一种利用具有中和FLT3生物学活性的McAb应用于肿瘤的靶向治疗的新方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用具有中和FLT3生物学活性的McAb应用于肿瘤的靶向治疗的新方法。主要内容是采用建立一株特异性强，稳定高效分泌具有抗FLT3生物学活性的杂交瘤细胞株，使用其分泌的FLT3单克隆抗体应用于抑制急性淋巴瘤的形成从而可用于恶性肿瘤的治疗。具体方法是用基因重组的FLT3表达蛋白，免疫BALB/C小鼠；经PEG4000将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合；反复进行ELISA及WB进行筛选，建立特异稳定表达抗FLT3的杂交瘤细胞株；大量扩增，接种小鼠腹腔，制备腹水；收集腹水，进行ELISA效价检测、WB检测及抑制白血病细胞形成肿瘤的生物学活性检测。
【专利说明】—种利用具有中和FLT3生物学活性的McAb应用于肿瘤的靶向治疗的新方法
【技术领域】
[0001]该发明属生物技术及生物制药领域，具体涉及一种利用具有中和FLT3生物学活性的McAb应用于肿瘤的靶向治疗的新方法。
【背景技术】
[0002]FLT3蛋白属于第三类受体络氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK),结构上与血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, F1DGF),菌落刺激因子(colonystimulating factor 1，CSF1)KIT配基相关。RTK蛋白一般含有5个胞外免疫球蛋白相似区和一个由特殊的亲水性内源插入片段分隔开得胞内络氨酸激酶区。人类的FLT3蛋白免疫共沉定实验显示有两条位于130KD及155-160KD处的条带，其中高分子量的条带对应的是N端糖基化的成熟蛋白类型，而低分子量的则对应含有高含量甘露糖的非成熟型蛋白。
[0003]FLT3全基因包含24个外显子，一共96，982个碱基对。FLT3蛋白包含993个氨基酸，分子质量为112.804KD。FLT3蛋白被认为多在在骨髓CD34-阳性细胞(对应多能性骨髓及B淋巴祖细胞)及单核细胞中中表达，在具有CD34高表达的胎肝细胞中也能够表达。另外FLT3也在来于蛋白急性非淋巴细胞白血病及B淋巴白血病的胚细胞中表达。
[0004]FLT3是FL细胞因子的受体，具有络氨酸蛋白激酶活性的受体功能。FL是一个早期的功能调控因子，它确保原始造血祖细胞的存活、增殖及分化。FLT3与配体的结合可以促进配体的二聚体化及其后通过多种胞质蛋白的磷酸化介导的细胞信号传导，包括SHC, SHP-2, SHIP, Cbl, Cbl-b, Gabl and Gab2，还可以激活多种信号传导的下游通路例如Ras/Raf/MAPK 及 PI3Ras/Raf/MAPK and PI3 激酶等。
[0005]FLT3基因的突变是最常见的基因畸变，这种变异在急性髓性白血病中被发现过的。位于近膜区的长度突变是最常发生的一种突变类型，约占20-25%，其次是位于第二个络氨酸激酶的酶活区域的突变，大多数是由于该区域835处的密码子突变和836位密码子缺失造成，所占比例是7-8%。另外在近膜区的点突变也曾被发现，而全基因范围内许多新类型的突变情况依然在增多。
[0006]在急性髓性白血病中约有20-25%的FLT3基因序列中出现内部串联重复序列，插入和缺失(极少见)的改变。这种情况也被认为与5-10%真的骨髓增生异常综合症、难治性贫血伴原始细胞增多及急性，少量的淋巴细胞白血病密切相关。FLT3中重复序列一般在第11位外显子上，但有时也出现在11位内含子及12位外显子上。这种序列上的异常重复最常用的描述术语是FLT3-1TD(FLT3基因内部串联重复)。但是由于分子结构上的严重异常，FLT3-LM(FLT3长度突变)这种描述似乎更为充分准确。
【发明内容】
[0007]本发明采用建立一株特异性强，稳定高效分泌具有抗FLT3生物学活性的杂交瘤细胞株，使用其分泌的FLT3单克隆抗体应用于抑制急性淋巴瘤的形成从而可用于恶性肿瘤的治疗。
[0008]本发明的技术方案为:筛选出特异稳定分泌小鼠抗人FLT3抗体的杂交瘤细胞株FLT3E6。通过DNA测序和体外和体内测试，证实了所述杂交瘤细胞株分泌的抗体是一种全新的抗FLT3的单克隆抗体，可抑制急性淋巴瘤的形成，从而可用于恶性肿瘤的治疗。
[0009]进一步地，具体步骤为:用基因重组的FLT3表达蛋白，免疫BALB/C小鼠j^PEG4000将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合；反复进行ELISA及WB进行筛选,建立特异稳定表达抗FLT3的杂交瘤细胞株；大量扩增，接种小鼠腹腔，制备腹水；收集腹水，进行ELISA效价检测、WB检测、增殖抑制试验的生物学活性检测。
[0010]本发明中所述单克隆抗体由FLT3E6单克隆杂交瘤细胞株特异稳定分泌产生，该细胞株正向中国典型培养物保藏中心提交保藏申请。经基因组DNA测序鉴定，该单克隆细胞株编码的FLT3的抗体基因型序列独特，其编码为全新的抗FLT3的单克隆抗体。
[0011]体内实验结果显示，用该单克隆抗体注射荷瘤小鼠，与对照(仅注射正常小鼠IgG)相比，注射该单克隆抗体的荷瘤小鼠的生存期明显延长(彡3月，p〈0.05)、瘤体缩小明显(较对照组平均缩小50%以上)或消失。
[0012]体内体外的实验结果均表明，所述单克隆抗体可用于抑制急性淋巴瘤的形成，抑制肿瘤的生长，减小肿瘤大小，从而达到治疗肿瘤的目的。
[0013]本发明拟以稳定表达具有抗FLT3生物学活性的杂交瘤细胞mRNA为模板，小鼠IgV区简并引物扩增VH及VL。再经重叠PCR技术构建VH-1inker-VL目的片段，最终构建成大肠杆菌BL21/pETa (32+) -VH-1inker-VL基因工程表达菌；经常规发酵扩增、IPTG诱导表达、破碎、纯化后进行药物的体内外活性及药代学检测。进行中试表达纯化，建立一套可行的生产工艺及规程；申报药物的1、IIJII期临床试验批文，最终获得国家新药生产证书；进行产品宣传并推向市场，应用于临床治疗，为人类健康作出应有的贡献。
[0014]运用美国LynnonB1soft公司开发的高度集成化的分子生物学应用软件DNAMAN6.0.3.99结合图2中western结果，确认FLT3蛋白的抗体表原分布范围在从871位缬氨酸至最993末位丝氨酸处(红色方框标明)，约122个氨基酸。。
[0015]FLT3单克隆抗体可变区核酸序列在NCBI网站中进行BLAST，选取了相似性最高的三种鼠源特异性单克隆抗体3F9、4C8、KP14重链可变区序列作为比对序列。在informaxinc公司开发的软件vector NTI 8.0将四种序列进行分析比对，证实本发明中的FLT3单克隆抗体是独立于其他序列高度相似的单克隆抗体的一个全新序列的抗体(见图3)。
【具体实施方式】
[0016]本发明由以下实施例来例证，但应当注意的是，以下实施例仅用于例证和解释本发明，而不是对本发明保护范围的限制。
实施例1制备特异性针对FLT3的杂交瘤细胞株
[0017]以重组的人FLT3为免疫原。根据常规方法经皮下多点免疫BALB/C小鼠，适时与SP2/0进行经PEG 4000进行融合。按单克隆抗体制备常规进行筛选及亚克隆，获得能高效、稳定分泌特异性抗人FLT3的杂交瘤细胞株FLT3E6。
[0018]将该杂交瘤细胞经扩增后接种于已预先用液体石蜡致敏7天的BALB/C小鼠腹腔，约10?14天收集小鼠腹水用于后续试验研究。
[0019]腹水经硫酸铵盐析纯化及Protein G-Sepharose 4B亲和层析纯化后(以后简称纯化抗体)检测ELISA效价> 409600。
[0020]用宫颈癌细胞(Hela)，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、白血病细胞(HL60和K562)的细胞裂解物为抗原进行western-blot鉴定。结果除Hela细胞外，细胞裂解物均在约I 1kd处出现一明显条带(见图4)。这些结果显示，所述杂交瘤分泌的抗体对FLT3具有特异性。
实施例2人FLT3单克隆抗体对荷瘤小鼠的治疗试验
[0021]常规用0.25%胰酶消化收集处于对数生长期HL60细胞(白血病细胞)，用生理盐水调细胞浓度为5X107个/ml，接种于裸鼠腋下，每只0.2ml，共二十只。同时注射雌激素(0.15mg/ml) 0.2ml,每天一次。
[0022]约20天后，所有裸鼠腋下均长出约绿豆大小瘤体，随机分为两组，每组十只。
[0023]分别尾静脉注射正常BALB/C IgG 0.1ml和纯化的抗FLT3单克隆抗体0.1ml (含100 μ g McAb)，同时肌肉注射雌激素0.2ml/只。
[0024]观察记录裸鼠生存状况和瘤体大小。
[0025]根据各组瘤体大小及生存期均值分别制作瘤体大小柱形图(见图5)和生存柱形图(见图6)。
[0026]如图5所示，通过使用本发明的抗FLT3单克隆抗体治疗，荷瘤小鼠的瘤体大小逐渐减少甚至直至消失，而对照组的瘤体大小则逐渐增加。而图6则证实了通过使用本发明的抗FLT3单克隆抗体治疗，显著地增加了荷瘤小鼠的生存期。
【专利附图】
【附图说明】
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[0027]图1是western鉴定FLT3抗原表位图。左图:FLT3C1:650-820位氨基酸的GST融合蛋白，FLT3C2:650-870位氨基酸的GST融合蛋白，FLT3C3 =750-998位氨基酸的GST融合蛋白。右图:抗FLT3抗体只能识别含有FLT3C3的抗原。
[0028]图2是FLT3抗原表位序列分析图。
[0029]图3是三种不同抗体与FLT3单克隆抗体重链可变区核酸序列比对图。
[0030]图4是western鉴定FLT3抗体特异性图。
[0031]图5是注射FLT3抗体小鼠与对照组肿瘤重量对比柱状图。其中5，14，21代表以第一次注射抗体为O天，其后相隔5，14，21天后取出瘤体进行称重。FLT3抗体组的肿瘤增殖明显小于对照组。
[0032]图6是注射FLT3抗体小鼠与对照组生存期比较图。其中5，14，21代表以第一次注射抗体为O天，其后相隔5，14，21天计算存活小鼠的数量。注射FLT3抗体组的存活率明显高于对照组。
【权利要求】
1.一种利用具有中和FLT3生物学活性的McAb应用于肿瘤的靶向治疗的新方法，其特征在于:利用新的分泌FLT3单克隆抗体的细胞株所分泌的FLT3单克隆抗体治疗肿瘤。
2.根据权利要求1所述的一种利用具有中和FLT3生物学活性的McAb应用于肿瘤的靶向治疗的新方法，其特征在于:建立一株特异性强，稳定高效分泌具有抗FLT3生物学活性的杂交瘤细胞株，使用其分泌的FLT3单克隆抗体应用于抑制急性淋巴瘤的形成从而可用于恶性肿瘤的治疗。
3.根根据权利要求2所述的一种利用具有中和FLT3生物学活性的McAb应用于肿瘤的靶向治疗的新方法，其特征在于:具体步骤为:用基因重组的FLT3表达蛋白，免疫BALB/C小鼠；经PEG4000将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合；反复进行ELISA及WB进行筛选，建立特异稳定表达抗FLT3的杂交瘤细胞株；大量扩增，接种小鼠腹腔，制备腹水；收集腹水，进行ELISA效价检测、WB检测及增殖抑制试验生物学活性检测。
【文档编号】A61K39/395GK104288765SQ201410315632
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】刘聪, 章崇杰 申请人:成都中联生科基因科技有限公司