专利名称：三聚细胞因子的三聚结合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明提供了能结合三聚细胞因子的三聚结合蛋白。更具体地提供了能以某种方式结合的三聚结合物(trimeric binder)，从而在结合以后，能基本上封闭所述三聚细胞因子的全部受体结合位点，进而抑制三聚细胞因子的潜在生物活性。一方面，本发明涉及能结合肿瘤坏死因子配体超家族的细胞因子、包括肿瘤坏死因子(TNF)的三聚结合物。
背景技术：
细胞因子是高等真核生物分泌的小多肽，其负责细胞间的信号转导，且影响其它细胞的生长、分裂和功能。它们是有效的、多效的多肽，其例如通过相应的受体，发挥局部的或系统的细胞间调节因子的作用，因此在许多生物过程中起关键作用，例如免疫、炎症和造血作用(骨髓中的血细胞的形成和发育)。细胞因子由多种细胞类型生产，包括成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞/单核细胞、和淋巴细胞。迄今为止，已经鉴别出了大量的细胞因子，包括干扰素、肿瘤坏死因子、白介素和淋巴因子。它们与经典的激素不同，因为它们由许多组织或细胞类型生产，而不是由专门的腺体生产。
细胞因子-受体相互作用的调控是治疗性地干涉多种疾病和病理的有用机理。可以与细胞因子相互作用的可溶性的结合蛋白能潜在地把细胞因子与受体隔开，由此降低或阻止特定受体途径的激活。
某些细胞因子以多亚基复合物形式出现，其含有多拷贝的相同亚基。肿瘤坏死因子配体超家族(TNFLSF)中的巨噬细胞移行抑制因子(MIF)和蛋白，例如肿瘤坏死因子(TNF；TNFLSF成员2)和淋巴毒素α(LT-α；TNFLSF成员1)，以3个相同亚基形成的同型三聚体的形式出现。已知许多这样的三聚细胞因子会参与信号转导并起调节因子的作用，还参与许多不同类型的疾病和医学适应症。
已知TNF配体超家族的三聚细胞因子能在不同水平控制和调节免疫和炎症反应。还已知TNF配体超家族成员与几种疾病有关，例如急性的或慢性的炎性疾病。现在，TNF配体超家族具有至少17种公认的配体，包括LTA(淋巴毒素α；TNFLSF成员1)，TNF(肿瘤坏死因子；TNFLSF成员2)，LTB(淋巴毒素β；TNFLSF成员3)，OX-40L TNFLS成员4)；CD40L(TNFLS成员5)；FasL(TNFLS成员6)；CD27L(TNFLS成员7)；CD30L(TNFLS成员8)；4-1BB-L(TNFLS成员9)；TRAIL(TNFLS成员10)；RANKL(TNFLS成员11)；TWEAK(TNFLS成员12)；APRIL(TNFLS成员13)；BAFF(TNFLS成员13B)；LIGHT(TNFLS成员14)；VEGI(TNFLS成员15)；和GITRL(TNFLS成员18)。
有证据表明，TNF配体超家族的三聚细胞因子的信号单元和它们的对应受体是3个受体和3个配体装配成六聚体复合物的形式，其中一个细胞因子三聚体结合3个受体分子(Bodmer等2002，TRENDS inBiochemical Sciences 27(1)，pp.19-26)。在成为该六聚体复合物的一部分之前，受体以单体形式存在。图1解释了该一般机理。
TNF(TNFLSF成员2)是免疫和炎症反应的主要介导物之一，例如已知它在类风湿性关节炎的发病机理中起重要作用，该病是常见的自身免疫炎症疾病，它影响着约0.5-1％的人口。另外，还已知TNF参与广泛的疾病状态的发病机理，包括内毒素休克、脑型疟和移植物抗宿主反应。TNF由许多细胞类型生产，主要由活化的巨噬细胞生产。可溶形式的TNF由3个相同的17kD蛋白亚基组成，而膜结合形式则由3个相同的26kD亚基组成。TNF以前还称作″TNF-α″和″恶液质素″。
最近发现TWEAK(TNFLSF成员12)是血管生成(血管的形成和生长)的直接的和强烈的诱导物，因为发现皮摩尔浓度的TWEAK就能促进正常内皮细胞的增殖，且TWEAK能在体内大鼠角膜模型中诱导血管生成(Lynch等，1999，The Journal of Biological Chemistry，274(13)pp.8455-8459)。更具体地，血管生成对于实体瘤的生长、维持和它们的转移是必须的，还已知它参与其它的病理学疾病，例如糖尿病性视网膜病、银屑病、接触性皮炎和再狭窄。
US20020037852A1中指出三聚细胞因子BAFF(TNFLS成员13B)由T细胞和树突细胞表达，以进行B细胞的共刺激，因此它可能在B细胞功能的控制中起重要作用。其中暗示BAFF和它的受体可能具有抗癌和免疫调节用途、以及治疗免疫抑制病例如HIV的应用。
APRIL(TNFLS成员13)是能结合受体TNFRSF13B和TNFRSF17的三聚细胞因子。近来已经证实，向各种肿瘤细胞添加重组的APRIL会刺激它们的增殖，因而APRIL可能参与调节肿瘤细胞生长(Hahne M.，等，1998；J.Exp.Med.1881185-1190)。还已经提出，APRIL可能参与单核细胞/巨噬细胞介导的免疫过程。
而且，据称TNF超家族内的细胞因子会参与遗传性疾病，例如超IgM综合症、I型自身免疫淋巴增殖综合症、TNF-R1-相关的周期热综合症、少汗性外胚层发育不良和家族扩张性骨质溶解症。
已经进行了许多尝试来发现和开发合适的三聚细胞因子的拮抗剂和结合物，其能结合特定的三聚细胞因子，并由此阻止该三聚细胞因子结合到例如细胞膜结合型受体上，从而抑制该特定受体途径的激活。
一个实例是针对三聚细胞因子TNF(TNFLSF成员2)的拮抗剂。现在，市场上可以得到2种类型的TNF拮抗剂，即英夫利昔单抗(Remicade)和Eternarcept(Enbrel)，美国和欧洲的市场主管部门都批准了其用于治疗类风湿性关节炎。还已经证实，这2种产品对于治疗银屑病和克罗恩氏病也是有效的。英夫利昔单抗是一种嵌合抗体，其含有鼠可变区和人IgG1和κ恒定区，通过结合可溶的和跨膜形式的TNF来中和TNF的生物活性，并抑制TNF与其受体的结合。英夫利昔单抗的结构类似于自然产生的抗体。Eternacept是一种融合蛋白，由p75TNF受体的胞外域和人IgG1的铰链和Fc域组成。
WO 00/42073中给出了三聚细胞因子的拮抗剂的另一个实例，其中公开了针对三聚细胞因子TWEAK(TNFLS成员12)的单克隆抗体。其中提到，该抗体可以阻止移植物抗宿主病的发展。
但是，使用现在已知的三聚细胞因子的结合物和抑制剂产物会遇到的一个常见的技术问题是，在形成三聚细胞因子和结合物或抑制剂产物的1∶1复合物后，不能有效地封闭三聚细胞因子的所有3个受体结合位点，因为3个受体结合位点中的至少1个或2个还是开放的。开放的细胞因子受体结合位点可能会与对应的细胞表面细胞因子受体结合，由于该受体在细胞表面的高局部浓度，由此开始进一步募集细胞因子受体，并介导受体信号传递。
通过TNF结合物Eternacept可以清楚地解释该问题。Eternacept是二价分子，能与TNF三聚体形成1∶1复合物。当Eternacept结合TNF时，Eternacept分子仅能占据3个可能的受体结合位点中的2个，剩下的第3个受体结合位点仍是开放的。这暗示着开放的TNF受体结合位点可能会与细胞表面TNF受体结合，由于该受体在细胞表面上的高局部浓度，从而开始进一步募集TNF受体，并介导信号传递。图2解释了该问题。
TNF结合物英夫利昔单抗也存在相同的问题。每个英夫利昔单抗分子仅能结合给定的TNF分子的1个受体结合位点(亚基)，因而剩下2个开放的受体结合位点。这些开放的受体结合位点可能随后与对应的游离受体结合，导致TNF受体的进一步募集和受体信号传递。
现在，本发明的发明人已经发现，通过提供一种融合蛋白(原聚体)可以克服上面的技术问题，该融合蛋白被构建成三聚细胞因子的结合单元(结合物)与三聚化结构域的融合体。本发明的融合蛋白作为三聚蛋白，能与三聚细胞因子形成1∶1复合物，优选地同时有效地结合三聚细胞因子的所有3个受体结合位点，由此没有受体结合位点是开放的，因此能抑制细胞因子向细胞表面的积聚。本发明由此提供了一种融合蛋白，其具有下述优点与目前已知的三聚细胞因子拮抗剂相比，能更有效地抑制和中和三聚细胞因子的生物活性。根据本发明的融合蛋白的另一个优点是，当用作药物时，与目前已知的三聚细胞因子的结合物相比，使用更少量的融合蛋白即可达到治疗效果。
发明内容
因此，本发明一方面涉及含有3个单体的三聚多肽，每个所述的单体含有能结合三聚细胞因子的特异性结合构件，且每个所述的单体含有三聚化结构域。
另一方面，提供了含有根据本发明的三聚多肽的药物组合物。
另一方面，本发明涉及通过给具有三聚细胞因子(例如肿瘤坏死因子)介导的病理学的对象施用有效量的根据本发明的三聚多肽来治疗该对象的方法。
最后，提供了制备根据本发明的三聚多肽的方法、和检测样品中的三聚多肽细胞因子的实验方法。
发明详述一方面，本发明提供了能结合三聚细胞因子的三聚结合物，优选地其结合方式能够使得在结合后，能基本上封闭和/或中和三聚细胞因子的所有受体结合位点，从而抑制或中和三聚细胞因子的潜在生物活性。因此，提供了包含3个单体的三聚多肽，其中每个单体含有能结合三聚细胞因子的特异性结合构件，且其中每个单体都含有三聚化结构域。
在本文中，术语″三聚细胞因子″是指小蛋白和其片段，其由细胞生产和分泌，能在具有针对该细胞因子的受体的细胞中引起特异性反应，例如影响细胞的生长、分裂和/或功能。术语″三聚的″在本文中指本发明的细胞因子以含有3个亚基、优选3个相同亚基(同型三聚体)的多亚基复合物形式存在。
这种三聚细胞因子的典型实例包括巨噬细胞移行抑制因子(MIF)和肿瘤坏死因子配体超家族(TNFLSF)中的细胞因子。现在，如上所述，TNF配体超家族具有至少17种公认的配体，它们共享有称作″TNF同源域″(TNF homology domain，THD)的保守的三聚C-末端域，其负责受体结合。该三聚化结构域的序列相同性在TNF家族成员之间约为20-30％。THD是长为150个氨基酸的序列，其含有芳族和疏水残基的保守框架，如Bodmer等2002，TRENDS in Biochemical Sciences 27(1)，第19-26页的图2所示。因此，在本文中，″肿瘤坏死因子配体超家族的成员″是指含有该TNF同源域THD的三聚蛋白。目前已知的TNF配体超家族中的三聚细胞因子如下面的表1所示，还列出了别名和相应的Genbank ID(GenBank，National Center for Biotecnology Information；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)。本文所使用的TNF配体超家族的命名法遵循官方TNF超家族(TNFSF)命名法，可以参见http//www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily/tnftop.html。
表1TNF配体超家族
因此，在本发明的一个有用的实施方案中，根据本发明的三聚多肽能结合选自下列的肿瘤坏死因子配体超家族成员的三聚细胞因子LTA；TNF；LTB；TNFSF4；TNFSF5；TNFSF6；TNFSF7；TNFSF8；TNFSF9；TNFSF10；TNFSF11；TNFSF12；TNFSF13；TNFSF13B；TNFSF14；TNFRSF Fn14；TNFSF15；和TNFSF18。
如本文所使用的，术语″特异性结合构件″是指彼此具有结合特异性的一对分子中的成员。特异性结合对中的成员可以是自然产生的，或全部地或部分地合成生产的。分子对中的一个成员在其表面上有区域或者有腔，能特异性地结合分子对中的另一成员的特定空间和极性结构，因此与其呈互补性。因而，该对中的成员具有彼此特异性地结合的性质。特异性结合对类型的实例是抗原-抗体、生物素-链霉抗生物素蛋白、激素-激素受体、配体-配体受体、酶-底物。特异性结合对的其它实例包括碳水化合物和凝集素，互补的核苷酸序列(包括在DNA杂交实验中用于检测目标核酸序列的探针和捕获核酸序列)，互补的肽序列，包括通过重组方法形成的那些，效应物和受体分子，酶辅因子和酶，酶抑制剂和酶等。而且，特异性结合对可以包括作为原始特异性结合构件的类似物或片段的成员。
在有用的实施方案中，能结合三聚细胞因子的特异性结合构件为本发明的三聚多肽提供了对三聚细胞因子的结合亲合力(Kd)，由表面等离子体共振测得该结合亲合力优选地为1×10-8M或更低。在其它有用的实施方案中，Kd值低于1×10-9M，1×-10M，1×10-11M，1×10-12M，1×10-13M，1×10-14M，或甚至低于1×10-15M。在其它有用的实施方案中，由表面等离子体共振测得根据本发明的三聚多肽的K-off速度小于1×10-3S-1，例如小于1×10-4S-1、包括小于1×10-5S-1和甚至小于1×10-6S-1。如本文所使用的，术语″K-off″是指特异性结合构件从特异性结合构件/三聚细胞因子复合物中解离出来的解离速度常数。如本文所使用的，术语″表面等离子体共振″是指一种光学现象，通过检测生物生物传感器基质内的蛋白浓度的变化，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)检测，可以分析实时的生物特异性的相互作用。关于进一步的描述，见实施例10。
如上所述，根据本发明的三聚细胞因子结合物优选地能至少部分地或完全地封闭、抑制或中和三聚细胞因子的生物活性。如本文所使用的，表述“中和”是指抑制或降低体内或体外测得的三聚细胞因子的生物活性。
在有用的实施方案中，特异性结合构件是源自肿瘤坏死因子受体超家族成员的多肽。现在，已经知晓肿瘤坏死因子超家族中的至少29种受体，列在下面的表2中，同时列出了它们的别名以及相应的Genbank ID(GenBank，National Center for Biotecnology Information；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)。本文所使用的TNF受体超家族成员的命名遵循官方TNF超家族(TNFSF)命名法，可以参见http//www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily/tnftop.html。
表2TNF受体超家族
因而，在有用的实施方案中，源自肿瘤坏死因子超家族中的受体的特异性结合构件选自受体TNFRSF1A，TNFRSF1B，LTBR，TNFRSF4，TNFRSF5，TNFRSF6，TNFRSF6B，TNFRSF7，TNFRSF8，TNFRSF9，TNFRSF10A，TNFRSF10B，TNFRSF10C，TNFRSF10D，TNFRSF11A，TNFRSF11B，TNFRSF12，TNFRSF12L，TNFRSF13B，TNFRSF13C，TNFRSF14，NGFR，TNFRSF17，TNFRSF18，TNFRSF19，TNFRSF19L，TNFRSF21，TNFRSF22和TNFRSF23。但是，预期可以鉴别出该蛋白家族的其它有用受体，并由此可以鉴别出其它的功能特异性结合构件。
在有用的实施方案中，特异性结合元件源自TNF受体TNFRSF1A(TNFrI，p55受体)和/或TNFRSF1B(TNFrII，p75 TNF受体)。更具体地，已经证实了TNFRSF1B受体和其亚基能有效地特异性地结合和中和TNF。作为实例，TNF结合蛋白Eternacept是由TNFRSF1B受体的胞外域(即TNFRSF1B受体的亚基)组成的融合蛋白。因此，在具体的实施方案中，根据本发明的三聚多肽包括特异性结合元件，其是TNFRSF1B受体(TNFrII)的亚基或片段，例如US 5,712,155公开的TNFRSF1B受体片段。因此，在有用的实施方案中，所述特异性结合元件是含有选自下述的氨基酸序列的多肽TNFRSF1B 1-235(SEQ ID NO76)，TNFRSF1B 1-185(SEQID NO77)，TNFRSF1B 1-163(SEQ ID NO78)和TNFRSF1B 1-142(SEQ IDNO79).
在其它有用的实施方案中，如下面的实施例所公开的，所述特异性结合元件可以是TNFRSF1B受体(TNFrII)的一个或多个片段、和这种片段的组合，例如含有选自下述的DNA序列编码的氨基酸序列的多肽TNFRSF1B D1D2(SEQ ID NO13)，TNFRSF1B D1D2，1/6(SEQ ID NO15)，TNFRSF1B D1D2 1/4(SEQ ID NO17)，TNFrII D1D2，1/3(SEQ ID NO19)，TNFRSF1B D1D2，1/2(SEQ ID NO21)，TNFRSF1B D1D4(SEQ ID NO23)，TNFRSF1B D2(SEQ ID NO25)，TNFRSF1B D2，1/6(SEQ ID NO26)，TNFRSF1B D2，1/4(SEQ ID NO27)，TNFRSF1B D2，1/3(SEQ ID NO28)，TNFRSF1B D2，1/2(SEQ ID NO29)和TNFRSF1B D2D4(SEQ ID NO30)。
根据本发明，能结合三聚细胞因子的特异性结合元件还可以是抗体或抗体片段。在本文中，术语“抗体”用于描述天然的、或者部分地或全部地合成的免疫球蛋白。由于可以以多种方式修饰抗体，术语“抗体”应当理解为包括了具有所需三聚细胞因子特异性的结合域的任何特异性结合元件或物质。因此，该术语涵盖了抗体片段、抗体的衍生物、功能等同物和同系物，包括含有免疫球蛋白结合域的任何多肽，无论是天然的，还是全部地或部分地合成的。因此，也包括含有免疫球蛋白结合域与另一多肽相融合的嵌合分子、或等同物。该术语还包括具有结合域的任何多肽或蛋白，所述结合域是抗体结合域或与其同源，例如抗体模拟物。它们可以源自天然来源，或者它们是部分地或全部地合成的。抗体的实例是免疫球蛋白同种型和它们的同种型亚类；含有抗原结合域的片段，例如Fab，scFv，Fv，dAb，Fd；和二体(diabodies)。
US 6,451,983B2描述了人肿瘤坏死因子的抗体，其能i.a.中和TNF的生物学活性。更具体地，US 6,451,983B2提供了能结合某些特定拓扑学区域内的成熟人TNF(SEQ ID NO80)的抗体或其片段。因此，在本发明的有用的实施方案中，该特异性结合元件是能在选自由下列氨基酸残基组成的区域内的至少一个区域结合成熟的人TNF(SEQ ID NO80)的抗体或其片段氨基酸残基1-18，1-20，1-26，1-30，12-22，22-31，22-40，36-45，49-97，49-98，56-79，58-65，69-97，70-87，76-90，96-105，105-128，108-128，110-127，115-125，117-128，132-157，135-155，136-153，138-149，141-153或146-157。
US 6,451,983B2还提供了可以用于本发明的特异性单克隆抗体。因此，能结合人TNF的特异性结合元件可以是选自下述的抗体或抗体片段MAb 1(ECACC 89080301)，MAb 21(ECACC 90012432)，MAb 25(ECACC89121401)，MAb 32(ECACC 89080302)，MAb 37(ECACC 89080303)，MAb42(ECACC 89080304)，MAb 47(ECACC 89121402)，MAb 53(ECACC90012433)和MAb 54(ECACC 89083103)，其中ECACC是指欧洲动物细胞培养物中心(European Collection of Animal Cell Cultures)。
有用的抗体的其它实例包括US 6,090,382中公开的人化抗体D2E7和WO/00194585中公开的人化抗体片段CDP 870。
在具体的实施方案中，本发明的特异性结合元件可以含有抗体类似物或人工抗体，例如WO/0248189中公开的具有C-型凝集素样结构域(C-type lectin-like domains，CTLD)的支架结构的蛋白。正如将从下面的实施例中明白的，基于能结合TNF的CTLD抗体类似物的有用人tetranectin可以选自TN3-2-B(SEQ ID NO103)、TN3-2-C(SEQ IDNO104)和TN3-2-D(SEQ ID NO105)。
本发明的一个重要的方面是，除了特异性结合元件外，三聚多肽的单体还含有三聚化结构域。在本文中，术语″三聚化结构域″是能与其它类似的或相同的三聚化结构域相互作用的肽、蛋白或蛋白的部分。这种相互作用是能生成三聚蛋白或多肽的类型。这样的相互作用可以是由三聚化结构域的组分之间的共价键造成，以及由氢键力、疏水力、范德华力和盐桥造成。
三聚化结构域的一个实例公开在WO 95/31540中，其中公开了含有胶凝素(collectin)颈区的多肽。构成胶凝素颈区的氨基酸序列可以附着到选择的任何多肽上。然后可以在合适的条件下，用含有胶凝素颈区氨基酸序列的3个多肽制备三聚体。
在目前优选的实施方案中，三聚化结构域源自tetranectin，更具体地包含tetranectin三聚化结构单元(此后称作TTSE)，其在WO98/56906中详细公开。TTSE的氨基酸序列如SEQ ID NO81所示。TTSE的三聚化作用由卷曲螺旋结构造成，该结构与2个其它的TTSE的卷曲螺旋结构相互作用，形成3个α螺旋卷曲螺旋三聚体，其即使在相对较高的温度下也是特别稳定的。术语TTSE也意在包括天然产生的tetranectin蛋白家族成员的TTSE的变体、已经对其氨基酸序列进行了修饰而未在任何实质程度上负面影响TTSE形成α螺旋卷曲螺旋三聚体的能力的变体。因此，根据本发明的三聚多肽可以包含作为三聚化结构域的TTSE，其含有与SEQ ID NO SEQ ID NO81的序列具有至少68％、例如至少75％、包括至少87％、例如至少92％的氨基酸序列相同性的序列。与此相一致，TTSE(SEQ ID NO81)的半胱氨酸残基No.50可以有利地诱变成丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或任何其它的氨基酸残基，以防止形成不希望的链间二硫键，后者会导致不希望的多聚化作用。
在另一个实施方案中，可以如下修饰TTSE三聚化结构域(SEQ IDNO81)(i)插入多组氨酸序列和/或血液凝固因子Xa的切割位点，(ii)用Ser替换Cys 50，和(iii)包含C-末端KGS序列。
下面的实施例中提供了根据本发明的不同三聚多肽的几个实例，其中已经应用了上面的TTSE三聚化结构域。它们包括基于CTLD的TNF结合单元TN-2-B(SEQ ID NO106)、TN-2-C(SEQ ID NO108)和TN-2-D(SEQID NO107)、和三聚体化的人TNFRII片段AD1D4-GSS-I10(SEQ ID NO109)。
根据本发明，所述特异性结合元件可以连接到三聚化结构域的N-或C-末端氨基酸残基。但是也预见到，在某些实施方案中，可以将特异性结合元件有利地连接到单体的三聚化结构域N-末端和C-末端，由此提供含有6个能结合三聚细胞因子的特异性结合元件的三聚多肽。
可以明白，有弹性的分子连接物可以任选地置于特异性结合元件和三聚化结构域之间，并共价地连接它们。在某些实施方案中，连接物是约1-20个氨基酸残基的多肽序列。连接物可以小于10个氨基酸，最优选地，为5，4，3，2，或1个。在某些情况下，9、8、7或6个氨基酸是合适的。在有用的实施方案中，连接物基本上是无免疫原性的，不易于蛋白水解切割，且不含有已知能与其它残基相互作用的氨基酸残基(例如半胱氨酸残基)。
通过在能表达三聚多肽的条件下、培养用编码三聚多肽的载体转化的宿主，可以在任何合适的标准蛋白表达系统中表达本发明的三聚多肽。优选地，表达系统是这样的系统，其中所需蛋白可以容易地分离和进行体外再折叠。作为一般规律，原核表达系统是优选的，因为可以得到高产量的蛋白，并且有有效的纯化和再折叠方法可供利用。因而，本领域的技术人员无需过多实验、凭借自身的能力和判断即可选择合适的或中意的表达系统。类似地，一旦选定了本发明的三聚多肽的一级氨基酸序列，结合所选宿主中的密码子偏好、宿主中的分泌信号序列的必要性、信号序列中的蛋白酶切割位点的导入等因素，本领域的普通技术人员即可容易地设计合适的能编码目标蛋白的重组DNA构建体。这些重组DNA构建体可以框架内地插入适用于选定宿主的许多表达载体中的任意一个中。合适的或中意的表达载体的选择也是在本领域技术人员的能力和判断力之内。优选地，表达载体包含能驱动重组构建体的表达的强启动子。最后，使用本领域熟知的合适的标准方法，可以分离出三聚多肽，并任选地进行其它的操作，例如冻干。
通过本领域熟知的任何合适的方法，可以用根据本发明的三聚多肽制备药物组合物。该组合物可以含有与三聚多肽在一起的一种或多种可接受的载体、和任选的其它治疗成分。该载体必须是在与其它成分相容且对其受体无毒害的意义上为可接受的。通常，制备药物组合物的方法包括将活性成分和载体相结合的步骤。
本发明的治疗应用包括通过给需要治疗的动物施用治疗有效量的根据本发明的三聚多肽来治疗该动物的疾病或障碍。如上所述，已知三聚细胞因子、特别是TNF配体超家族的三聚细胞因子，是能充当胞间信号转导分子的多效多肽，其能控制和调节免疫和炎症反应。因而应当指出，本发明的三聚多肽可以用于治疗三聚细胞因子介导的广范围的障碍和疾病，包括炎症疾病、自身免疫病、免疫障碍、感染、恶性瘤和神经变性病。在一个有用的实施方案中，疾病是肿瘤坏死因子介导的病理学，例如类风湿性关节炎、银屑病和克罗恩氏病。
通过任何合适的技术，包括肠胃外地，可以将本发明的三聚多肽直接施用给动物，也可以局部地或全身地施用。具体的给药途径依赖于，例如，动物的病史。肠胃外给药的实例包括皮下、肌肉内、静脉内、动脉内和腹膜内给药。
本文中可由三聚融合蛋白潜在地治疗的动物包括哺乳动物，例如人。
最后，本发明提供了检测样品中的三聚多肽细胞因子的实验方法，其包括(i)使样品与根据本发明的三聚多肽接触，和(ii)检测三聚多肽向三聚细胞因子的结合。
现在，通过下面的非限制性实施例和附图来进一步描述本发明。
图1显示了肿瘤坏死因子超家族内的三聚细胞因子与相应的细胞结合型单体受体的结合，其启动2个细胞因子受体的进一步募集，导致六聚细胞因子-受体信号单元的形成。
图2显示了二价结合物与肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)内的三聚细胞因子的结合，该二价结合物与三聚细胞因子形成1∶1复合物。当所述二价结合物结合三聚TNFSF细胞因子时，二价结合物分子仅仅占据3个可能的受体结合位点中的2个，第3个受体结合位点仍是开放的。这暗示着，开放的细胞因子受体结合位点可以结合细胞表面三聚细胞因子受体，并且，由于该受体在细胞表面的高局部浓度，从而开始进一步募集三聚受体，并介导信号传递。
图3显示了三聚细胞因子的结合物，其能与三聚细胞因子形成1∶1复合物，并同时有效地结合三聚细胞因子的所有3个受体结合位点，由此没有受体结合位点仍是开放的。细胞因子向细胞表面的积聚受到阻断，也就不会发生信号转导。
图4显示了10倍稀释的三聚体化受体片段D1D4GSSI10Trip在鼠成纤维细胞细胞系L929实验中在固定的两种不同TNFα浓度(1.0ng/ml和0.1ng/ml)下对TNFα介导的细胞毒性的抑制。
实施例实施例1用于生产三聚细胞因子结合物的trip大肠杆菌表达质粒和噬菌粒的设计和构建噬菌粒使用标准方法，通过将用寡核苷酸引物C-sfikpn-TRI(SEQ ID NO1)和N-sfikpn-TRI(SEQ ID NO2)由表达质粒pTtripb扩增的经Sfi I和Not I限制性消化的DNA片段sktripB连接到Amersham PharmaciaBiotech(编号27-9401-01)提供的经Sfi I和Not I预切割的载体pCANTAB 5E中，构建了噬菌粒psktripB。sktripB插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
使用标准方法，通过将用寡核苷酸引物C-sfikpn-TRI(SEQ ID NO1)和N-sfikpn-I10TRI(SEQ ID NO4)从表达质粒pTtripb扩增的、经SfiI和Not I限制性消化的DNA片段skI10tripB连接到Amersham PharmaciaBiotech(编号27-9401-01)提供的经Sfi I和Not I预切割的载体pCANTAB 5E中，构建了噬菌粒pskI10tripB。skI10tripB插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示。
表达质粒使用标准方法，通过将用寡核苷酸引物C-bamkpn-TRI(SEQ ID NO6)和N-bamkpn-TRI(SEQ ID NO7)从表达质粒pTtripb扩增的、经BamH I和Hind I性消化限制的DNA片段bktripB连接到经BamH I和Hind I限制性消化的表达质粒pT7H6中，构建了表达质粒pT7H6-bktripB。bktripB的核苷酸序列如SEQ ID NO8所示。
使用标准方法，通过将用寡核苷酸引物C-bamkpn-TRI(SEQ ID NO6)和N-bamkpn-I10TRI(SEQ ID NO9)从表达质粒pTtripb扩增的、经BamH I和Hind I限制性消化的DNA片段bkI10tripB连接到经BamH I和Hind I限制性消化的表达质粒pT7H6中，构建了表达质粒pT7H6-bkI10tripB。bkItripB的核苷酸序列如SEQ ID NO10所示。
实施例2使用TNFRII片段的三聚TNF结合物的设计和构建TNF受体TNFRSF1B(TNFRII)的片段和亚基用于构建基于源自tetranectin的三聚化结构域TripB的三聚TNF结合物。如下进行设计和克隆将TNFRSF1B片段克隆进噬菌粒载体使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)和D2kpn-fo(SEQ ID NO12))、Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D2连接到Sfi I和Kpn I切割载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD1D2tripB。得到的D1D2的核苷酸序列如SEQ ID NO13所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)D1/6kpn-fo(SEQ IDNO14))、经Sfi I和Kpn I切割的DNA片段D1D1/6连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD1D2，1/6tripB。得到的D1D2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO15所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)和D1/4kpn-fo(SEQ ID扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)和D1/6kpn-fo(SEQ IDNO14))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D1/6连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD1D2，1/6I10tripB。得到的D1D2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO15所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)和D1/4kpn-fo(SEQ IDNO16))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D1/4连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD1D2，1/4I10tripB。得到的D1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO17所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)和D1/3kpn-fo(SEQ IDNO18))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D1/3连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD1D2，1/3I10tripB。得到的D1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO19所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)和D1/2kpn-fo(SEQ IDNO20))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D1/2连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD1D2，1/2I10tripB。得到的D1D2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO21所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)和D4kpn-fo(SEQ ID NONO16))、经Sfi I和Kpn I限制性切割的DNA片段D1D1/4连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD1D2，1/4tripB。得到的D1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO17所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)和D1/3kpn-fo(SEQ IDNO18))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D1/3连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD1D2，1/3tripB。得到的D1D2，1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO19所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)和D1/2kpn-fo(SEQ IDNO20))、经Sfi I和Kpn I限制性切割的DNA片段D1D1/2连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD1D2，1/2tripB。得到的D1D2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO21所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)和D4kpn-fo(SEQ ID NO22))、经Sfi I和Kpn I限制性切割的DNA片段D1D4连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD1D4tripB。得到的D1D4的核苷酸序列如SEQ ID NO23所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D1-rev(SEQ ID NO11)和D2kpn-fo(SEQ ID NO12))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D2连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD1D2I10tripB。得到的D1D2的核苷酸序列如SEQ ID NO13所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA22))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1D4连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD1D4I10tripB。得到的D1D4的核苷酸序列如SEQ ID NO23所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D2kpn-fo(SEQ IDNO12))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD2tripB。得到的D2的核苷酸序列如SEQ ID NO25所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D1/6kpn-fo(SEQ IDNO14))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/6连接到经SfiI和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD2，1/6tripB。得到的D2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO26所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D1/4kpn-fo(SEQ IDNO16))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/4连接到经SfiI和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD2，1/4tripB。得到的D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO27所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D1/3kpn-fo(SEQ IDNO18))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/3连接到经SfiI和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD2，1/3tripB。得到的D2，1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO28所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D1/2kpn-fo(SEQ IDNO20))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/2连接到经SfiI和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD21/2tripB。得到的D2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO29所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D4kpn-fo(SEQ ID NO22))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2D4连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体psktripB中，构建了噬菌粒载体pD2D4tripB。得到的D2D4的核苷酸序列如SEQ ID NO30所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D2kpn-fo(SEQ IDNO12))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD2I10tripB。得到的D2的核苷酸序列如SEQ ID NO25所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D1/6kpn-fo(SEQ IDNO14))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/6连接到经SfiI和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD2，1/6I10tripB。得到的D2，1/6的核苷酸序如SEQ ID NO26所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D1/4kpn-fo(SEQ IDNO16))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/4连接到经SfiI和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD2，1/4I10tripB。得到的D2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO27所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D1/3kpn-fo(SEQ IDNO18))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/3连接到经SfiI和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD2，1/3I10tripB。得到的D2，1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO28所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D1/2kpn-fo(SEQ IDNO20))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D1/2连接到经SfiI和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD2，1/2I10tripB。得到的D2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO29所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物D2-rev(SEQ ID NO24)和D4kpn-fo(SEQ ID NO22))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段D2D4连接到经Sfi I和Kpn I切割的载体pskI10tripB中，构建了噬菌粒载体pD2D4I10tripB。得到的D2D4的核苷酸序列如SEQ ID NO30所示。
将TNFRSF1B(TNFRII)受体片段克隆至表达载体中使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D2kpn-fo(SEQ IDNO12))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D2连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D2tripB。得到的FXD1D2的核苷酸序列如SEQ ID NO32所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D1/6kpn-fo(SEQID NO14))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/6连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D2，1/6tripB。得到的FXD1D2，1/6的核苷酸序列如SEQ IDNO33所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D1/4kpn-fo(SEQID NO16))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D2，1/4tripB。得到的FXD1D2，1/4的核苷酸序列如SEQ IDNO34所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D1/3kpn-fo(SEQID NO18))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/3连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D2，1/3tripB。得到的FXD1D2，1/3的核苷酸序列如SEQ IDNO35所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D1/2kpn-fo(SEQID NO20))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/2连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D2，1/2tripB。得到的FXD1D2，1/2的核苷酸序列如SEQ IDNO36所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D4kpn-fo(SEQ IDNO22))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D4tripB。得到的FXD1D4的核苷酸序列如SEQ ID NO37所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)和D2kpn-fo(SEQ IDNO12))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD2连接到经BamHI和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2tripB。得到的FXD2的核苷酸序列如SEQ ID NO39所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)bamD2-rev(SEQ IDNO38)和D1/6kpn-fo(SEQ ID NO14))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1/6连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2，1/6tripB。得到的FXD2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO40所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)和D1/4kpn-fo(SEQID NO16))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2，1/4tripB。得到的FXD2，1/4的核苷酸序列如SEQ ID NO41所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)和D1/3kpn-fo(SEQID NO18))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/3连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2，1/3tripB。得到的FXD2，1/3的核苷酸序列如SEQ ID NO42所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)和D1/2kpn-fo(SEQID NO20))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1/2连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2，1/2tripB。得到的FXD2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO43所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)和D4kpn-fo(SEQ IDNO22))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD2D4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2D4tripB。得到的FXD2D4的核苷酸序列如SEQ ID NO44所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D2kpn-fo(SEQ IDNO12))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D2连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D2I10tripB。得到的FXD1D2的核苷酸序列如SEQ ID NO32所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D1/6kpn-fo(SEQID NO14))，经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/6连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D2，1/6I10tripB。得到的FXD1D2，1/6的核苷酸序列如SEQID NO33所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D1/4kpn-fo(SEQID NO16))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D2.1/4I10tripB。得到的FXD1D2，1/4的核苷酸序列如SEQID NO34所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D1/3kpn-fo(SEQID NO18))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/3连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D2，1/3I10tripB。得到的FXD1D2，1/3的核苷酸序列如SEQID NO35所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D1/2kpn-fo(SEQID NO20))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/2连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D2，1/2I10tripB。得到的FXD1D2，1/2的核苷酸序列如SEQID NO36所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD1-rev(SEQ ID NO31)和D4kpn-fo(SEQ IDNO22))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD1D4I10tripB。得到的FXD1D4的核苷酸序列如SEQ ID NO37所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)和D2kpn-fo(SEQ IDNO12))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD2连接到经BamHI和Kpn I切割的载体PT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2I10tripB。得到的FXD2的核苷酸序列如SEQ ID NO39所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)和D1/6kpn-fo(SEQID NO14))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1/6连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2，1/6I10tripB。得到的FXD2，1/6的核苷酸序列如SEQ ID NO40所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)和D1/4kpn-fo(SEQID NO16))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2，1/4I10tripB。得到的FXD2，1/4的核苷酸序列如SEQ IDNO41所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)和D1/3kpn-fo(SEQID NO18))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1D1/3连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2，1/3I10tripB。得到的FXD2，1/3的核苷酸序列如SEQ IDNO42所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)和D1/2kpn-fo(SEQID NO20))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD1/2连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2，1/2I10tripB。得到的FXD2，1/2的核苷酸序列如SEQ ID NO43所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamD2-rev(SEQ ID NO38)和D4kpn-fo(SEQ IDNO22))、经Sfi I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXD2D4连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7H6FXD2D4I10tripB。得到的FXD2D4的核苷酸序列如SEQ ID NO44所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5(SEQ ID NO82)和pKpnI-I162(SEQID NO83))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段AD1D4-I162连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7-bktripB中，构建了表达载体pT7AD1D4-I162-tfipB。得到的AD1D4-I162-tripB的核苷酸序列如SEQ IDNO84所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5(SEQ ID NO82)和pKpnI-GSS(SEQ IDNO85))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段AD1D4-GSS连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7-bktripB中，构建了表达载体pT7AD1D4-GSS-tripB。得到的AD1D4-GSS-tripB的核苷酸序列如SEQ IDNO86所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5(SEQ ID NO82)和pKpnI-D235(SEQID NO87))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段AD1D4-D235连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7-bktripB中，构建了表达载体pT7AD1D4-D235-tripB。得到的AD1D4-D235-tripB的核苷酸序列如SEQ IDNO88所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5(SEQ ID NO82)和pKpnI-I162(SEQID NO83))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段AD1D4-I162连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7AD1D4-I162-I10-tripB。得到的AD1D4-I162-I10-tripB的核苷酸序列如SEQ ID NO89所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5(SEQ ID NO83)和pKpnI-GSS(SEQ IDNO85))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段AD1D4-GSS连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7AD1D4-GSS-I10-tripB。得到的AD1D4-GSS-I10-tripB的核苷酸序列如SEQ ID NO90所示。
使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物pBamHI-A5(SEQ ID NO83)和pKpnI-D235(SEQID NO87))、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段AD1D4-D235连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7-bkI10tripB中，构建了表达载体pT7AD1D4-D235-I10-tripB。得到的AD1D4-D235-I10-tripB的核苷酸序列如SEQ ID NO91所示。
使用标准方法，通过将从cDNA(用寡核苷酸引物pKpnI-V17(SEQ IDNO92)和pBAD6H(SEQ ID NO93))扩增的、经Kpn I和Hind III限制性消化的DNA片段V17-TripB连接到经Kpn I和Hind III切割的载体pT7AD1D4-GSS-tripB中，构建了表达载体pT7AD1D4-GSS-V17-tripB。得到的AD1D4-GSS-V17-tripB的核苷酸序列如SEQ ID NO94所示。
使用标准方法，通过将从cDNA(用寡核苷酸引物pKpnI-V17(SEQ IDNO92)和pBAD6H(SEQ ID NO93))扩增的经Kpn I和Hind III限制性消化的DNA片段V17-TripB连接到经Kpn I和Hind III切割的载体pT7AD1D4-D235-tripB中，构建了表达载体pT7AD1D4-D235-V17-tripB。得到的AD1D4-D235-V17-tripB的核苷酸序列如SEQ ID NO95所示。
实施例3三聚体化的TNFRII片段AD1D4-GSS-I10-TripB的生产、再折叠和纯化T7RNA聚合酶依赖性的表达质粒pT7D1D4GSSI10(能表达TNFRII衍生物AD1D4-GSS-I10-TripB)的构建如上面的实施例2所述。
如Studier和Moffat，J.Mol.Biol.，189113-130，1986所述，以中等规模(6×1升)培养和表达大肠杆菌BL21细胞中的质粒pT7AD1D4-GSS-I10，生产了三聚体化的人TNFRII片段AD1D4-GSS-I10(SEQ ID NO109)。简言之，在37℃的指数生长培养物(OD600值为0.8)以感染复数约为5用噬菌体λ-CE6感染。在离心收集细胞之前，培养物在37℃再生长3小时。通过渗透压休克和超声处理裂解细胞，将总细胞蛋白萃取到苯酚(用Trisma碱调节到pH 8)中。通过加入2.5倍体积的乙醇和离心，从苯酚相中沉淀出蛋白。将蛋白沉淀溶解到含有6M氯化胍、50mM Tris-HCl pH 8和50mM dithioerythriol的缓冲液中。在Sephadex G-25(Amersham Biosciences)上用8M脲、0.5M NaCl、50mM Tris-HCl pH 8和5mM 2-巯基乙醇进行凝胶过滤后，将粗蛋白制品应用到Ni2+活化的NTA-琼脂糖(Qiagen，Germany)柱上进行融合蛋白的纯化(Hochuli等，1988)，在固定化到柱上时，如WO 94/18227所述进行循环折叠过程。
在加入还原剂和/或使用之前，将为液相色谱制备的所有缓冲液在真空下脱气。
在将粗蛋白提取物上样到Ni2+NTA-琼脂糖柱上后，通过用1柱体积的上样缓冲液、随后用6M氯化胍(Guanidinium chloride)、50mMTris-HCl和5mM 2-巯基乙醇洗涤，直到柱洗出液在280nm的光密度(OD)是稳定的，从大肠杆菌和λ噬菌体蛋白主要部分中纯化出了融合蛋白AD1D4-GSS-I10。
使用如表1所述的梯度方式，用0.5M NaCl、50mM Tris-HCl pH 8和2mM/0.2mM还原型/氧化型谷胱甘肽作为缓冲液A，用8M脲、0.5MNaCl、50mM Tris-HCl pH 8和3mM还原型谷胱甘肽作为缓冲液B，在Ni2+NTA-琼脂糖柱上重折叠融合蛋白。
循环折叠过程完成后，使用含有8M脲、0.5M NaCl、50mM Tris-HCl和10mM EDTA pH 8的缓冲液，从Ni2+NTA-琼脂糖柱上洗脱下AD1D4-GSS-I10融合蛋白。
通过在S-和Q-Sepharose(Amersham Biosciences)上的离子交换色谱，从二聚体和更高级的多聚体纯化出单体的AD1D4-GSS-I10融合蛋白将洗脱缓冲液洗脱的融合蛋白(约80％的融合蛋白物)在Sephadex G-25上凝胶过滤到含有8M脲、10mM Tris-HCl pH 8.0和25mM NaCl的缓冲液中，并应用到S-Sepharose离子交换柱上。将“穿过的”级分中的不结合蛋白直接上样到Q-Sepharose柱上。用从8M脲、25mM NaCl、10mM Tris-Hcl pH 8至8M脲、300mM NaCl、10mM Tris-Hcl pH 8的线性梯度，经10个柱体积，从Q-Sepharose柱洗脱出单体的AD1D4-GSS-I10融合蛋白。单体的AD1D4-GSS-I10融合蛋白在梯度的最开始处洗脱，而二聚体和更高级的多聚体较后洗脱。通过凝胶过滤到含有10mM HEPES pH 7.4和125mM NaCl的缓冲液中，将含有单体融合蛋白的级分复性和三聚体化。
表3缓冲液梯度控制方案
实施例4三聚体化的TNFRII片段AD1D4-GSS-I10的生物活性在L929细胞实验中检测TNFα介导的细胞毒性的抑制，检测三聚体化的TNFRII片段AD1D4-GSS-I10(如实施例3所述生产的)的生物活性。
使用鼠成纤维细胞细胞系L929(ECACC no.85011425)来检测TNFα介导的细胞毒性。将细胞维持在添加了10％FBS和抗生素(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)的RPMI 1640液体培养基(Biowhittaker，UK)中。将细胞以3×105细胞/ml涂布到含有75μl/孔的RPMI 1640完全培养基的96-孔平底微滴定平板(NUNC，Roskilde，Denmark)中，并在37℃、在5％CO2中培养过夜。在补充了2μg/ml放线菌素D(Sigma)的完全RPMI 1640培养基中，将重组人TNFα(rhTNFα，RD Systems，UK)(1ng/ml和0.1ng/ml)与各种浓度(10-倍稀释液)的三聚体化受体片段(AD1D4-GSS-I10)在37℃、在5％CO2中孵育1小时。此后，将75μl/孔的TNF-α/三聚体化受体片段混合物添加到细胞培养物中，在37℃、在5％CO2中孵育过夜。一式三份地测试了每种浓度的TNF-α/受体片段混合物。使用MTT(3-[4，5-二甲基-噻唑-2-基]-2，5-二-苯基-四唑鎓溴化物)作为CellTiter 96非放射性细胞增殖测试试剂盒(Promega)的一部分，检测了细胞增殖。为了制备足以用于一个96孔平板(含有在150μl体积中培养的细胞)的试剂，将3.0ml MTS溶液加入到150μl PMS中。加入30μl/孔的组合的MTS/PMS溶液，在使用ELISA平板读数器在492nm记录吸光度之前，将平板在37℃、在5％CO2中孵育1-4小时。在每个实验中，还包括TNFα和细胞的对照组、单独的细胞和缓冲液对照组。
实验结果总结在图4中。在存在最高浓度的AD1D4-GSS-I10的情况下TNFα的细胞毒性作用受到显著抑制，因而证实了该化合物的生物学活性。
实施例5使用D2E7抗体片段设计、构建和生产三聚TNF结合物选择了人化抗体D2E7的单链抗体可变区片段(scFv)作为结合物用于构建能结合TNF的三聚多肽基于US 6,090,382公开的序列，通过扩增D2E7的VH和VL域，可以构建三聚结合物。
含有位于N-末端scFv和C-末端三聚化结构域之间的Gly，Thr接头的三聚D2E7 scFv的设计和构建以2个步骤构建表达载体pT7H6FXD2E7tripB。第一步是构建pT7H6FX(D2E7VH)tripB。通过将从含有D2E7序列的DNA扩增的(用寡核苷酸引物FXVH(SEQ ID NO45)和VHBamKpn(SEQ ID NO46))、经Bgl II和KpnI限制性消化的DNA片段FX(D7E2VH)连接到经BamH I Kpn I切割的pT7H6bktripB载体中，构建出该载体。第二步是，通过将从含有D2E7序列的DNA扩增的(用寡核苷酸引物G4SVL(SEQ ID NO47)和VLkpn(SEQID NO48))、经BamH I Kpn I限制性消化的DNA片段G4SVL连接到经BamH I Kpn I切割的pT7H6FX(D2E7VH)tripB载体中，构建出pT7H6FXD2E7tripB。得到的FXD2E7的核苷酸序列如SEQ ID NO49所示。
含有位于N-末端scFv和C-末端三聚化结构域之间的Gly，Gly，Gly，Gly，Ser，Gly，Thr接头的三聚D2E7 scFv的设计和构建以2个步骤构建表达载体pT7H6FXD2E7G4StripB。第一步是，通过将从含有D2E7序列的DNA扩增的((用寡核苷酸引物FXVH(SEQ ID NO45)和VHBamKpn(SEQ ID NO46))、经Bgl II和Kpn I限制性消化的DNA片段FX(D7E2VH)连接到经BamH I Kpn I切割的pT7H6bktripB载体中，构建出pT7H6FX(D2E7VH)tripB。第二步是，通过将从含有D2E7序列的DNA扩增的(用寡核苷酸引物G4SVL(SEQ ID NO47)和VLG4Skpn(SEQ IDNO50))、经BamH I Kpn I限制性消化的DNA片段G4SVL连接到经BamHI Kpn I切割的pT7H6FX(D2E7VH)tripB载体中，构建出pT7H6FXD2E7tripB。得到的FXD2E7G4S的核苷酸序列如SEQ ID NO51所示。
含有位于N-末端三聚化结构域和C-末端scfv间的Gly，Ser接头的三聚D2E7 scFv的设计和构建使用标准方法，通过将从pT7H6FXD2E7G4StripB扩增的(用寡核苷酸引物bclVH(SEQ ID NO52)和VLhind(SEQ ID53))、经Bcl I和HindIII限制性消化的DNA片段连接到经BamH I和Hind III切割的载体pT76HFXtripa(Lorentsen，RH.等，Biochem J.；34783-87，2000)中，构建出表达载体pT76HFXTripAGSD2E7。得到的GSD2E7的核苷酸序列如SEQ ID NO54所示。
含有位于N-末端三聚化结构域和C-末端scFv之间的Gly，Ser，Gly，Gly，Glv，Gly，Ser接头的三聚D2E7 scFv的设计和构建使用标准方法，通过将从pT7H6FXD2E7G4StripB扩增的(用寡核苷酸引物bclG4SVH(SEQ ID NO55)和VLhind(SEQ ID53))、经Bcl I和Hind III限制性消化的DNA片段连接到经BamH I和Hind III切割的载体pT76HFXtripa(Lorentsen，RH.等，Biochem J.；34783-87，2000)中，构建出表达载体pT76HFXTripAG4SD2E7。得到的G4SD2E7的核苷酸序列如SEQ ID NO56所示。
为了制备上面的融合蛋白H6FXD2E7tripB，H6FXD2E7G4StripB，H6FXTripAD2D7TripA和H6FxTripAG4SD2E7，如Studier等(1990)所述，使质粒pT7H6FXD2E7tripB，pT7H6FXD2E7G4StripB，pT7H6FXTripAD2D7TripA和pT7H6FxTripAG4SD2E7在大肠杆菌BL21细胞中小规模地生长(1升；2xTY培养基，5mM MgSO4和1004g氨苄青霉素)。在37℃指数生长的培养物(OD600值为0.8)以感染复数约为5用噬菌体λCE6进行感染。使培养物在37℃再生长3小时，通过离心收集细胞。将细胞重新悬浮在50ml 0.5M NaCl、50mM Tris-HCl pH 8和1mM EDTApH 8中。向每份中加入苯酚(50ml，调节至pH 8)，超声处理混合物，以提取总蛋白。进行离心澄清(25分钟，10.000g)后，通过加入2.5体积的乙醇和离心，使粗蛋白级分从苯酚相中沉淀出来。将蛋白沉淀溶解到含有6M氯化胍、50mM Tris-HCl pH 8和0.1M dithioerythriol的缓冲液(15-25ml)中。在Sephadex G-25(Pharmacia，Sweden)上凝胶过滤到8M脲、1M NaCl、50mM Tris-HCl pH 8和10mM 2-巯基乙醇中后，将粗蛋白制品应用到Ni活化的NTA-琼脂糖柱(75ml柱体积)上进行纯化(Hochuli等，1988)。然后使洗涤缓冲液(6M胍-HCl，50mMTris-HCl pH 8和10mM 2-巯基乙醇)流经柱，直到得到稳定的基线值。
然后对每个柱应用pH梯度(1000ml，8M脲和10mM 2-巯基乙醇中的梯度，通过线性(每体积)混合含有50mM磷酸二氢钠(pH 5缓冲液)和50mM磷酸氢二钠(pH 8缓冲液)的溶液得到)，洗脱基本纯的融合蛋白。
为了通过Thgersen等(WO 94/18227)的方法进行体外重折叠，将20mg每种纯化的融合蛋白在重折叠″缓冲液B″(如下所述)中与足以产生约75ml填充床体积柱的Ni2+活化NTA-琼脂糖基质悬浮液的等份试样混合成悬浮液。然后对每种融合蛋白如WO 94/18227中关于纤溶酶原kringle 4所述进行反复的重折叠过程，但是使用含有0.5M NaCl、50mMTris-HCl pH 8，2mM谷胱甘肽和0.2mM氧化型谷胱甘肽的缓冲液作为″缓冲液A″，使用含有8M脲、1M NaCl、50mM Tris-HCl pH 8和2mM谷胱甘肽的缓冲液作为″缓冲液B″，在10℃进行含有融合蛋白的scFv的重折叠。
完成重折叠过程后，用300ml含有0.5M NaCl和50mM Tris-HClpH 8的缓冲液洗涤每个柱，以洗去谷胱甘肽。然后用20mM EDTA，0.5MNaCl和50mM Tris-HCL pH 8将每种蛋白的重折叠部分从NTA-琼脂糖中洗脱到洗脱缓冲液中。向每种蛋白样品中加入固态脲达到约8M的终浓度、并通过稀释或透析将NaCl浓度降低到5mM以下以后，再通过离子交换色谱(S-Sepharose，Pharmacia，1，6(i.d.)，经90厘米柱，在含有8M脲、5mM Tris-HCl(来自1M贮液、pH 8)和25mM醋酸钠(来自1M贮液、pH 5)的缓冲液中，以2ml/min洗脱，对每种正确折叠的融合蛋白产物进行最终的纯化。在水性缓冲液(例如磷酸盐缓冲的盐水)中透析后，回收每种纯的和正确地重折叠的融合蛋白，其产率为2-6mg/升生长培养物。
实施例6使用TNFRSF13B受体片段设计和构建三聚的APRIL结合物使用APRIL受体TNFRSF13B，并基于源自tetranectin的三聚化结构域TripB，构建针对三聚细胞因子APRIL的三聚结合物。具有不同接头的这样的结合物的设计和克隆如下所述TNFRSF13B6的克隆以2个步骤构建表达载体pT7H6FXTNFRS13B6tripB。第一步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bgliiFXΔTNFRSF13B(SEQ ID NO57)和ΔTNFRSF13Bkpn(SEQ IDNO58))、经Bgl II和Kpn I限制性消化的DNA片段FXΔTNFRSF13B连接到经BamH I和Kpn I切割的载体pT7H6-bktripB中，构建pT7H6FXΔTNFSF13B。第二步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物kpnΔTNFSF13B(SEQ ID NO59)和ΔTNFSF13B6kpn(SEQ ID NO60))、经Kpn I限制性消化的DNA片段ΔTNFRSF13B6连接到经Kpn I切割的pT7H6FXΔTNFSF13B载体中，构建出最终的表达载体pT7H6FXTNFRSF13B6tripB。得到的FXTNFRSF13B6的核苷酸序列如SEQ ID NO61所示。
TNFRSF13B10的克隆以2个步骤构建表达载体pT7H6FXTNFRS13B10tripB。第一步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bgliiFXΔTNFRSF13B(SEQ ID NO57)和ΔTNFRSF13Bkpn(SEQ ID NO58))、经Bgl II和Kpn I限制性消化的DNA片段FXΔTNFRSF13B连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建出pT7H6FXΔTNFRSF13B。第二步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物kpnΔTNFSF13B(SEQ ID NO59)和ΔTNFSF13B10kpn(SEQ ID NO62))、经Kpn I限制性消化的DNA片段ΔTNFSF13B10连接到经Kpn I切割的pT7H6FXΔTNFRSF13B载体中，构建出最终的表达载体pT7H6FXTNFRSF13B10tripB。得到的FXTNFRSF13B10的核苷酸序列如SEQ ID NO63所示。
TNFRSF13B20的克隆以2个步骤构建表达载体pT7H6FXTNFRS13B20tripB。第一步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bgliiFXΔTNFRSF13B(SEQ ID NO57)和ΔTNFRSF13Bkpn(SEQ ID NO58))、经Bgl II和Kpn I限制性消化的DNA片段FXΔTNFSF13B连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建出pT7H6FXΔTNFRSF13B。第二步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物kpnΔTNFRSF13B(SEQ ID NO59)和ΔTNFRSF13B20kpn(SEQ ID NO64))、经Kpn I限制性消化的DNA片段ΔTNFSF13B20连接到经Kpn I切割的pT7H6FXΔTNFRSF13B载体中，构建出最终的表达载体pT7H6FXTNFRSF13B20tripB。得到的FXTNFRSF13B20的核苷酸序列如SEQ ID NO65所示。
TNFRSF13B30的克隆以2个步骤构建表达载体pT7H6FXTNFRS13B30tripB。第一步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bgliiFXΔTNFRSF13B(SEQ ID NO57)和ΔTNFRSF13Bkpn(SEQ ID NO58))、经Bgl II和Kpn I限制性消化的DNA片段FXΔTNFRSF13B连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建出pT7H6FXΔTNFRSF13B。第二步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物kpnΔTNFRSF13B(SEQ ID NO59)和ΔTNFRSF13B30kpn(SEQ ID NO66))、经Kpn I限制性消化的DNA片段ΔTNFRSF13B30连接到经Kpn I切割的pT7H6FXΔTNFRSF13B载体中，构建出最终的表达载体pT7H6FXTNFRSF13B30tripB。得到的FXTNFRSF13B30的核苷酸序列如SEQ ID NO67所示。
TNFRSF13B61的克隆以2个步骤构建表达载体pT7H6FXTNFRS13B61tripB。第一步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bgliiFXΔTNFRSF13B(SEQ ID NO57)和ΔTNFRSF13Bkpn(SEQ ID NO58))、经Bgl II和Kpn I限制性消化的DNA片段FXΔTNFRSF13B连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建出pT7H6FXΔTNFRSF13B。第二步是，使用标准方法，通过将从人骨髓和人白细胞(Clontech Laboratories，Inc目录号7181-1和7182-1)的混合物分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物kpnΔTNFRSF13B(SEQ ID NO59)和ΔTNFRSF13B61kpn(SEQ ID NO68))、经Kpn I限制性消化的DNA片段ΔTNFRSF13B61连接到经Kpn I切割的pT7H6FXΔTNFRSF13B载体中，构建出最终的表达载体pT7H6FXTNFRSF13B61tripB。得到的FXTNFRSF13B61的核苷酸序列如SEQ ID NO69所示。
实施例7使用TNFRSF Fn14受体片段设计和构建三聚TWEAK结合物使用TWEAK受体TNFRSF Fn14，并基于源自tetranectin的三聚化结构域TripB构建针对三聚细胞因子TWEAK的三聚结合物。该结合物的设计和克隆如下所述使用标准方法，通过将从人心脏(Clontech Laboratories，Inc目录号7121-1)分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bamFn-rev(SEQ IDNO70)和FNkpn-fo(SEQ ID NO71)、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXFn14连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建出表达载体pT7H6FXFn14tripB。得到的FXFn14的核苷酸序列如SEQ ID NO72所示。
实施例8使用TNFRSF13C受体片段设计和构建三聚BAFF结合物使用BAFF受体TNFRSF13B，并基于源自tetranectin的三聚化结构域TripB构建针对相应三聚细胞因子BAFF的三聚结合物。该结合物的设计和克隆如下所述三聚TNFRSF13C片段的克隆使用标准方法，通过将从人淋巴结(Clontech Laboratories，Inc目录号7164-1)分离出的cDNA扩增的(用寡核苷酸引物bam13C-rev(SEQID NO73)和13Ckpn-fo(SEQ ID NO74)、经BamH I和Kpn I限制性消化的DNA片段FXTNFRSF13C连接到经BamH I和Kpn I切割的载体PT7H6-bktripB中，构建了表达载体pT7H6FXTNFSF13CtripB。得到的FXTNFRSF13C的核苷酸序列如SEQ ID NO75所示。
实施例9TNF的三聚体化CTLD结合物的分离和构建使用如以前在WO/0248189中公开的Tetranectin(SEQ ID NO96)C-型凝集素-样结构域(CTLD)的支架结构来分离和构建三聚细胞因子TNF(TNFα)的三聚结合单元。结合单元的设计和克隆如下所述文库构建和初步筛选使用噬菌体展示来分离TNF CTLD结合物。使用的噬菌体展示文库是基于tetranectin的单价CTLD形式(SEQ ID NO97)。
组合文库PhtCTLD-1b003(WO/0248189，实施例5)和与PhtCTLD-1b003的基本相同地制成的文库变体，该文库变体在装配反应中包括针对环1的两个额外随机化的寡核苷酸在tetranectin(SEQ IDNO98)的氨基酸残基位点116-122随机化的TN-lib3-tprev和TN-lib2-tprev(SEQ ID NO99)和针对环4的两个额外寡核苷酸在位点146-149随机化的TN-lib3-tpfo(SEQ ID NO100)和TN-lib2-tpfo(SEQ ID NO101)。使用约1×1012个噬菌体作为输入，进行了2轮筛选，在第一轮淘选中使用10μg/ml生物素化的-TNF，在第二轮淘选使用1μg/ml。
如下进行筛选在1ml PBS(PBS，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8gNaCl、1.44g Na2HPO4，2H2O，用水补加至1L，并用NaOH调节至pH 7.4)中洗涤20μl链霉抗生物素蛋白包被的顺磁珠(Dynal)2次，在室温下、在3％脱脂奶粉中封闭1小时。将在3％脱脂奶粉/PBS中的250μl预封闭噬菌体与250μl可溶的生物素化TNF混合，使之在37℃孵育30分钟。在PBS，0.1％Tween 20中洗涤1次、在PBS中洗涤2次链霉抗生物素蛋白珠后，将它们加入反应物中，以捕获结合了抗原的噬菌体。用PBS、0.1％Tween 20和PBS进一步洗涤珠子，用200μl 50mM dithiothreitol，将结合了抗原的噬菌体从珠子上洗脱30分钟。用洗脱的噬菌体重新感染指数生长的大肠杆菌TG1细胞，然后涂布平板，并在含有2％葡萄糖和0.1mg/ml氨苄青霉素的2xTY琼脂平板上滴定。
基本上按照WO/0248189所述，通过在ELISA中分析与TNFα的结合而从选择的群体中筛选出单个克隆，只是在ELISA中用于覆盖的抗原是5μg/ml TNF。
在第2轮筛选中分离出了称作TN3-2的特异性TNFα结合物(表4)。
次级文库构建和亲合力驱动的筛选研究了向TN3-2引入新的序列变化是否能提高TN3-2的TNF亲合力。为了构建TN3-2突变体文库，使用TN3-2克隆作为模板，使用寡核苷酸TN-lib2-tpfo(SEQ ID NO101)和TN-lib3-tpfo(SEQ ID NO100)在环4中进行新的随机化(Lib.TN3-2loop4r)。基本上按照WO/0248189所述进行文库构建。
在含有递减浓度的生物素化TNF(100ng/ml至0.1ng/ml)的3轮亲合力驱动筛选中使用了TN3-2loop4r文库。如上所述进行选择。如上所述筛选阳性克隆。
结论亲本克隆TN3-2的序列与tetranectin在环1(Tetranectin氨基酸号116-122)和环4(Tetranectin氨基酸号146-149)中有所不同。对TN3-2loop4r文库进行3轮亲合力驱动筛选后，通过ELISA分析鉴别出阳性克隆，显示出48个克隆中的45个能结合TNFα。选出的一种鉴定的TNFα结合克隆的环1和环4序列以及它们对应的SEQ ID NO如表4所示(TN3-2-B，TN 3-2-C，TN 3-2-D)。
表4亲本克隆TN3-2的环1和环4中的氨基酸序列和从文库TN3-2loop4r分离出的3个亲合力成熟化克隆
atetranectin的环4序列之外的突变实施例10TNF的三聚体化CTLD结合物的亲合力检测将按照实施例7所述分离出的编码单体CTLD TNFα结合物的DNA插入片段亚克隆进大肠杆菌pBAD表达载体(Invitrogen Corp.，USA)中。使重组单体TNFα结合物在大肠杆菌中表达，并根据生产商的说明书从周质中纯化。在BiaCore上进行分析之前，将纯化的单体在10mM TrispH 8.0、150mM NaCl、2mM CaCl2中透析。
为了表达TNFα结合物的三聚形式，使用限制性内切核酸酶Bgl II和Mun I切割编码TNFα结合物的合适DNA插入片段(来自实施例7)，并将含有环1和4的DNA片段亚克隆进经Bgl II Mun I限制性消化的大肠杆菌pT7H6FX-htlec DNA(如WO 02/48189中的实施例1和图5所述)中。
在大肠杆菌中表达了重组的三聚TNFα结合物，基本上按照WO 94/18227的实施例9所述纯化未折叠的融合蛋白衍生物。
简而言之，通过将融合蛋白上样到处于8M脲、50mM Tris-HCl pH8.0、500mM NaCl、5mM 2-巯基乙醇中的带Ni2+的次氮基三醋酸(NTA)柱上，进行TNFα结合物的重折叠。上样以后，对柱进行循环重折叠过程。使用的重折叠缓冲液是复性缓冲液A(50mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，2mM CaCl2，2mM还原型谷胱甘肽和0.2mM氧化型谷胱甘肽)和变性缓冲液B(8M脲，50mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，2mMCaCl2，3mM还原型谷胱甘肽)。使用50mM Tris-HCl pH 8.0、500mM NaCl、10mM EDTA，将重折叠的融合蛋白从柱上洗脱下来，使用牛凝血因子Xa(Protein Engineering Technology，Aarhus，Denmark)，以1∶100(w/w)、在4℃切割融合蛋白过夜。通过在Sephadex G25上进行凝胶过滤，将切割后的蛋白换入8M脲、25mM醋酸钠缓冲液(pH 5)、50mM NaCl、1mMTris-HCl缓冲液中，并上样到10ml SP-Sepharose柱(AmershamBiosciences)上，用50mM至500M NaCl经20个柱体积进行梯度洗脱。通过非还原性SDS/PAGE分析进行判断，收集含有切割的单体蛋白的级分并合并，通过在PD10柱(Amersham Biosciences)上的凝胶过滤将缓冲液换成10mM Tris pH 8.0、150mM NaCl、2mM CaCl2。
在BIAcore 3000装置(BiaCore，Sweden)上进行了表面等离子体共振(SPR)结合分析。将要固定化的TNFα捕获抗体(AHC3712，BiosourceInternational)溶解到10mM醋酸钠pH 5.0中，并使用胺耦连试剂盒(BiaCore，Sweden)固定到CM5 BiaCore传感器芯片上。
以5μl/min的流速进行结合分析。在将蛋白样品上样之前，将芯片在10mM Tris pH 8.0，150mM NaCl，2mM CaCl2，50μM EDTA和0.005％表面活性剂P20中平衡。将TNFα以10μg/mL的浓度溶解到10mM TrispH 8.0，150mM NaCl，2mM CaCl2中，并注射10μL。使用KINJECT选项，注射单体或三聚形式的TNFα结合物的等份试样(20μl)进行5分钟的解离，然后用10mM甘氨酸pH 2.5再生芯片。在从1至200nM的6个不同蛋白浓度下测试TNFα结合物的结合。使用BIA评价程序3.2版(BiaCore)评价结合数据。
表5显示了来自BiaCore数据的动力学值。从单体结合物至相应的三聚结合物(TN-2-B，TN-2-C和TN-2-D)有亲合力的增加倍数，显示了将TNFα结合物TN3-2-B，TN3-2-C，TN3-2-D三聚体化的亲合力作用。
表5
通过将TNFα结合物三聚体化，亲合力(KD)有了显著增长。例如，单体的TN3-2-B具有非常差的koff值。与此相反，同一CTLD结合物的三聚形式(TN-2-B)的koff值提高了超过1000倍。总体上可以看出，三聚体化能将解离速度提高数倍。而且，实施例7的低亲合力亲本克隆TN3-2仅能以其三聚形式在BiaCore上检测到，因为其单体的亲合力低于检测限度。
参考文献Studier和Moffat(1986)，Journal of Molecular Biology 189113-130。
Hochuli，E.，Bannwarth，W.，Dbeli，H.，Gentz，R.和St über，D.(1988)，Bio/Technology 61321-1325.
Lorentsen，RH.等(2000)Biochemical Journal 34783-87.
序列表<110>Borean Pharma A/S<120>三聚细胞因子的三聚结合蛋白<130>3005<160>109<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>33<212>DNA<213>人<400>1ctgccatgcg gccgccttca gggagaccgt ctg 33<210>2<211>58<212>DNA<213>人<400>2gtgaccaggc ccagccggcc atgtaagtag ctaaggtacc gagccaccaa cccagaag 58<210>3<211>197<212>DNA<213>人<400>3ggcccagccg gccatgtaag tagctaaggt accgagccac caacccagaa gcccaagaag 60attgtaaatg ccaagaaaga tgttgtgaac acaaagatgt ttgaggagct caagagccgt 120ctggacaccc tggcccagga ggtggccctg ctgaaggagc agcaggccct gcagacggtc 180tccctgaagg cggccgc197<210>4<211>62<212>DNA<213>人<400>4gtgaccaggc ccagccggcc atgtaagtag ctaaggtacc attgtaaatg ccaagaaaga 60tg62<210>5<211>170<212>DNA<213>人<400>5ggcccagccg gccatgtaag tagctaaggt accattgtaa atgccaagaa agatgttgtg 60aacacaaaga tgtttgagga gctcaagagc cgtctggaca ccctggccca ggaggtggcc 120ctgctgaagg agcagcaggc cctgcagacg gtctccctga aggcggccgc170
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<223>TN3-2<400>102Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys1 5 10 15Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp20 25 30Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu35 40 45Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala50 55 60Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Lys Val Arg Ser Arg Tyr Phe Trp Met65 70 75 80Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Thr Glu Ile85 90 95
Thr Ala Gln Pro Asp Pro Arg His Thr Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser100 105 110Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Asp Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu115 120 125Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val130 135<210>103<211>137<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TN3-2-B<400>103Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys1 5 10 15Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp20 25 30Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu35 40 45Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala50 55 60Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Lys Val Arg Ser Arg Tyr Phe Trp Met65 70 75 80Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Thr Glu Ile85 90 95Thr Ala Gln Pro Asp Pro Thr Asn Asn Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser100 105 110Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu115 120 125Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val130 135<210>104<211>137<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TN3-2-C<400>104
Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys1 5 10 15Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp20 25 30Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu35 40 45Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala50 55 60Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Lys Val Arg Ser Arg Tyr Phe Trp Val65 70 75 80Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Thr Glu Ile85 90 95Thr Ala Gln Pro Asp Pro Thr Asn Arg Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser100 105 110Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Asp Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu115 120 125Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val130 135<210>105<211>137<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TN3-2-D<400>105Ala Leu Gln Thr Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys1 5 10 15Phe Leu Ala Phe Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp20 25 30Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu35 40 45Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala50 55 60Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Lys Val Arg Ser Arg Tyr Phe Trp Ile65 70 75 80
Asp Met Thr Gly Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Thr Glu Ile85 90 95Thr Ala Gln Pro Asp Pro Asn Asn Arg Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser100 105 110Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu115 120 125Pro Tyr Ile Cys Gln Phe Gly Ile Val130 135<210>106<211>181<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TN-2-B<400>106Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp1 5 10 15Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr20 25 30Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr35 40 45Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe50 55 60Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg65 70 75 80Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu85 90 95Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu100 105 110Gly Leu Asn Lys Val Arg Ser Arg Tyr Phe Trp Met Asp Met Thr Gly115 120 125Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Thr Glu Ile Thr Ala Gln Pro130 135 140Asp Pro Thr Asn Asn Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn145 150 155 160Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys
165 170 175Gln Phe Gly Ile Val180<210>107<211>181<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TN-2-D<400>107Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp1 5 10 15Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr20 25 30Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr35 40 45Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe50 55 60Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg65 70 75 80Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu85 90 95Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu100 105 110Gly Leu Asn Lys Val Arg Ser Arg Tyr Phe Trp Ile Asp Met Thr Gly115 120 125Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Thr Glu Ile Thr Ala Gln Pro130 135 140Asp Pro Asn Asn Arg Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn145 150 155 160Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys165 170 175Gln Phe Gly Ile Val180<210>108<211>181
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TN-2-C<400>108Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp1 5 10 15Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr20 25 30Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr35 40 45Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe50 55 60Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg65 70 75 80Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu85 90 95Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu100 105 110Gly Leu Asn Lys Val Arg Ser Arg Tyr Phe Trp Val Asp Met Thr Gly115 120 125Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Thr Glu Ile Thr Ala Gln Pro130 135 140Asp Pro Thr Asn Arg Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn145 150 155 160Gly Lys Trp Phe Asp Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys165 170 175Gln Phe Gly Ile Val180<210>109<211>256<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>AD1D4-GSS-I10<400>109Met Gly Ser Met Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro
1 5 10 15Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met20 25 30Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr35 40 45Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr50 55 60Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys65 70 75 80Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg85 90 95Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu100 105 110Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly115 120 125Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys130 135 140Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg145 150 155 160Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met165 170 175Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Ser Gly Ser Ser Gly Thr Ile Val180 185 190Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys195 200 205Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln210 215 220Gln Ala Leu Gln Thr Val Ser Leu Lys Gly Leu Glu Gln Lys Leu Ile225 230 235 240Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His245 250 25权利要求
1.含有3个单体的三聚多肽，其中每个所述的单体含有能结合三聚细胞因子的特异性结合元件，且每个所述的单体含有三聚化结构域。
2.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的三聚细胞因子是肿瘤坏死因子配体超家族的成员。
3.根据权利要求2的三聚多肽，其中所述的肿瘤坏死因子配体超家族的成员选自由下述组成的组LTA；TNF；LTB；TNFSF4；TNFSF5；TNFSF6；TNFSF7；TNFSF8；TNFSF9；TNFSF10；TNFSF11；TNFSF12；TNFSF13；TNFSF13B；TNFSF14；TNFSF15；和TNFSF18。
4.根据权利要求2的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件是源自肿瘤坏死因子受体超家族成员的多肽。
5.根据权利要求2的三聚多肽，其中所述的肿瘤坏死因子受体超家族成员选自由下述组成的组TNFRSF1A，TNFRSF1B，LTBR，TNFRSF4，TNFRSF5，TNFRSF6，TNFRSF6B，TNFRSF7，TNFRSF8，TNFRSF9，TNFRSF10A，TNFRSF10B，TNFRSF10C，TNFRSF10D，TNFRSF11A，TNFRSF11B，TNFRSF12，TNFRSF12L，TNFRSF13B，TNFRSF13C，TNFRSF14，TNFRSF Fn14，NGFR，TNFRSF17，TNFRSF18，TNFRSF19，TNFRSF19L，TNFRSF21，TNFRSF22和TNFRSF23。
6.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件源自TNFRSF1A(p55TNF受体)。
7.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件源自TNFRSF1B(p75TNF受体)。
8.根据权利要求7的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件是含有选自下述的氨基酸序列的多肽TNFRSF1B 1-235(SEQ ID NO76)，TNFRSF1B 1-185(SEQ ID NO77)，TNFRSF1B 1-163(SEQ ID NO78)和TNFRSF1B 1-142(SEQ ID NO79)。
9.根据权利要求7的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件是含有由选自下述的DNA序列编码的氨基酸序列的多肽TNFRSF1B D1D2(SEQ IDNO13)，TNFRSF1B D1D2，1/6(SEQ ID NO15)，TNFRSF1B D1D21/4(SEQID NO17)，TNFRSF1B D1D2，1/3(SEQ ID NO19)，TNFRSF1B D1D2，1/2(SEQ ID NO21)，TNFRSF1B D1D4(SEQ ID NO23)，TNFRSF1B D2(SEQ IDNO25)，TNFRSF1B D2，1/6(SEQ ID NO26)，TNFRSF1B D2，1/4(SEQ IDNO27)，TNFRSF1B D2，1/3(SEQ ID NO28)，TNFRSF1B D2，1/2(SEQ IDNO29)和TNFRSF1B D2D4(SEQ ID NO30)。
10.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件是抗体或抗体片段。
11.根据权利要求10的三聚多肽，其中所述的抗体或抗体片段能在至少一个区域内结合人TNF(SEQ ID NO80)，该区域选自由下述的氨基酸残基组成的区域氨基酸残基1-18，1-20，1-26，1-30，12-22，22-31，22-40，36-45，49-97，49-98，56-79，58-65，69-97，70-87，76-90，96-105，105-128，108-128，110-127，115-125，117-128，132-157，135-155，136-153，138-149，141-153和146-157。
12.根据权利要求11的三聚多肽，其中所述的抗体或抗体片段选自MAb 1(ECACC 89080301)，MAb 21(ECACC 90012432)，MAb 25(ECACC89121401)，MAb 32(ECACC 89080302)，MAb 37(ECACC 89080303)，MAb42(ECACC 89080304)，MAb 47(ECACC 89121402)，MAb 53(ECACC90012433)和MAb 54(ECACC 89083103)或其片段。
13.根据权利要求10的三聚多肽，其中所述的抗体是D2E7或其片段。
14.根据权利要求9的三聚多肽，其中所述的抗体是CDP 870或其片段。
15.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的特异性结合元件是具有C型凝集素样结构域(CTLD)支架结构的蛋白质。
16.根据权利要求15的三聚多肽，其中所述的具有C型凝集素样结构域的特异性结合元件是选自TN3-2-B(SEQ ID NO103)，TN3-2-C(SEQID NO104)和TN3-2-D(SEQ ID NO105)。
17.根据权利要求1的三聚多肽，其中所述的三聚化结构域是源自tetranectin。
18.根据权利要求17的三聚多肽，其中所述的源自tetranectin的三聚化结构域含有与SEQ ID NO81的序列具有至少68％氨基酸序列相同性的序列。
19.根据权利要求18的三聚多肽，其中所述的氨基酸序列相同性至少为75％，例如至少87％，包括至少92％。
20.根据权利要求17的三聚多肽，其中所述的源自tetranectin的三聚化结构域含有氨基酸序列SEQ ID NO81。
21.根据权利要求17的三聚多肽，其选自TN-2-B(SEQ ID NO106)，TN-2-C(SEQ ID NO108)，TN-2-D(SEQ ID NO107)和AD1D4-GSS-I10(SEQID NO109)。
22.根据权利要求1的三聚多肽，其中还含有位于所述特异性结合元件和三聚化结构域之间的接头。
23.一种药物组合物，其含有根据权利要求1-22中任一项的三聚多肽。
24.治疗患有由三聚细胞因子、例如肿瘤坏死因子介导的病理的对象的方法，包括给所述的对象施用有效量的根据权利要求1-22中任一项的三聚多肽或根据权利要求23的组合物。
25.根据权利要求24的方法，其中所述的肿瘤坏死因子介导的病理选自类风湿性关节炎、银屑病和克罗恩氏病。
26.制备含有3个单体的三聚多肽的方法，每个所述单体含有能结合三聚多肽细胞因子的特异性结合元件，且每个所述单体含有三聚化结构域，所述的方法包括下述步骤(i)在能表达所述三聚多肽的条件下，培养用编码所述三聚多肽的载体转化的宿主；和(ii)分离所述的三聚多肽。
27.根据权利要求26的方法，其中所述的特异性结合元件含有选自下述的氨基酸序列TNFRSF1B 1-235(SEQ ID NO76)，TNFRSF1B 1-185(SEQ ID NO77)，TNFRSF1B 1-163(SEQ ID NO78)和TNFRSF1B 1-142(SEQID NO79)。
28.根据权利要求26的方法，其中所述的特异性结合元件是多肽，其含有由选自下述的DNA序列编码的氨基酸序列TNFRSF1B D1D2(SEQ IDNO13)，TNFRSF1B D1D2，1/6(SEQ ID NO15)，TNFRSF1B D1D21/4(SEQID NO17)，TNFRSF1B D1D2，1/3(SEQ ID NO19)，TNFRSF1B D1D2，1/2(SEQ ID NO21)，TNFRSF1B D1D4(SEQ ID NO23)，TNFRSF1B D2(SEQ IDNO25)，TNFRSF1B D2，1/6(SEQ ID NO26)，TNFRSF1B D2，1/4(SEQ IDNO27)，TNFRSF1B D2，1/3(SEQ ID NO28)，TNFRSF1B D2，1/2(SEQ IDNO29)和TNFRSF1B D2D4(SEQ ID NO30)。
29.根据权利要求1-22中任一项的三聚多肽的应用。
30.根据权利要求1-22中任一项的三聚多肽在制备药物组合物中的应用。
31.检测样品中的三聚细胞因子的实验方法，其包括(i)使所述样品与根据权利要求1的三聚多肽接触，和(ii)检测所述三聚多肽与所述三聚细胞因子的结合。
全文摘要
本发明提供了能结合三聚细胞因子的三聚结合单元。更具体地，提供了含有三聚化结构域和3个单体的三聚多肽，所述单体含有能结合三聚细胞因子的结合元件。优选地，该三聚结合单元以这样的方式结合，使得在结合以后，能基本上封闭三聚细胞因子的全部受体结合位点，从而抑制三聚细胞因子的潜在生物活性。一方面，本发明涉及能结合肿瘤坏死因子配体超家族的三聚细胞因子例如TNF、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL和BAFF的三聚结合物。
文档编号C07K16/24GK1720263SQ200380104658
公开日2006年1月11日 申请日期2003年10月29日 优先权日2002年10月29日
发明者T·L·霍尔帝特, M·H·安德森, H·K·奥托 申请人:伯瑞恩药物公司