专利名称：经修饰的细胞因子的纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及从异构体混合物中分离达贝泊汀(darb印oetin)的低pi异构体的方法。
背景技术：
促红细胞生成素或EPO是糖基化的细胞因子，其由肝和肾细胞产生，并且调节红 细胞的产生。纯化的重组人EPO可给病人服用，以治疗与红细胞供给缺乏相关的疾病，例如 贫血和慢性肾衰竭。人EPO分子的多肽骨架具有不变的氨基酸序列；然而，糖侧链在含糖量和结构方 面呈现出微观不均一性(Sasaki H 等人，J. Biol. Chem.，1987 ；262 :12059_76，Rush RS 等 人，Anal. Chem.，1995 ；67 1442-52 和 Rush RS 等人，Anal. Chem.，1993 ；65 1834-42)。带 负电荷的唾液酸分子通常将糖链的每一个臂的末端封闭。因此，糖链的可变性质(整体上) 和唾液酸的含量(特别地)会产生带有不同电荷的EPO异构体(Rush RS等人，Anal. Chem.， 1995 ；67 1442-52)。Egrie 及其同事(Egrie JC.和 Browne JK.，Br. J. Cancer, 2001 ；84， 3-10 和 Egrie 等人，Glycoconj. J.，1993 ；10 :263_269)发现了 rHuEPO 的糖部分上的唾液 酸基团数量与其血清半衰期及生物活性之间的直接联系。具有更多唾液酸残基的促红细胞 生成素异构体显示出更强的生物活性，因为唾液酸残基会阻止在体内的快速清除。达贝泊汀是新的红细胞生成促进蛋白或具有五个N-连接的糖链和多至22个唾 液酸的EPO类似物。相反，重组人EPO具有三个N-连接的糖链和最多14个唾液酸(Egrie JC.和 Browne JK.，Br. J. Cancer，2001 ;84，3-10 和 Elliot S 等人，Blood，2000 ；96 8 2a)。 由于额外的糖基化，达贝泊汀相对于重组人EPO显示出长三倍的血清半衰期和增加的体内 活性。达贝泊汀的异构体的产生主要是由于它们的糖基含量不同以及带负电荷的末端唾液 酸残基的数量不同。具有更高唾液酸含量的异构体具有低Pl。这些具有低Pl的达贝泊汀 的异构体已被证明具有更高的治疗价值，例如Amgen Corporation的以ARANESP 形式销售 的产品。 文献公开了通过单独使用阴离子交换色谱或使用阴离子交换色谱与疏水相互作 用或排阻色谱技术的组合来纯化EPO及其类似物。国际申请公布号WO 00/27869公开了促红细胞生成素的纯化方法，其由以下顺序 的步骤组成疏水相互作用、阴离子交换、阳离子交换和排阻色谱步骤。国际申请公布号WO 03/045996公开了通过反相色谱、阴离子交换和排阻色谱的重组人促红细胞生成素的色谱 纯化。Gokana 等人，Journal of Chromatography，第 701 卷，1997，109-118 页，描述了通过 DEAE-S印hacel色谱的重组人促红细胞生成素异构体的色谱分离方法。因此，上述公开具有一系列复杂的色谱步骤，用于促红细胞生成素及其类似物的 纯化。然而，需要用于从异构体混合物中分离达贝泊汀的低Pl异构体的简单而有效的方 法。
发明内容
本发明的一些方面提供了分离达贝泊汀的异构体的方法。在一些实施方案中，所 述方法用于达贝泊汀的低Pi异构体的分离。在一些具体的实施方案中，所述方法用于Pi 为约4. 5或更小的异构体的分离。异构体的分离或纯化使用至少一个在流通模式(flow-through mode)下的阳离子 交换色谱步骤来完成。所述方法使用一定范围的PH和盐浓度，以从达贝泊汀异构体的混合 物中分离低Pl异构体。一方面，本发明提供了从达贝泊汀异构体的混合物中分离达贝泊汀的低Pl异构 体的方法，所述方法包括至少一个在流通模式下的阳离子交换色谱步骤。一方面，本发明提供了从达贝泊汀异构体的混合物中分离达贝泊汀的低Pl异构 体的方法，所述方法包括至少一个在流通模式下的阳离子交换色谱步骤且进一步包括至少 一个阴离子交换色谱步骤。一方面，本发明提供了从达贝泊汀异构体的混合物中分离达贝泊汀的低Pl异构 体的方法，所述方法包括至少一个在流通模式下的阳离子交换色谱步骤和进一步包括至少 一个混合模式交换色谱步骤。
图1是实施例6的实验中得到的等电聚焦凝胶，其显示了实施例5中描述的Q琼 脂糖凝胶步骤的洗脱液中得到的低Pi异构体。图2是实施例6的实验中得到的等电聚焦凝胶，其显示了如实施例4中所述进行 的CM-琼脂糖凝胶步骤的流通液(flow-through)中得到的低pi异构体。
具体实施例方式本发明的一些方面涉及通过在流通模式下的阳离子交换色谱分离达贝泊汀的低 Pi异构体的方法。本发明包括包含至少一个在流通模式下的阳离子交换色谱步骤的方法，其中从异 构体的混合物中分离低Pl异构体。这同时作为病毒灭活步骤，这是由于该步骤中使用低PH 范围的缓冲剂，以得到所需的异构体。此处使用的术语“异构体”是指具有相同的氨基酸序列，但由于糖基化、酰基化、脱 酰胺基或硫酸化的不同而具有不同的电荷，且因此具有不同的等电点的蛋白。“等电点”或“pi”是其中特定的分子或表面不带有净电荷的pH值。多肽的“pi” 是指其中所述多肽的正电荷和其负电荷平衡的PH值。“pi”可以通过各种已知的方法估算， 例如从多肽上的氨基酸和/或唾液酸残基的净电荷估算或通过使用等电聚焦、层析聚焦等 估算。低pi异构体是具有约4. 5或更低的pi的异构体。在一个实施方案中，低pi异构体通过包括阴离子交换色谱步骤或混合模式色谱 步骤的方法分离得到，所述混合模式色谱步骤包括至少一个在流通模式下的阳离子交换色 i普步马聚ο在另一个实施方案中，通过包括阴离子交换步骤或混合模式色谱步骤以及在流通模式下的阳离子交换色谱步骤、任选存在的之后的另一个阴离子交换步骤或混合模式色谱 步骤的方法将低pi异构体从异构体混合物中分离。在另一个实施方案中，通过包括阴离子交换或混合模式色谱步骤、在流通模式下 的第一阳离子交换色谱步骤以及在流通模式下的第二阳离子交换色谱步骤的方法将低Pi 异构体从其异构 体混合物中分离。在另一个实施方案中，通过包括阴离子交换或混合模式色谱、在流通模式下的第 一阳离子交换色谱和在流通模式下的第二阳离子交换色谱、之后的另一个阴离子交换或混 合模式色谱步骤的方法将低Pi异构体从其它异构体混合物中分离或纯化。在另一个实施方案中，通过包括阴离子交换色谱步骤、在流通模式下的第一阳离 子交换色谱和在流通模式下的第二阳离子交换色谱、之后的混合模式色谱步骤的方法将低 Pi异构体从其它异构体混合物中分离或纯化出来。这里提到的实施方案在色谱步骤之间可以任选地包括切向流过滤、浓缩、渗滤或 超滤步骤中的任意步骤。这里提到的实施方案可以包括一个或多个病毒灭活步骤或无菌过滤或纳滤步骤。实施方案中提到的阴离子交换色谱可以采用任何弱或强的阴离子交换色谱树脂 或膜进行，所述树脂或膜起到弱或强的阴离子交换剂的作用。阴离子交换色谱树脂或膜的 实例是Q-琼脂糖凝胶色谱树脂或膜。实施方案中提到的阳离子交换色谱可以采用任何弱或强的阳离子交换色谱树脂 或膜进行，所述树脂或膜起到弱或强的阳离子交换剂的作用。弱阳离子交换树脂的实例是 羧甲基-琼脂糖凝胶(CM-琼脂糖凝胶)或具有类似的羧甲基配体的树脂。实施方案中提到的混合模式色谱是指其中包含一种以上色谱分离原理(通常为 离子和疏水原理)起作用的色谱树脂。因此，混合模式树脂是指具有阳离子或阴离子、疏水 基团或配体的固相。术语“固相”是指任何非水性基质。混合模式色谱配体显示出疏水或 电荷相互作用之一或两者兼备。混合模式树脂的实例是Captoadhere树脂或通过类似方式 起作用的任何混合模式树脂。阳离子交换步骤中的“流通模式”是指其中所期望的蛋白不与柱结合且在上样或 上样后的洗脱步骤中在流通溶液中获得的过程。流通液中的期望的蛋白可以以各个级分的 形式收集并合并到一起或可以以单个级分的形式收集。在阳离子交换色谱步骤中，用于将蛋白上样的缓冲剂的pH值为约2至约5，或2. 8 至约4. 8，或约3至约3. 5。本文在洗脱步骤中用于获得蛋白的缓冲剂的pH值为约2至约 5，或约2. 8至约4，或约3至约3. 5。在第一阳离子交换步骤中的使用的缓冲剂的pH值可以与第二阳离子交换步骤中 的使用的PH值不同。用于配制缓冲溶液的缓冲剂可以包括乙酸钠或柠檬酸钠或磷酸盐缓冲剂，以及它 们的盐或衍生物。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约IOmM至约IOOmM,或约40至约 90mM,或约75至约85mM。参考以下实施例，对本发明的某些具体方面和实施方案进行更详细的描述，提供 以下实施例的目的仅用于解释说明。这些实施例不应以任何方式被视为对本发明范围的限 制。
实施例实施例1蛋白的表汰和收获。
通过将CHO-S亲本细胞系用获自达贝泊汀α表达载体(pCS_达贝泊汀-WPE (新 ori))的逆转录病毒载体(retrovector)转导得到中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CH0)生产细胞系。转导后，在T型瓶中，10-14天后汇合的(pooled)细胞群表达多至 36 μ g/rl的达贝泊汀α。将汇合的细胞群稀释至非常低的细胞密度(1_3活细胞/200 μ 1 培养基)并平铺于96孔微量滴定板上以形成源于单一细胞的克隆细胞系。筛选用于达贝 泊汀α生产的克隆并选择高产率的克隆用于表达。在被接种到生产反应器前，在3个旋转器(spinner)阶段以及1个种子反应器阶 段中将表达达贝泊汀α的细胞从主细胞库扩展。PF CHO培养基用于在旋转器中培养细胞，以得到良好的细胞生长和高生存力。所 述PF-CHO培养基每升培养基包括PF-CH0主粉末6. 0g，PF-CHO基础粉末10. 4g，L-谷氨酰 胺0.58g，Pluronic F-68 1. 0g，碳酸氢钠2. 0g。在接种前将培养基的pH值设定为7。将获 自主细胞库的细胞接种在包含PF-CHO培养基的旋转器瓶中，初始细胞计数为0. 2百万细胞 /mL。将旋转器瓶在保持在37°C下的5% CO2的温育器中进行温育。温育72小时后，当细胞 密度达到1百万细胞/mL时，将细胞收获并转入另一阶段。经过在旋转器瓶中转换的3个 阶段后，将细胞接种到包含4L SFM-6(1)培养基的6. 5L的种子反应器中，初始细胞密度为 0. 2百万细胞/mL。所述SFM-6(1)培养基包括“DMEM/F-12”基础培养基、氨基酸、胰岛素、 维生素、微量元素、植物蛋白胨、碳酸氢钠和果糖。在种子反应器中，将PH值保持在7.0，将 培养温度控制在37. 0°C。通过控制搅动和曝气使溶解氧保持在40%。72小时后当细胞密 度达到1百万细胞/mL时，无菌收获培养物且将细胞转入IlL的包含10LSFM-6(2)培养基 的生产反应器中，初始细胞密度为0. 2百万细胞/mL。12天后收获培养物，以收集包含目标 产物的上清液。实施例2通过阴离子交换饩谱或Captoadhere饩谱捕获。在粗提取物澄清后，将澄清的细胞培养液浓缩，并通过使用pH值为7. 1的25mM 三羟甲基氨基甲烷、60mM NaCl缓冲剂进行渗滤(使用截留分子量为30kDa的切向流过滤 (TFF))降低电导率。随后将浓缩后的细胞培养液上样至经5个柱体积(CV)的25mM三羟甲 基氨基甲烷、60mM NaCl、pH值7. 1的缓冲剂预平衡的Q-琼脂糖凝胶柱。然后，用5CV的平 衡缓冲剂(25mM三羟甲基氨基甲烷、60mMNaCl，pH值7. 1)洗涤柱。然后，用pH值为4.0的 SOmM乙酸钠、40-120mM NaCl缓冲剂进行低pH值洗涤。再次用平衡缓冲剂洗涤。上样至柱 上的期望的蛋白用PH值为7. 1的25mM三羟甲基氨基甲烷、140-300mM NaCl缓冲剂洗脱。此外，可使用CaptoAdhere (混合模式色谱柱)替代Q-琼脂糖凝胶柱。用5CV的 20mM磷酸盐，60mM NaCl，pH值7. 1 士0. 2的缓冲剂预平衡CaptoAdhere柱。然后用5CV的平 衡缓冲剂(20mM磷酸盐，60mM NaCl，pH值7. 1 士 0. 2)洗涤柱。接着用pH值为4. 0的80mM 乙酸钠、40-120mM NaCl缓冲剂进行低pH值洗涤。再次用平衡缓冲剂洗涤。上样至色谱柱 上的期望的蛋白用PH值缓冲为7. 1 士0. 2的20mM磷酸盐、140-300mM NaCl洗脱。实施例3
第一阳离子交换饩谱。将由实施例2得到的洗脱液级分合并并浓缩，并通过使用PH值为4. 8的73mM乙 酸钠缓冲剂的TFF步骤的渗滤过程使电导率降低。该步骤作为缓冲剂交换步骤，其中使所 述合并的Q-琼脂糖凝胶柱洗脱液进入到pH为4. 8的73mM乙酸钠缓冲剂中。随后将所述 缓冲剂交换样品上样至已用5CV的pH为4. 8的73mM乙酸钠缓冲剂预平衡的CM-琼脂糖凝 胶柱上。在上样样品时期望的产物在流通液中得到，而杂质则结合到色谱柱上。上样后，用 3CV的pH为4. 8的73mM乙酸钠缓冲剂洗涤柱。期望的产物也在洗涤步骤中以流通液的形 式得到。结合在柱上的杂质随后用PH为7. 1的25mM三羟甲基氨基甲烷、500mM NaCl缓冲 剂洗脱。实施例4第二阳离子交换饩谱。将由实施例3得到的流通液级分或由实施例2得到的洗脱液级分合并、浓缩并使 用TFF与包含83mM乙酸钠(或80_85mM乙酸钠)的pH为3. 3 (或pH 3. 0-3. 5)的缓冲剂交 换。将由TFF得到的样品上样至用5CV的pH为3. 3的83mM乙酸钠缓冲液预平衡的CM-琼 脂糖凝胶柱。在上样样品时期望的产物在流通液中得到。发现此步骤中使用的缓冲剂的PH 值对得到流通液中的所需的异构体至关重要。此外，上述过程持续超过30分钟，因此其同 时也作为病毒灭活步骤。上样后，将色谱柱用9CV的pH为4. 8的73mM乙酸钠缓冲剂洗涤。 期望的产物也在洗涤步骤中的流通液中得到。结合在柱上的杂质随后用PH为7. 1的25mM 三羟甲基氨基甲烷、500mM NaCl缓冲剂洗脱。实施例5 阴离子交换饩谱步骤或Captoadhere饩谱步骤。将由实施例4得到的流通液级分上样至已用含有25mM三羟甲基氨基甲烷、60mM NaCl, pH为7. 1的缓冲剂预平衡的Q-琼脂糖凝胶柱上。用相同的缓冲剂洗涤柱。期望的 产物结合到色谱柱上，并用PH缓冲为6. 0的40mM磷酸盐，280mMNaCl洗脱。或者，可使用CaptoAdhere (混合模式色谱柱)代替Q-琼脂糖凝胶柱。在这种情 况下，该柱用5CV的pH为6. 0的20mM磷酸盐缓冲剂预平衡，并再次用相同的缓冲剂(5CV) 洗涤。随后用4CV的包含40mM磷酸盐和280mMNaCl、pH为6. 0的缓冲剂洗脱结合在色谱柱 上的期望的蛋白。该步骤(实施例5)作为浓缩和缓冲剂交换步骤，因此不需要另一个TFF。此外，这 提供了比常规TFF更可控的环境。实施例6等电聚焦。通过等电聚焦(IEF)分析实施例4的流通液级分和由实施例5得到的洗脱液。使 用水、尿素、30%丙烯酰胺和两性电解质(pH范围2-4和3-10)制备IEF凝胶。将上述组分 小心地混合并向混合物中加入10重量/体积％过硫酸氨和TEMED，将上述混合物注入凝胶 夹层装置(gel sandwich apparatus,BIORAD Mini Protean Cell)并配备梳。使凝胶在室 温下聚合45分钟。将少量的蛋白溶液与等体积的样品缓冲剂(甘油、两性电解质和Milli Q水)混合并载入到凝胶中。随后将凝胶放入BIORAD Mini Protean Cell装置中并在不同 的室中充入阴极缓冲剂(25mM氢氧化钠)和阳极缓冲剂(25mM正磷酸)。在室温下，将由实施例4得到的流通液级分或由实施例5得到的洗脱液在200V恒压下运行1. 5小时，用于两 性电解质的预聚焦，然后在室温下，将电压增加到400V并再运行1. 5小时。运行后，将凝胶 小心地除去，并如现有技术中公开的那样，使用考马斯蓝染色或银染色。图1显示了由根据以上所述进行的实验得到的等电聚焦凝胶，显示了实施例5中 描述的Q琼脂糖凝胶步骤的洗脱液中得到的低Pl异构体。泳道A至F是根据本发明进行 的不同纯化批次；即，使表达达贝泊汀α的细胞培养物的收获物经历如实施例2所述的阴 离子交换色谱，然后经历如实施例4所示的在流通模式下的阳离子交换色谱，然后经历如 实施例5所示阴离子交换色谱。
图2显示了由根据以上所述进行的实验得到的等电聚焦凝胶，显示了如实施例4 中所述进行的CM-琼脂糖凝胶步骤的流通液中得到的低pi异构体。图中的泳道A至C和 F至I是根据本发明进行的不同纯化批次；S卩，使表达达贝泊汀α的细胞培养物的收获物 经历如实施例2所述的阴离子交换色谱，然后经历如实施例4所示的在流通模式下的阳离 子交换色谱。泳道D和E是可商购的达贝泊汀α样品ARANESP 中观察到的异构体(pi 2. 8-3. 3)，并用作用于对比的标准品。
权利要求
1.从达贝泊汀异构体的混合物中分离达贝泊汀的低Pi异构体的方法，所述方法包括 至少一个在流通模式下的阳离子交换色谱步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述异构体具有小于约4.5的pi值。
3.如权利要求1所述的方法，其进一步包括至少一个阴离子交换色谱步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其中至少一个阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之前。
5.如权利要求3所述的方法，其中至少一个阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之后。
6.如权利要求3所述的方法，其中至少一个阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之前且至少一个阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子交换色谱步骤之后。
7.如权利要求1所述的方法，其包括两个阳离子交换色谱步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其中至少一个阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之前。
9.如权利要求7所述的方法，其中至少一个阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之后。
10.如权利要求7所述的方法，其中至少一个阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子 交换色谱步骤之前且至少一个阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子交换色谱步骤之后。
11.如权利要求1所述的方法，其进一步包括至少一个混合模式色谱步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其中至少一个混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之前。
13.如权利要求11所述的方法，其中至少一个混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之后。
14.如权利要求11所述的方法，其中至少一个混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之前且至少一个混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交换色谱步骤之后。
15.如权利要求11所述的方法，其包括两个阳离子交换色谱步骤。
16.如权利要求15所述的方法，其中至少一个混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之前。
17.如权利要求15所述的方法，其中至少一个混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之后。
18.如权利要求15所述的方法，其中至少一个混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之前且至少一个混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交换色谱步骤之后。
19.如权利要求3所述的方法，其包括至少一个混合模式色谱步骤。
20.如权利要求19所述的方法，其中至少一个混合模式色谱步骤在阳离子交换色谱步 骤之前。
21.如权利要求19所述的方法，其中至少一个混合模式色谱步骤在阳离子交换色谱步骤之后ο
22.如权利要求19所述的方法，其中至少一个混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交 换色谱步骤之前且至少一个阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子交换色谱步骤之后。
23.如权利要求19所述的方法，其中至少一个阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子交换色谱步骤之前且至少一个混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交换色谱步骤之后。
24.如权利要求19所述的方法，其包括两个阳离子交换色谱步骤。
25.如权利要求M所述的方法，其中所述混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交换色 谱步骤之前。
26.如权利要求M所述的方法，其中所述混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交换色谱步骤之后ο
27.如权利要求M所述的方法，其中所述混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交换色 谱步骤之前且所述阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子交换色谱步骤之后。
28.如权利要求M所述的方法，其中所述阴离子交换色谱步骤在至少一个阳离子交换 色谱步骤之前且所述混合模式色谱步骤在至少一个阳离子交换色谱步骤之后。
29.如权利要求1- 之一所述的方法，其中所述流通液在约2-5.5的pH值下得到。
30.如权利要求四所述的方法，其中所述流通液在约3-5的pH值下得到。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述流通液在约3.3的pH值下得到。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述流通液在约4.8的pH值下得到。
全文摘要
本发明提供了纯化经修饰的细胞因子的有效方法。所述方法包括使用色谱技术纯化期望的细胞因子。经纯化的细胞因子可用作治疗组分。
文档编号C07K14/52GK102076705SQ200980124118
公开日2011年5月25日 申请日期2009年6月23日 优先权日2008年6月24日
发明者A·维韦克, C·罗伊, D·科蒂察 申请人:雷迪博士实验室公司, 雷迪博士实验室有限公司