一种杂交瘤细胞株、鼠抗人β-tubulin-3单克隆抗体及其免疫组化试剂盒和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种杂交瘤细胞株、鼠抗人β-tubulin-3单克隆抗体及其免疫组化试剂盒和应用，该杂交瘤细胞株所分泌的抗体可用于人非小细胞肺癌细胞β-tubulin-3抗原的检测，根据β-tubulin-3的表达量可以作为非小细胞肺癌患者紫杉醇化疗耐受性的用药依据。本发明敏感性较好，特异性高，检测方法稳定高效，适用于一般技术人员操作。
【专利说明】—种杂交瘤细胞株、鼠抗人β -tubulin-3单克隆抗体及其免疫组化试剂盒和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种杂交瘤细胞株、鼠抗人β -tubulin-3单克隆抗体及其免疫组化试剂盒和应用，用于医学研究和检测非小细胞肺癌患者化疗时针对紫杉醇的耐受性，指导临床用药。
【背景技术】
[0002]肺癌是肿瘤导致死亡的最常见原因，其中约80%为非小细胞肺癌(non smallcell lung cancer, NSCLC),在新诊断的患者中，有65%已不能行手术治疗，因此化疗是肺癌的主要治疗手段之一，但治疗的有效率仅为20%?40%，中位生存期不足10个月。随着第3代化疗药物的出现和应用，肺癌的治疗效果有了进一步的提高，但并未取得突破性进展，而这些第3代化疗药物与钼类联合的化疗疗效似乎已经达到一个平台。随着对功能性基因组研究的深入，近年来提出了肿瘤个体化治疗的新理念，在2009年美国临床肿瘤学会(ASCO)年会中提出NSCLC治疗更应遵循这一原则。个体化治疗是根据肿瘤生物学和药物基因组学的改变进行针对性治疗。这是建立在循证医学基础上，从而在分子、蛋白、基因水平上指导肺癌治疗，是目前肺癌治疗的理想之路。
[0003]微管蛋白(tubulin)不仅是细胞骨架和纺锤体的主要成分，而且是紫杉醇作用的位点，与紫杉醇的获得性耐药也密切相关。目前在真核物中已经确定的微管蛋白有7种，其中a-tubulin和β-tubulin是微管结构的主要组成,在真核生物细胞中普遍存在,并且高度保守性。一些 基础和临床研究证实，β-tubulin-3的表达与紫杉醇化疗敏感性相关，可作为一些实体肿瘤(肺癌、卵巢癌、前列腺癌乳腺癌、不明原发部位的肿瘤)预后的评价指标° Dumontet 等(P Seve, C Dumontet.1s class III beta-tubulin a predictivefactor in patients receiving tubulin-binding agents.The Lancet Oncology.2008)在19例NSCLC患者β-1ubulin III表达与预后关系的研究中发现，β-Tubulin III高水平表达患者的无疾病生存期为41d，明显低于β-1ubulin III低表达者的288d。在9例高表达β-1ubulin III患者中仅有2例对化疗敏感(22% )，而在低水平表达的患者中化疗敏感率为60% (6/10)，提示接受以紫杉醇为基础化疗方案的NSCLC患者，β-1ubulinIII表达增高可能表示预后不良，而β-1ubulin III表达降低则对紫杉醇敏感性增加。Seve等研究也得到类似结果，β - tubulin高表达与紫杉醇耐药有关。Azuma等(AzumaK,Sasada T,Kawahara A, et al.Expression ofERCCI and class III beta-tubulin innon-small cell lungcancer patients treated with carboplatin and paclitaxel.Lung Cancer.2009)用免疫组化的方法检测了 45例接受紫杉醇联合卡钼化疗的复发NSCLC的ERCC I和β-tubulin III表达情况，发现二者各自的低表达均与高有效率和延长无疾病生存期有关，而且两者均阴性者从化疗中的获益更明显。另外，β-tubulin III的表达水平不与任何临床和病理特点相关。
[0004]随着功能性基因组学的发展，人们对癌变机制和肿瘤治疗机制有了更深层次的理解。选择安全有效的治疗方法，实现肺癌个体化治疗，让患者生存时间更长，生活质量更好，是肺癌治疗的一种必然趋势。个体化化疗在NSCLC治疗中已经显示良好的效果和应用前景，代表了肿瘤化疗的发展方向，已在肿瘤界获得广泛肯定，给肿瘤治疗带来曙光。
[0005]基于上述研究， 申请人:采用传统杂交瘤法研发出针对β-tubulin-3的单克隆抗体及其免疫组化试剂盒。该试剂盒能对肺癌患者进行β -tubulin-3诊断,对于确定正确的治疗方案和降低死亡率具有巨大的社会经济意义。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是:提供一种鼠抗人β -tubulin-3单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体，可以为非小细胞肺癌患者在使用紫杉醇化疗时提供临床依据及个体化诊疗方案，以减少患者由于盲目用药而造成的经济损失，以及避免由于错误用药而引起的生理伤害和病情延误。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明人通过大量实验研究并探索，最终获得了如下技术方案:
一种鼠抗人β-tubulin-3单克隆抗体杂交瘤细胞 系2E7，于2013年7月11日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2013106。
[0008]所述杂交瘤细胞株2E7分泌的能够特异结合β-tubulin-3抗原分子的鼠抗人β -tubulin-3单克隆抗体。
[0009]优选地,所述单克隆抗体的结合表位位于人类β-tubulin-3抗原的构象表位。
[0010]一种能够检测非小细胞肺癌细胞β -tubulin-3表达量的免疫组化试剂盒，其中所述试剂盒包括上述的鼠抗人β -tubulin-3单克隆抗体。
[0011]上述的鼠抗人β-tubulin-3单克隆抗体在制备非小细胞肺癌诊断试剂或治疗药物中的应用。
[0012]与现有技术相比，本发明涉及的单克隆抗体及其免疫组化试剂盒具有如下优点和显著的进步:
1、敏感:本发明敏感性较好，由于在检测过程中使用了生物素亲和素放大系统，标本染色后，阳性强度可以达到++++，符合临床检测标准。
[0013]2、特异:鉴于该单克隆抗体是由多肽半抗原免疫制备获得，能够精确定位在β -tubulin-3特异性ESESQGPK位点上，临床前样本检测结果显示其能够很好的识别胞浆中的抗原。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1本发明用于非小细胞肺癌腺癌患者免疫组化实验的图片；图示结果显示胞浆为阳性，微管蛋白在胞浆表达。
[0015]图2本发明用于非小细胞肺癌鳞癌患者免疫组化实验的图片；图示结果显示胞浆为阳性，微管蛋白在胞浆表达。
[0016]图3纯化后抗体western blot检测结果图。
【具体实施方式】[0017]以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
[0018]本发明使用β -tubulin-3上的表面活性多肽位点ESESQGPK进行半抗原偶联制备抗原，然后免疫获得稳定分泌抗人β -tubulin-3分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由此获得的单克隆抗体经过生物素偶联羊抗小鼠IgM，SA-HRP, DAB显色液和苏木素复染液组成SAP法检测非小细胞肺癌的免疫组化试剂盒。
[0019]一、鼠抗人β-tubulin-3单克隆抗体的制备
1、由上海吉尔生化合成多肽ESESQGPK，使用戊二醛法分别使用载体蛋白BSA和OVA进行偶联半抗原，使用BSA偶联多肽进行免疫，免疫BABL/C小鼠(5_7周龄，购自中科院病毒所)，免疫方法为:每次免疫注射100μ8抗原(皮下免疫)，首次免疫使用完全弗氏佐剂进行乳化，之后免疫使用不完全佐剂进行乳化，隔两周进行一次免疫，共计四次免疫，第四次免疫后采血效价为8000，融合前三天进行腹腔加强免疫。
[0020]2、SP2/0细胞购自武汉大学微生物保藏中心，融合前三天进行细胞复苏，取免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞系融合，融合剂采用PEG (sigma, 1450)。
[0021]3、细胞融合后第四天换一次半液，第八天换一次全液，使用OVA偶联多肽包被以及裸肽包被进行ELISA筛选阳性细胞株，得到分泌鼠抗人β-tubulin-3单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 申请人:命名为鼠抗人β-tubulin-3单克隆抗体杂交瘤细胞系2E7，该细胞株在实验室连续培养一年以后分泌抗体效价未降低，该细胞株于2013年7月11日保藏于中国武汉大学的中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2013106。
[0022]4、有限稀释3次，取阳性单克隆细胞株扩大培养并进行腹水制备。提前一周注射不完全佐剂进行腹腔致敏，注射大约IO6个单克隆细胞。十天后取腹水，使用多肽直接包被进行检测腹水效价。腹水效价在1:100000倍稀释后ELISA检测效价大于1.0.5、抗纯化采用忧球蛋白沉淀法，先使用二氧化硅进行预处理。将腹水在4°C蒸馏水中透析8?15 h, 12 000 r/min离心15 min,收集沉淀蛋白，重新溶解于I mol/L NaCl/0.1mol/L Tris-HCl pH8.0的缓冲液中，立即进行凝胶过滤或_20°C冻存。凝胶过滤:先用10mmol/L Tris-HCl ρΗ8.0缓冲液平衡SuperdexTM-200 prepgrade预装柱,将硫酸铵沉淀或优球蛋白沉淀收集的I ml样品上样，用1.5 mol/L NaCl/10 mmol/L Tris-HCl pH8.0的缓冲液进行洗脱，洗脱流速控制在I?2 ml/min。收集的洗脱峰分装冻至_20°C。
[0023]6、化后抗体进行SDS-PAGE,高效液相，ELISA, western blot免疫组化鉴定。SDS-PAGE显示其处于55KD处，与文献报道相符，高效液相检测其纯度超过90%，ELISA检测结果，效价在1:40000倍稀释后效价大于1.0，说明纯化效果良好。
[0024]7、Western blot实验使用了 HELA细胞以及非小细胞肺癌A549细胞，细胞由武汉大学保藏中心提供，将经过复苏培养后获得的细胞使用细胞裂解液裂解后12000离心，以获得细胞中的蛋白，用电泳缓冲液处理后进行12%的SDS-PAGE跑胶，转膜:切掉浓缩胶，切掉分离胶左上角作为方向标记。裁下一张与凝胶大小相同的硝酸纤维素滤膜及6张滤纸，同样切去膜一角作标记，覆盖在胶上，用玻璃棒赶去气泡，两侧分别夹有滤纸(每侧3张)和多孔性垫片，然后将有膜的那面置于正极装入电转印槽中，正确接入正、负电极，于4°C100mA，转印90min。封闭:取出硝酸纤维素滤膜，面向上平铺于平皿中，加入含5%脱脂牛奶的PBS进行封闭，4°C封闭过夜。按实验需要将膜进行裁剪，加入第一抗体:用0.2%BSA稀释一抗，室温下轻摇2h。洗涤:将膜取出，加入约IOml漂洗液室温下进行振荡漂洗，重复3-5次，每次5min。第二抗体结合:将NC膜取出再置入另一平皿中，加入用封闭缓冲液1:800稀释的二抗(博士德公司HRP标记的羊抗兔IgG)，缓冲液的量仅需浸没NC膜即可，室温振荡孵育lh。洗涤:将膜取出，加入约IOml漂洗液室温下进行振荡漂洗，重复5次，每次5min。显色反应:倾去漂洗液，滴加新配制的DAB显色液，避光5-10min后观察结果，显色充分后用水终止反应。
[0025]8、取用人非小细胞肺癌的腺癌以及鳞癌组织进行免疫组化实验，所用组织石蜡块由武汉大学中南医院获得，常规免疫组化实验，在20份非小细胞肺癌鳞癌组织，20份非小细胞肺癌腺癌组织以及20份非小细胞肺癌实验，结果显示其阳性率与国外文献相吻合，适用于非小细胞肺癌紫杉醇耐受性检测。具体步骤为:制作石蜡切片，并烘片。为了防止脱片，需使用APES，即氨丙基三乙氧基硅烷或多聚赖氨酸处理的载玻片。脱蜡至水。抗原修复:热修复将柠檬酸缓冲液放入微波炉中预热3min，再将载玻片进入柠檬酸缓冲液中，在高压锅中待喷发蒸汽时计时3.5min。。冷却(热修复过后，使其自然冷却至室温，或者用冷水使其冷却)。将冷却后的载玻片浸泡在PBS中，依次取出玻片置于板子上，用PBS浸洗2次，每次5min，再擦干。加一抗工作液，使之覆盖整个标本，37°C孵育lh，注意保持湿度。(在放置载玻片的木板中盛放一层自来水，自来水层位于载玻片一下，玻片上的组织过于干燥会造成非特异性染色增多，同时由于干燥抗体浓度增大也会造成非特异性染色。在37°C时，孵育时间常为lh，也可以在室温中进行，同时根据抗体的效价及检测方法的灵敏度适当延长或缩短时间，在4°C冰箱中过夜18h)用0.01mol/L PBS冲洗3次，擦干。加二抗，即同时针对小鼠和兔的二抗。覆盖整个标本，37°C孵育15min，倘若在室温下进行，可适当延长孵育时间。注意保持湿度。DAB显色，5?lOmin，(Iml DAB底物缓冲液中滴加I滴DAB显色液中，充分混匀后滴加到标本上，覆盖整个标本)。(一般显色反应在室温中进行5-15mn，或在反应过程中用显微镜观察显色效果来准确的控制显色时间，使得特异性显色反应最强，而背景基本不着色)。显色完成后，用自来水洗.去显色剂，洗2次，每次5min。苏木素(新配)(一般新配制的苏木素染液染色效果好，所需时间较短，如若重复使用，则在复染之前，先用几张滤纸将苏木素表层吸附掉，因为表层容易被氧化，然后再将载玻片浸入其中)复染15s，自来水洗2次。梯度酒精脱水(80%、无水乙醇)，90°C烘箱烘干，中性树胶封片。
[0026]9、使用thermo抗体亚型鉴定试剂盒进行鉴定，单抗亚型鉴定结果为IgM。鉴于IgM抗体通常不稳定的现象，进行了抗体稳定性实验，抗体在37°存放一周后效价未明显降低，按照药典规定的稳定性实验标准，其在四度保存可以稳定半年以上。
[0027]10、抗体应用价值:可以用于科研用于研究微管蛋白突变引起的相关病症或者耐受力变化，可以制作成试剂盒用作医院检测肺癌或者其他疾病的化疗耐受性检测。
[0028]二、试剂盒组成及制备
1、组成:非小细胞肺癌紫杉醇化疗个体化诊断检测试剂盒(20人份)
1)3%H202Iml
2)2Pg/ml抗人β -tubulin-3蛋白的单克隆抗体Iml
3)生物素标记羊抗小鼠IgM抗体Iml
4)链毒素标记的辣根过氧化物酶(HRP)Iml5) DAB 显色液购买的是 Dako REAL? EnvisionTmdetitiom system Iml
2、试剂盒的使用方法 试剂盒的使用方法相同，如下所示:
1)3%H202每片滴一滴，室温孵育IOmin;
2)0.0lM PBS (PH7.4)冲洗3次，每次五分钟；
3)2Pg/ml抗人β -tubulin-3的单克隆抗体室温孵育I个小时；
4)0.0lM PBS (ρΗ7.4)冲洗3次，每次五分钟；
5)生物素标记的羊抗小鼠IgM抗体每片滴一滴，室温孵育30分钟；
6)0.0lM PBS (ρΗ7.4)冲洗3次，每次五分钟；
7)链霉素标记的辣根过氧化物酶每片滴一滴，室温孵育10分钟；
8)0.0lM PBS (ρΗ7.4)冲洗3次，每次五分钟；
9)DAB显色缓冲液每片滴一滴，室温反应5-10分钟；
10)苏木素复染I分钟，盐酸酒精(盐酸: 75%酒精按1:99比例配比)自来水反蓝I分
钟；
11)脱水、透明、封片，观察结果。
[0029]三、试剂盒进行临床标本的检测
收集武汉大学中南医院93份非小细胞肺癌手术标本，包含有非小细胞肺癌、非小细胞鳞癌组织、癌旁组织。按照试剂盒使用说明方案进行试验，结果显示，按照染色程度1、2、3、4级和染色细胞程度I (〈10%)，2(11-50%), 3(51-75%)和4 (>75%)进行评分，最后用统计软件进行分析，非小细胞肺癌组织中β-tubulin-3阳性率64.52%,发生淋巴结转移的NSCLC组β -tubulin-3表达阳性率高于未发生淋巴结转移NSCLC组织。
[0030]表一:小鼠第四次免疫后一周ELISA效价
【权利要求】
1.一种分泌鼠抗人β -tubulin-3单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E7，该细胞株2E7的保藏号为 CCTCC C2013106。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞株2E7分泌的能够特异结合β-tubulin-3抗原分子的鼠抗人β -tubulin-3单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于:所述单克隆抗体的结合表位位于人类β-tubulin-3抗原的构象表位。
4.一种能够检测非小细胞肺癌细胞β-tubulin-3表达量的免疫组化试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括权利要求2所述的鼠抗人β -tubulin-3单克隆抗体。
5.权利要求2所述的鼠抗人β-tubulin-3单克隆抗体在制备非小细胞肺癌诊断试剂或治疗药物中的应 用。
【文档编号】G01N33/68GK103436495SQ201310335542
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月5日 优先权日:2013年8月5日
【发明者】殷瑛, 刘劲松, 喻德华 申请人:武汉海吉力生物科技有限公司