA分子 的筛选、克隆及分析。采用分子生物学常规技术，从yusac细胞分离获得总RNA，逆转录得到 总cDNA并构建yusac细胞的总cDNA文库；通过原核表达及亲和纯化得到带组氨酸标签的 His-PSF融合蛋白；用T7RNA聚合酶将cDNA文库中的cDNA插入片段体外转录为RNA混合 体；通过组氨酸标签将His-PSF融合蛋白固定于钴离子亲和层析柱上，并将RNA混合体反复 过柱，使能够与PSF蛋白结合的RNA吸附于树脂上；将RNA从树脂上洗脱后，经逆转录构建 cDNA子文库，文库中富集了编码与PSF蛋白结合的RNA的克隆。挑选文库中的克隆测序，获 得基因片段的核酸序列。经过序列分析，我们共得到了数十条RNA分子。经Blast比对及生 物信息学分析，发现一条长236nt的IncRNA序列，其编码序列位于HN基因的3’端转录非 编码区(Untranslated Regions，UTR)，命名为 lncRNA_HN3。此 IncRNA 序列通过 RT-PCR 及 测序的方法获得证实，并构建了这条IncRNA的质粒表达载体。针对获得的IncRNA序列，找 到了 RNAi的靶点序列，构建了表达shRNA序列的质粒载体，当其被导入哺乳动物细胞后可 转录产生shRNA，shRNA分子在细胞内通过酶加工后形成成熟的并发挥RNAi功能的siRNA。 最后，对此IncRNA序列及对应的shRNA序列对人黑色素瘤细胞的恶性生长的影响进行了分 析。本发明所提供的IncRNA序列克隆自人恶性黑色素瘤细胞yusac，定量PCR检测结 果表明此IncRNA在恶性黑色素瘤组织中高表达，而在癌旁组织中低表达。构建lncRNA-HN3 的质粒表达载体，并转染人黑色素瘤细胞yusac，结果表明lncRNA-HN3在黑色素瘤细胞中 的过表达能明显刺激黑色素瘤细胞的恶性生长。构建lncRNA-HN3的shRNA质粒表达载体， 并转染人黑色素瘤细胞yusac，结果表明在黑色素瘤细胞中表达lncRNA-HN3对应的shRNA 能明显降解细胞内源性lncRNA-HN3并抑制黑色素瘤细胞的恶性生长。基于上述工作本发 明得以完成。具体地说，本发明所提供了一种人黑色素瘤细胞相关的长非编码 RNA(lncRNA-HN3)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示，或与序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性，或为序列表中SEQ IDN0 1所示核苷酸序列经硫 代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。基于上述人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA，本发明提供的lncRNA-HN3的RNA 干扰(RNAi)靶点，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :2所示，或与序列表中SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列90%以上同源性，或为序列表中SEQ ID NO :2所示核苷酸序列经硫代 修饰或/和甲氧基修饰得到的序列核苷酸。基于上述lncRNA-HN3RNA干扰(RNAi)靶点，本发明提供的RNAi的短发夹 RNA (shRNA)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :3所示，或与序列表中SEQ ID NO :3所示 的核苷酸序列90%以上同源性，或为序列表中SEQ IDN0 :3所示核苷酸序列经硫代修饰或/ 和甲氧基修饰得到的序列核苷酸。本发明提供的人黑色素瘤细胞相关的的长非编码RNA的RNA干扰靶点的小分子干 扰RNA(siRNA)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :4所示，或与序列表中SEQ ID NO 4 所示的核苷酸序列90%以上同源性，或为序列表中SEQ ID NO :4所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的序列核苷酸。对于上述短发夹RNA (shRNA)的编码正义链DNA和反义链DNA，所述正义链DNA其 核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 5所示，或与序列表中SEQIDN0 5所示的核苷酸序列 90%以上同源性，或为序列表中SEQ ID NO :5所示核苷酸序列经硫代修饰得到的序列核苷 酸；所述反义链DNA其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :6所示，或与序列表中SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列90%以上同源性，或为序列表中SEQ ID NO 6所示核苷酸序列经硫代 修饰得到的序列核苷酸。本发明所述转录短发夹RNA的真核重组质粒，由编码人黑色素瘤细胞相关的长非 编码RNA的RNA干扰靶点的shRNA的正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段 与真核表达载体构建而成。本发明所提供的人源lnCRNA-lnCRNA-HN3的编码DNA序列定位于人线粒体基因组 2710-2945位核苷酸。本发明提供的IncRNA序列，IncRNA的RNAi靶点序列，IncRNA的RNAi靶点的shRNA 序列，RNAi靶点shRNA编码的siRNA序列，及编码shRNA的DNA序列既可通过生物学方法 获得，又可通过化学合成方法获得，若通过化学合成方法制备，只要将其核苷酸序列提供给 有关专业公司，委托其合成即可。为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，可 对其进行硫代修饰或甲氧基修饰等。本发明提供的人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA(lncRNA-HN3)，包括与其90% 以上同源的核苷酸序列，或经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列，可用于制备 诊断黑色素瘤疾病的试剂，并且，其RNAi靶点、RNAi靶点shRNA序列及其表达载体、RNAi 靶点shRNA编码的siRNA可用于制备治疗黑色素瘤疾病的药物。例如以其单独或混合形式 为有效组分配制成非肠道给药制剂，依据给药模式、受者年龄、体重、疾病程度等以适量剂 量给药；也可以采用基因治疗的方法，以质粒或腺病毒为表达载体，使其在癌变部位高效表 达。
图1是定量PCR检测本发明所述lncRNA-HN3在人恶性黑色素瘤组织及癌旁组织 中表达的结果图。图2是对单克隆黑色素瘤细胞株yuSaC-lnCRNA-HN3和转入空真核表达载体 pcDNA-3. 1的对照细胞株yuSac-pcDNA3. 1进行软琼脂集落生长检测的结果图。图3是将单克隆黑色素瘤细胞株yuSaC-lnCRNA-HN3和转入空真核表达载体 pcDNA-3. 1的对照细胞株yuSac-pcDNA3. 1注入裸鼠后的实验结果图，图中，1-1和1-2为第 1只裸鼠的移植瘤，2-1、2-2为第2只裸鼠的移植瘤，3-1、3-2为为第3只裸鼠的移植瘤。图4是本发明所述lncRNA-HN3在对照细胞株yusac-shLUC和稳定低表达细胞株 yusac-shHN3中的表达情况图，图中，1泳道为lncRNA_HN3在对照细胞株yusac-shLUC中的 表达，2泳道为lncRNA-HN3在稳定细胞株yusac_shHN3中的表达。图5是对稳定细胞株yusaC-shHN3和对照细胞株yusac-shLUC进行软琼脂集落生 长检测的结果图。图6是将稳定细胞株yusaC-shHN3和对照细胞株yusac-shLUC注入裸鼠后的实验结果图，图中，1-1和1-2为各实验组中第1只裸鼠的移植瘤，2-1,2-2为各实验组中第2只 裸鼠的移植瘤，3-1、3-2为各实验组中第3只裸鼠的移植瘤。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步说明。下属实施例中，凡未注明具体实验条件 的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等著的分子克隆实验室手 册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)，Freshney 著的动物细胞培 养基本技术指南第五版(John ffiley&Sons, Inc,2005)中所述的条件及实验步骤，或按照 制造厂商所建议的条件及实验步骤。实施例1 :lncRNA_HN3的克隆与分析1、试剂Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；匪LV逆转录酶、DNA聚合酶、pfu酶、Nde I酶、Xho I酶、RNase抑制剂均购自立陶宛Fermentas公司；T7RNA聚合酶购自美国NEB公 司；随机引物购自美国Promega公司；TAL0N金属离子树脂购自美国BD Clontech公司；PCR 引物由Invitrogen公司合成。2、菌株、细胞株和载体人恶性黑色素瘤细胞yusac购自美国标准菌种收藏所(ATCC) ；E. coli BL2菌株购 自天津天有利科技有限公司；PCR-blunt-TOPO载体购自美国Invitrogen公司；pET_28a(+) 载体购自德国Novagen公司。3、实验方法3. 1人恶性黑色素瘤细胞yusac总cDNA文库的构建3. 1. 1 yusac 细胞总 RNA 的提取1)人恶性黑色素瘤细胞yusac培养至75%汇合度，加入lmL Trizol试剂，用枪头 吹打混勻；2)用5mL 1次性注射器吹打10次进行勻浆，将勻浆样品在室温孵育5min ；3)加0. 2mL氯仿，盖紧Ep管盖，用手振荡15s并于室温孵育2-3min ；4)41，12，000\8离心15111土11;5)将水相层转移到1干净的1. 5mLEp管中，加入0. 5mL异丙醇及20 y g糖原，颠倒 混勻，将混勻后的样品于室温孵育lOmin ；6)4°C，12，000Xg离心lOmin。倒掉上清液，用75%的乙醇lmL洗涤RNA沉淀1-2 次，旋涡振荡混合样品后，4°C，7，500 X g离心5min ；
7)倒掉乙醇，常温干燥RNA沉淀lOmin，加入50 y L无RNA酶的H20，并于55°C孵 育5min，以使RNA充分溶解，于260nm测定RNA浓度。3. 1. 2 逆转录(RT)在500 ii L EP管中加入以下组分yusac 细胞 RNA 10 u L随机引物(10u mol/L) 1 u LH20 18 U L混勻后70°C温育5min，迅速置冰浴中，静置3min后加样如下
RNase 抑制剂 1 ii LdNTP (1 Ommo 1/L) 1 u L5 X逆转录酶缓冲液8 ii LMMLV 逆转录酶 1 ii L混勻后42°C温育lh，70°C lOmin灭活逆转录酶，_20°C保存样品。3. 1. 3yusac细胞总cDNA文库的构建将本实施例3. 1. 2所得单链cDNA经DNA聚合酶及pfu酶处理得到平末端双 链cDNA(操作步骤见DNA聚合酶、pfu酶操作手册)。所得平末端双链cDNA连接到 PCR-blunt-TOPO载体上，构建yusac细胞总cDNA文库。3. 2带组氨酸标签His-PSF融合蛋白的原核表达及亲和纯化3. 2. 1多聚酶链式反应(PCR)扩增PSF基因的编码序列(Coding Sequence, CDS)反应体系为PCR 缓冲液(10X)5u LMgCl2 (2. 5m mo 1/L) 2. 5 u LdNTP(2. 5m mo 1/L) 1. Ou L上游引物(10iimol/L)0.5ii L下游引物(10iimol/L)0.5ii LpcDNA3. 1-PSF (连接位点为 EcoR I 和 EcoRV) 0. 1 u LTaq DNA 聚合酶(5U/ u L)0. 1 u LPfu DNA 聚合酶(5U/ u L)0. 3u LddH20 40 u L矿物油30 ii L反应参数为94°C lmin (预变性)；94 V 30sec (变性)，65 V 30sec (复性)， 72°C 2min (延伸)，所述变性_复性_延伸23个循环；72°C lOmin (终延伸)。引物序列如下上游引物(FP):5，ATATTACCATATGTCTCGGGATCGGTTCCGG-3，(下划线标示 Nde I 酶 切位点)下游引物(RP):5，-GGGCTCGAGCTAAAATCGGGGTTTTTTGTT-3，(下划线标示 Xho I 酶 切位点)3. 2. 2His-PSF融合蛋白的原核表达载体的构建将PSF的编码序列通过Nde I和Xho I酶切位点克隆到原核表达载体pET_28a (+) 的多克隆位点区，得到重组质粒pET-28a(+)-PSF(载体多克隆位点区末端自带组氨酸His 标签)。3. 2. 3His-PSF融合蛋白的原核表达1)将本实施例3. 2. 2所得重组质粒pET-28a(+)_PSF转化到E. coli BL21菌株中；2)接种转化了重组质粒pET-28a(+)_PSF的E. coli BL21单菌落于LB液体培养基 (含50i!g/ml卡那霉素)中，37°C震荡培养；3)检测菌液0D6(K1至0. 6-0. 7时加入1. 0mmol/L IPTG，并将温度调至25°C，诱导培 养过夜。
3. 2. 4His-PSF融合蛋白的亲和纯化1)离心收集菌体，菌体经 PBS 缓冲液(140mmol/L NaCl,2. 7mmol/L KC1,5mmol/LNa2HP04,1. 8mmol/LKH2P04 及 5mmol/LEDTA，pH7. 2)洗涤后重新悬浮于 20mL PBS (含 0. 5mol/L NaCl, lmmol/L PMSF 及 lmmol/L DTT)；2)冰浴超声破壁，13，OOOXg离心30min收集上清；3)沉淀以相同步骤重复处理一次，合并两次上清收集液，得到蛋白粗提液；4)将TAL0N金属离子亲和树脂(BD Clontech)用平衡-洗涤缓冲液(250mmol/ LNa3P04,1. 5mol/LNaCl, pH7. 0)预平衡；5)加适量蛋白粗提液于预平衡后的TAL0N金属离子亲和树脂，轻柔摇晃1. 5hrs ；6)加入平衡-洗涤缓冲液(含有lOmmol/L咪唑)洗涤树脂两次；7)用平衡-洗涤缓冲液(含有250mmol/L咪唑)洗脱树脂上结合的His_PSF重组 蛋白；8)洗脱得到的重组蛋白用50倍体积的透析缓冲液(20mM Hepes,20% glycerol, 100mM KC1，0. 2mM EDTA，0. 2mM PMSF，0. 5mM DTT, pH7. 9)在 4°C透析过夜，中途更换透析缓 冲液一次；9)得到的透析产物用液氮速冻，lhrs后长期冻存于-80°C ；3. 3PSF蛋白结合RNA的筛选及编码PSF结合RNA的cDNA子文库的构建利用组氨酸标签将原核重组质粒表达的His-PSF融合蛋白结合于TAL0N金属离子 树脂上，用T7RNA聚合酶将yusac细胞总cDNA文库中的cDNA插入片段体外转录为RNA混 合体，RNA混合体通过5次反复过柱，使能够与His-PSF蛋白结合的RNA吸附于树脂上；将 RNA从树脂上洗脱，逆转录合成cDNA，将cDNA连接到PCR-blunt-TOPO载体(Invitrogen) 上构建cDNA子文库，文库中富集了编码与His-PSF蛋白结合的RNA的克隆，挑取阳性克隆 克隆测序。3. 4所获克隆序列的分析克隆测序获得序列对人基因组序列(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/blast)进 行BLAST分析，并找到它们在人染色体上的精确定位(http://genome.ucsc. edu/)。挑选出 彡200bp且位于基因组非蛋白质编码区的序列。其中获得一条236nt的IncRNA序列，其序 列如序列表中SEQ ID NO 1所示，定位于线粒体基因组的2710-2945位核苷酸，由HN基因 的3’ UTR编码，命名为lncRNA-HN3。3. 51ncRNA-HN3 的 RT-PCR 鉴定使用Trizol试剂从人恶性黑色素瘤组织提取总RNA (方法同本实施例3. 1. 1)，按 照常规RT-PCR方法检测lncRNA-HN3在人恶性黑色素瘤组织中的表达。3. 5. 1RT (方法同本实施例3. 1. 2)获得黑色素瘤组织cDNA3.5.2PCR反应体系为PCR 缓冲液(10 X) 2. 5 ii LdNTP(2. 5mmol/L) 1. 0u L上游引物(10u mol/L) 1. 0u L下游引物(10u mol/L) 1. 0u L
黑色素瘤组织cDNA 0. 3u LDNA 聚合酶(5U/ u L)0. 2u LddH20 19 u L反应参数均为:94°C3min (预变性)；94°C 30sec (变性)，64 °C 30sec (复性)， 72°C 60sec (延伸)，所述变性-复性-延伸30次循环。引物序列如下5' -cacagcaagacgagaagaccc-3‘5， -cgctgttatccctagggtaac-3，RT-PCR扩增获得的序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。实施例2 定量PCR检测lncRNA-HN3在人恶性黑色素瘤组织及癌旁组织中的表达1、试剂、菌株、细胞株和载体采用常规的试剂、菌株、细胞株和载体，均与实施例1相同。QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒购自德国 Qiagen 公司。2、实验方法2. 1. 1 合成的总 cDNA以人黑色素瘤组织及对应癌旁组织为材料，用Trizol试剂(Invitrogen)分别提 取黑色素瘤组织及对应癌旁组织的总RNA(方法同实施例1中的3. 1. 1)。将黑色素瘤组织 总RNA和对应癌旁组织总RNA各取1 y g，用随机引物进行逆转录反应(方法同实施例1中 的3. 1. 2)获黑色素瘤组织及对应癌旁组织的总cDNA，合成的黑色素瘤组织及对应癌旁组 织的总cDNA即为定量PCR反应的模板。2. 1. 2 用 QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒进行定量 PCR 反应以本实施例2. 1. 1所得黑色素瘤组织及对应癌旁组织的总cDNA为PCR反应的模 板，设计特异于lncRNA_HN3序列的引物(引物序列为5’ -gcaagacgagaagaccctatg-3’和 5，-agtagttcgctttgactggtga-3，)，用 QuantiTect SYBR Green POU式剂盒进行定量 PCR反应。2. 1.3实验结果黑色素瘤组织及癌旁组织lncRNA-HN3的表达情况见图1，图1中1，3，5，7为对应 的黑色素瘤癌旁组织；2，4，6，8为黑色素瘤组织。从图1可以看出，lncRNA-HN3在黑色素瘤 组织中高表达而在癌旁组织中低表达。实验结果表明，lncRNA-HN3在黑色素瘤组织和癌旁 组织中的表达水平存在明显差异，因而lncRNA-HN3在黑色素瘤的发生发展过程中具有重 要的生物学功能。实施例3 :lncRNA-HN3的过量表达促进黑色素瘤细胞的恶性生长特性1、试剂、菌株、细胞株和载体采用常规的试剂、菌株、细胞株和载体，与实施例1相同。pcDNA-3. 1真核表达载体、lipofectamine 2000转染试剂、G418抗生素均购自美 国Invitrogen公司；DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibico公司；硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium, NBT)购自美国 Sigma 公司。Perfection 4990平板式扫描仪购自日本Epson公司。BALB/c裸鼠，SPF(Specific Pathogen-free，无特定病原体)级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。2、实验方法2. 1稳定高表达lncRNA-HN3的单克隆细胞株的构建2. 1. 1 构建 lncRNA-HN3 的真核重组质粒 pcDNA-lncRNA_HN3将原本克隆于PCR-blunt-TOPO载体上的编码lncRNA_HN3的DNA序列(由实施例 1的3. 3和3. 4获得)重新连接到真核表达载体pcDNA-3. 1的Nhe I和Apa I酶切位点，构 建 lncRNA-HN3 的真核重组质粒 pcDNA_lncRNA_HN3。2. 1. 2构建单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA_HN3用含10 %胎牛血清的DMEM培养基将人黑色素瘤细胞yusac培养于5 % C02的37°C 培养箱中。转染前一天于6孔板中接入IX 106个细胞/孔，用lipofectamindOOO进行转 染，每孔转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-HN3 3 u g。细胞转染24小时后用浓度为700mg/ L的G418连续筛选1-2周，得到稳定转染的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-HN3。同 时以空载体pcDNA-3. 1稳定转染yusac细胞(见lipofectamine 2000说明书)，得到对照 细胞株 yusac-pcDNA3. 1。2. 1. 3单克隆黑色素瘤细胞株中lncRNA-HN3的表达量检测以常规半定量RT-PCR检测各单克隆黑色素瘤细胞株中lncRNA-HN3的表达量，挑 选得到lncRNA-HN3表达量最高的稳定黑色素瘤细胞株yuSac-lncRNA-HN3。并以转入空真 核表达载体pcDNA-3. 1的黑色素瘤细胞株yuSac-pcDNA3. 1作为对照。50iiL半定量PCR反应体系，其组分为PCR 缓冲液(10X)5ii LMgCl2 (25mM) 5 u LdNTP(2. 5mmol/L) 1. Oil L上游引物(10iimol/L)0.5ii L下游引物(10iimol/L)0.5ii L模板(yusac-lncRNA_HN3 或 yusac_pcDNA3. 1 的 cDNA) 2 u LDNA 聚合酶(5U/ u L)0. 4u LddH20 35. 6 u L所有PCR的反应参数为:94°C 3min (预变性)；94°C 30ec (变性)，64°C 30s ec (复 性)，72°C60sec(延伸)，所述变性-复性-延伸Xn cycles.循环次数根据PCR反应的起 跳点确定，一般情况下，每次具体的PCR反应较起跳点多1-2个循环。2. 2软琼脂集落生长检测在6孔板中用lmL含0.6%琼脂糖、700mg/LG418及10%胎牛血清的DMEM培养 基铺设下层琼脂；待下层琼脂凝固后，将本实施例2. 1. 2构建的单克隆黑色素瘤细胞株 yusac-lncRNA-HN3和转入空真核表达载体pcDNA-3. 1的黑色素瘤细胞株分别以5X 103个 细胞/孔的数量接入lmL含0. 3%琼脂糖、700mg/LG418及10%胎牛血清的DMEM培养基， 混勻后铺设上层琼脂；待上层琼脂凝固后，培养于5% C02的37°C培养箱中培养。2周后，加 A 400 u L 1. 25g/L 的硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium,NBT)染色液，置于 5%0)2的 37°C培养箱中孵育过夜，透射扫描仪扫描的图像见图2。图2表明，与转染空真核表达载体pcDNA-3. 1的yusac细胞相比，转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-HN3的yusac细胞稳定过量表达lncRNA_HN3可以显著促进黑色素瘤细胞 yusac的集落性生长，增强了 yusac细胞的体外恶性生长特性。2. 3裸鼠移植瘤生长检测实验裸鼠为5周龄裸鼠，分成两组，每组3只，一组用于注射本实施例2. 1. 2构建 的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-HN3，一组用于注射本实施例2. 1. 2构建的转入空 真核表达载体pcDNA-3. 1的对照黑色素瘤细胞株yuSac-pcDNA3. 1。将单克隆黑色素瘤细胞株yuSaC-lnCRNA-HN3和对照黑色素瘤细胞株 yusac-pcDNA3. 1分别以5X 105个细胞/注射点的剂量对裸鼠进行颈部皮下注射(每只裸 鼠2个注射点)，待移植瘤长出后，每3天检测一次大小，移植瘤长出后约一个月，将裸鼠脱 颈椎处死，取出肿瘤，3只裸鼠移植瘤的照片见图3。图3表明，与转染空真核表达载体pcDNA-3. 1的yusac细胞相比，转染真核重组质 粒pcDNA-lncRNA-HN3的yusac细胞稳定过量表达lncRNA_HN3可以显著促进黑色素瘤细胞 yusac的体内成瘤性，增强了 yusac细胞的体内恶性生长特性。实施例4 :lncRNA-HN3特异性shRNA抑制黑色素瘤细胞的恶性生长特性1试剂、菌株、细胞株和载体采用常规的试剂、菌株、细胞株和载体，与实施例1相同。正义链DNA和反义链DNA模板由美国Invitrogen公司合成；限制性内切酶BamH I 和Hindlll均购自立陶宛Fermentas公司；真核表达载体pGenesil_l购自武汉赛晶公司。2、实验方法2. llncRNA-HN3特异性RNA干扰载体的构建将lncRNA-HN3的序列信息提交siRNA互联网设计工具(www. dharmacon. com)，获 得可信度最高的RNAi靶点序列(如序列表中SEQ IDN0 :2所示)。根据lnCRNA_HN3的RNAi 靶点序列设计编码特异性shRNA分子的正义链DNA和反义链DNA模板(如序列表中SEQ ID NO :5和SEQ ID NO 6所示)，将所述正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段 克隆进RNA干扰载体pGenesil-1，构建lncRNA_HN3干扰重组质粒。将构建好的lncRNA_HN3 干扰重组质粒导入哺乳动物细胞后，能在其中转录出shRNA(如序列表中SEQ ID NO 3所 示)，shRNA在动物细胞内被动物细胞固有的Dicer酶进一步切割形成具有RNA干扰功能的 siRNA (如序列表中SEQ ID NO 4所示)，从而诱导RNA干扰程序的启动。正义链DNA和反 义链DNA模板序列如下1)编码 lncRNA-HN3RNAi 靶点 shRNA 的正义链 DNA 5' - IGATCC丨 acaaRttaccctaRRRataTTCAAGAGATATCCCTAGGGTAACTTGTTTTTTT @ -3'2)编码 lncRNA-HN3RNAi 靶点 shRNA 的反义链 DNA 5 ‘ - lAGCTTl AAAAAAacaaRttaccctaRRRataTCTCTTGAATATCCCTAGGGTAACTTGT g -3'序列中下划线部分为靶基因的RNAi靶点序列及相应互补序列；方框部分为限制 性内切酶BamH I和Hindlll的识别位点，用于退火后形成的双链DNA片段克隆进RNA干扰 载体；中间未标示部分编码shRNA的茎环(loop)。2. 1. 1正义链DNA和反义链DNA的退火
11
将编码lncRNA-HN3RNAi靶点shRNA的正义链DNA和反义链DNA片段浓度分别调整 为250iiM，退火形成互补双链DNA分子(经退火处理后5，及3，端分别带有BamH I/HindIII 酶切位点)。退火反应条件如下
shRNA-S 模板(250 u M) 5 u LshRNA-A 模板(250 u M) 5 u L10X 退火缓冲液(lOOmM Tris-HCl, pH7. 5, lOmM EDTA, lMNaCl) 1. 25 u LH20 1. 25u L混勻，石蜡油覆盖后离心10seC，95°C温育5min，经1_2小时缓慢降温至室温，此时 两条寡核苷酸精确退火为寡核苷酸双链(浓度为100 yM)；退火后的双链DNA用灭菌水稀 释100倍，浓度为liiM。2.1.2构建lncRNA_HN3干扰重组质粒将退火形成的双链DNA片段连接到RNA干扰载体pGenesil-1的BamH I/HindIII 酶切位点，构建lncRNA-HN3特异性shRNA的真核重组质粒pGenesil-shHN3。连接反应条件 如下pGenesil 载体(约 0. 005 u M) 10 u L双链DNA(liiM)0. 5iiL10 X连接酶缓冲液2 ii LH20 5. 5 U L连接酶2iiL混勻，离心5sec，16°C连接过夜，70°C lOmin灭活连接酶，_20°C保存样。2. 1. 3构建作为负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC构建作为负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC的方法同本实施例2. 1. 1 和2. 1. 2。将负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC导入哺乳动物细胞后转录出萤火 虫荧光素酶基因luciferase特异的shRNA-shLUC，其编码DNA序列的正义及反义链分别为5 ‘ - |gatcc| gtagcgcggtgtattatacttcaagagagtataatacaccgcgctactttttt § _3 ‘5 ‘ ~ |agctt| aaaaaagtagcgcggtgtattatactctcttgaagtataatacaccgcgctac ^ ~3 ‘ a2. 2稳定低表达lncRNA-HN3的单克隆细胞株的构建同实施例3中的2. 1. 2所述方法将获得的真核重组质粒pGeneSil-ShHN3稳定 转染人黑色素瘤细胞yusac，经G418筛选、半定量RT-PCR检测后，获得lnCRNA_HN3表达 量最低、RNAi效果最好的稳定细胞株yusac-shHN3。同时，以负对照的RNA干扰重组质粒 pGenesil-shLUC转染yusac细胞，得到对照细胞株yusac-shLUC。lncRNA_HN3在对照细胞 株和稳定低表达细胞株中的表达情况见图4。图中(1)为对照细胞株yusac-shLUC，(2)为 稳定细胞株yusac-shHN3。图4表明，稳定细胞株中lncRNA_HN3的表达量较对照细胞株 明显降低，说明选用的RNAi靶点序列正确无误，shRNA诱导的RNAi效果明显，稳定低表达 lncRNA-HN3的单克隆细胞株构建成功。2. 3软琼脂集落生长检测同实施例3中的2. 2所述方法对稳定细胞株yUSaC-ShHN3进行软琼脂集落生长 检测(细胞接种量为1X104个细胞/孔)。结果见图5。由图5可知，转染真核重组质粒 pGenesil-shHN3降解yusac细胞内源性lncRNA_HN3后，yusac细胞的集落性生长受到了一定程度的抑制，其体外恶性生长特性减弱，而转染对照重组质粒pGenesil-shLUC对yusac 细胞的体外恶性生长特性没有影响。这表明lncRNA-HN3特异性的shRNA对黑色素瘤细胞 的生长具有抑制作用，并具有治疗黑色素瘤疾病的用途。2. 4裸鼠移植瘤生长检测同实施例3中的2. 3所述方法对yuSaC-ShHN3细胞株进行裸鼠移植瘤生长检测 (细胞注射剂量为2X106个细胞/注射点)。结果见图6。由图6可知，转染真核重组质粒 pGenesil-shHN3降解yusac细胞内源性lncRNA_HN3后，yusac细胞的体内成瘤性受到了 一定程度的抑制，其体内恶性生长特性减弱，而转染对照真核重组质粒PGenesil-shLUC对 yusac细胞的体内恶性生长特性没有影响。这进一步表明lncRNA-HN3特异性的shRNA对黑 色素瘤的发生发展具有抑制作用，具有治疗黑色素瘤相关疾病的用途。
权利要求
一种人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA的RNA干扰靶点RNA，其特征在于干扰靶点RNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO2所示。
2.—种权利要求1所述的人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA的RNA干扰靶点RNA的 短发夹RNA，其特征在于短发夹RNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。
3.—种权利要求1所述人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA的RNA干扰靶点的小分子 干扰RNA，其特征在于小分子干扰RNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4所示。
4.一种编码权利要求2所述短发夹RNA的正义链DNA，其特征在于正义链DNA的核苷 酸序列如序列表中SEQ ID NO 5所示。
5.一种编码权利要求2所述短发夹RNA的反义链DNA，其特征在于反义链DNA的核苷 酸序列如序列表中SEQ ID NO 6所示。
6.一种转录权利要求3所述短发夹RNA的真核重组质粒，其特征在于含有权利要求4 所述正义链DNA和权利要求5所述反义链DNA退火后形成的双链DNA片段。
7.权利要求1所述干扰靶点RNA、权利要求2所述的短发夹RNA、权利要求3所述的小 分子干扰RNA、权利要求4所述的正义链DNA、权利要求5所述的反义链DNA或/和权利要 求6所述的真核重组质粒在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA的RNA干扰靶点RNA及用途，具体提供了人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA的RNA干扰靶点RNA(RNA interference，RNAi)，干扰靶点的短发夹RNA(short-hairpin RNA，shRNA)、shRNA编码的小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)、编码shRNA的正义链DNA及反义链DNA、编码shRNA的重组质粒，以及它们在制备治疗黑色素瘤疾病药物中的用途。
文档编号C12N15/11GK101984056SQ20101054405
公开日2011年3月9日 申请日期2009年7月10日 优先权日2009年7月10日
发明者俸婷婷, 宋旭, 张广丰, 李灵, 连莹莹 申请人:四川大学