专利名称：调节nk细胞活性的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及与NK细胞表面存在的两个或多个抑制性受体交叉反应、并增强哺乳动物受试者或生物样品中NK细胞细胞毒性的抗体、抗体片段及其衍生物。本发明也涉及制作这类抗体、片段、变体和衍生物的方法；包含所述物质的药物组合物；这类分子和组合物(具体在治疗中)在增加受试者体内NK细胞活性或细胞毒性中的用途。
背景自然杀伤(NK)细胞是参与非常规免疫的淋巴细胞亚群。可以通过多种本领域公知的多种技术从例如血液样品、细胞提取法(cytapheresis)、收集库(collection)等获得NK细胞。
NK细胞的特征和生物学特性包括表达表面抗原，包括CD16、CD56、和/或CD57；细胞表面缺乏α/β或γ/δ TCR复合物；通过活化特异性溶细胞酶结合并杀伤不表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞的能力；杀伤表达NK活化受体-配体的肿瘤细胞或其它患病细胞的能力；释放刺激或抑制免疫应答的细胞因子的能力；以及经历多轮细胞分裂、产生具有与母细胞相似的生物学特性的子细胞的能力。在本发明文中，“活性”NK细胞指生物学活性NK细胞，更具体为具有裂解靶细胞的能力的NK细胞。例如，“活性”NK细胞能够杀伤表达NK活化受体-配体、并且不表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞(KIR不相容细胞)。
基于其生物学特性，在本领域提出多种依赖于调节NK细胞的治疗和免疫接种策略。然而，NK细胞活性由涉及刺激性和抑制性信号的复杂机制调节。因此，有效的NK细胞介导的治疗可能要求刺激这些细胞并中和抑制性信号。
NK细胞由主要组织相容性复合体(MHC)I类特异性抑制性受体负调节(K_rre等人，1986；_hlén等人，1989)。这些特异性受体与其它细胞上存在的MHC I类分子或HLA的多态性决定簇结合，并抑制NK细胞裂解。在人类中，被称为杀伤Ig样受体(killer Ig-likereceptors，KIRs)的受体家族的某些成员识别HLA I类等位基因。
KIR是存在于某些淋巴细胞亚群(包括NK细胞)上的受体大家族。KIR命名法基于细胞外结构域的数量(KIR2D或KIR3D)以及胞质尾区是长(KIR2DL或KIR3DL)或是短(KIR2DS或KIR3DS)。在人类，在存在于单独个体中的NK群内，给定KIR的存在或缺乏在NK细胞之间是可变的。在人群中也存在相对高水平的KIR分子多态性，某些KIR分子存在于一些(但并非全部)个体中。与适当的配体结合时，某些KIR基因产物引起淋巴细胞活性的刺激。已证实的刺激性KIR都具有含有带电荷跨膜残基的短胞质尾区，所述残基与含有免疫刺激性基序(ITAM)的接头分子结合。其它KIR基因产物实质上是抑制性的。所有经证实的抑制性KIR具有长胞质尾区，并且似乎根据KIR亚型与HLA抗原的不同亚群相互作用。抑制性KIR在其胞质内部分显示一个或数个招募磷酸酶的抑制性基序。已知的抑制性KIR受体包括KIR2DL和KIR3DL亚家族成员。具有两个Ig结构域的KIR受体(KIR2D)鉴定HLA-C同种异型KIR2DL2(原来指定为p58.2)或密切相关的基因产物KIR2DL3识别由2组HLA-C同种异型(Cw1、3、7和8)共享的表位，而KIR2DL1(p58.1)识别由交互的(reciprocal)1组HLA-C同种异型(Cw2、4、5和6)共享的表位。在HLA-C等位基因80位存在Lys残基指示KIR2DL1识别。在80位存在Asn残基指示KIR2DL2和KIR2DL3识别。重要的是，大多数HLA-C等位基因在80位具有Asn或Lys。一个具有三个Ig结构域的KIR，即KIR3DL1(p70)，识别由HLA-Bw4等位基因共享的表位。最后，具有三个Ig结构域的分子的同型二聚体KIR3DL2(p140)识别HLA-A3和HLA-A11。
尽管抑制性KIR及其它I类抑制性受体(Moretta等人，1997；Valiante等人，1997a；Lanier，1998)可能由NK细胞共表达，在任何给定个体的NK库(repertoire)中存在表达单个KIR的细胞，因此，相应的NK细胞仅被表达特定I类等位基因的组的细胞阻断。
经显示，KIR错配的NK细胞群或克隆(即表达与宿主HLA分子不相容的KIR的NK细胞群)是见于异源移植的移植抗白血病作用的最可能的媒介(Ruggeri等人，2002)。在给定个体内重新产生这种作用的一种方法将是使用阻断KIR/HLA相互作用的试剂。
经显示，KIR2DL1特异性单克隆抗体阻断KIR2DL1与Cw4(或类似物)等位基因的相互作用(Moretta等人，1993)。也有描述抗KIR2DL2/3单克隆抗体阻断KIR2DL2/3与HLACw3(或类似物)等位基因相互作用(Moretta等人，1993)。然而，这类试剂在临床情况中的使用将要求发展两个治疗性mAb来治疗所有患者，无论任何给定患者是否表达1类或2类HLA-C等位基因。此外，在决定使用哪种治疗性抗体之前，必须预先确定各患者表达的HLA型，从而导致昂贵很多的治疗费用。
Watzl等人，Tissue Antigens，56，240页(2000)制作了识别多个KIR同种型的交叉反应抗体，但是这些抗体没有展示出NK细胞活性的增强。G.M.Spaggiara等人，Blood，100，4098-4107页(2002)完成了利用许多抗多种KIR的单克隆抗体的实验。据说这些抗体之一(NKVSF1)识别CD158a(KIR2DL1)、CD158b(KIR2DL2)和p50.3(KIR2DS4)的共同表位。没有提示NKVSF1可以增强NK细胞活性，也没有提示可以使用其用于治疗。因此，本领域目前尚无调节NK细胞活性的可行性和有效途径可利用，依然需要使用特异性试剂特异性干预HLA等位基因。
发明概述本发明现提供新的抗体、组合物和方法以克服NK细胞活化中的现有困难，并提供额外的有利特征和益处。在一个示范性方面，本发明提供在几乎所有人中促进人类NK细胞活化的单个抗体。更具体而言，本发明提供全新的特异性抗体，所述全新的特异性抗体与多种抑制性KIR组交叉反应并中和其抑制性信号，导致表达这类抑制性KIR受体的NK细胞中NK细胞细胞毒性增强。与多种KIR基因产物交叉反应的能力允许本发明的抗体在大多数人类受试者中有效地用于增加NK细胞活性，而没有预先确定受试者HLA型的负担或费用。
在第一个方面，本发明提供抗体、抗体片段及其任一的衍生物，其中所述抗体、抗体片段或衍生物与NK细胞表面的至少两种抑制性KIR受体交叉反应，中和NK细胞的抑制性信号并增强NK细胞活性。该抗体更优选与人KIR2DL受体的共同决定簇结合。本发明的抗体甚至更明确地至少与KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3受体结合。为了本发明，术语“KIR2DL2/3”指KIR2DL2和KIR2DL3受体中任一或两者。这两个受体具有非常高的同源性，是假定的相同基因的等位基因形式，并且被本领域认为是可互换的。因此，为了本发明将KIR2DL2/3考虑为单一的抑制性KIR分子，因此仅与KIR2DL2和KIR2DL3而不与其它抑制性KIR受体交叉反应的抗体不在本发明范围内。
本发明的抗体特异性抑制MHC或HLA分子与至少两种抑制性KIR受体的结合并促进NK细胞活性。由此处所用的术语“中和KIR的抑制性活性”推断两种活性。在本发明文中本发明的抗体“促进NK细胞活性”、“促进NK细胞细胞毒性”、“促进NK细胞”、“增强NK细胞活性”、“增强NK细胞细胞毒性”或“增强NK细胞”的能力，指该抗体使在其表面表达抑制性KIR受体的NK细胞能够裂解在其表面表达该特定抑制性KIR受体(例如特定的HLA抗原)的相应配体的细胞。在一个特定的方面，本发明提供特异性抑制HLA-C分子与KIR2DL1和KIR2DL2/3受体结合的抗体。在另一个特定的方面，本发明提供体内促进NK细胞活性的抗体。
因为至少KIR2DL1或KID2DL2/3之一存在于至少约90％的人群中，本发明更优选的抗体能够促进针对大多数HLA-C同种异型(分别为1组HLA-C同种异型和2组HLA-C同种异型)相关细胞的NK细胞活性。因此，本发明的组合物可以用于在大多数人类个体中(一般约90％人类个体或以上)有效活化或增强NK细胞。因此，根据本发明的单个抗体组合物可以用于治疗大多数人类受试者，很少需要确定等位基因的类别或使用抗体混合物。
本发明首次证明可以生产抗抑制性KIR的交叉反应性及中和性抗体，而且这类抗体允许在广泛范围人群中有效活化NK细胞。
本发明的具体目的因此定位于抗体，其中所述抗体特异性结合KIR2DL1和KIR2DL2/3人类受体，并且逆转由这些KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制。在一个实施方案中，该抗体与杂交瘤DF200产生的单克隆抗体DF200竞争。可选地，所述与抗体DF200竞争的抗体不是抗体DF200本身。
在另一个实施方案中，抗体与单克隆抗体NKVSF1竞争，可选地，其中与抗体NKVSF1竞争的抗体不是抗体NKVSF1。
在另一个实施方案中，该抗体与抗体1-7F9竞争。
所述抗体优选为嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。
当涉及特定的单克隆抗体(例如DF200、NKVSF1、1-7F9、EB6、GL183)时，术语“与……竞争”指抗体在结合测定中与单克隆抗体(例如DF200、NKVSF1、1-7F9、EB6、GL183)竞争，所述结合测定使用重组KIR分子或表面表达的KIR分子。例如，在结合测定中如果抗体降低DF200与KIR分子的结合，该抗体与DF200“竞争”。与DF200“竞争”的抗体可以与DF200竞争结合KIR2DL1人类受体、KIR2DL2/3人类受体或KIR2DL1和KIR2DL2/3人类受体二者。
在优选的实施方案中，本发明提供结合KIR2DL1和KIR2DL2/3人类抗体、逆转由这些KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制、并与DF200、1-7F9或NKVSF1竞争结合KIR2DL1人类受体、KIR2DL2/3人类受体或KIR2DL1和KIR2DL2/3人类受体二者的抗体。所述抗体可选地不是NKVSF1。该抗体可选为嵌合、人类或人源化抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供结合KIR2DL1和KIR2DL2/3人类受体、逆转由这些KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制、并与EB6竞争结合KIR2DL1人类受体、与GL183竞争结合KIR2DL2/3人类受体、或与EB6竞争结合KIR2DL1人类受体并与GL183竞争结合KIR2DL2/3人类受体的抗体。所述抗体可选地不是NKVSF1；该抗体可选地不是DF200。该抗体可选为嵌合、人类或人源化抗体。
在有利的方面，本发明提供与DF200竞争的抗体，所述抗体与单克隆抗体DF200识别、结合基本相同或相同的KIR分子上的表位或“表位位点”，或对其中表位或“表位位点”具有免疫特异性。所述KIR分子优选为KIR2DL1人类受体或KIR2DL2/3人类受体。
本发明的具体目的定位于抗体，其中所述抗体结合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3人类受体上的共同决定簇，并逆转由这些KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制。这些抗体更特异地与杂交瘤DF200产生的单克隆抗体DF200或杂交瘤NKVSF1产生的抗体NKVSF1结合KIR上基本相同的表位，其中所述抗体不是NKVSF1。
在优选的实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。本发明最优选的抗体是由杂交瘤DF200产生的单克隆抗体DF200。
产生抗体DF200的杂交瘤以识别号“DF200”、注册号CNCM I-3224(于2004年6月10日注册)保藏于CNCM保藏中心，CollectionNationale de Cultures de Microorganismes，Institut Pasteur，25，Rue du Docteur Roux，F-75724 Paris Cedex 15，France。抗体NKVSF1可从Serotec(Cergy Sainte-Christophe，France)获得，目录参考号MCA2243。在此也将NKVSF1称为pan2D mAb。
本发明也提供在此描述的抗体的功能性片段和衍生物，所述功能性片段和衍生物具有基本相同的抗原特异性和活性(例如可以与母抗体交叉反应以及增强表达抑制性KIR受体的NK细胞的细胞毒性活性)，包括(但是不限于)Fab片段、Fab’2片段、免疫粘附素、微型双功能抗体(diabodies)、CDR和ScFv。另外，本发明的抗体可以是人源化、人或嵌合的。
本发明也提供抗体衍生物，所述抗体衍生物包括与毒素、放射性核素、可检测部分(例如荧光剂)或固体支持物缀合或共价结合的本发明的抗体。
本发明也提供包括上面公开的抗体、其片段或其任一的衍生物的药物组合物。因此，本发明也涉及在此公开的抗体在药物制造方法中的用途。在优选的实施方案中，所述药物或药物组合物用于治疗癌症或其它增生性疾病、感染、或用于移植。
在另一个实施方案中，本发明提供组合物，所述组合物包括至少与两个不同的人类抑制性KIR受体基因产物结合的抗体，其中抗体能够中和表达所述两种不同的人类抑制性KIR受体中至少一种的NK细胞上由KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制，其中抗体整合到脂质体中。该组合物任选地包括额外物质，所述额外物质选自为基因治疗输送基因的核酸分子；为在NK细胞中抑制基因输送反义RNA、RNAi或siRNA的核酸分子；或另外整合到所述脂质体中、靶向杀伤NK细胞的毒素或药物。
本发明也提供体外、离体或体内调节人类NK细胞活性的方法，包括将人类NK细胞与治疗有效量的本发明的抗体、这类抗体的片段、其任一的衍生物或至少包括上述任一项的药物组合物接触。优选的方法包括施用治疗有效量的本发明的药物组合物，并且针对在患有癌症、感染性疾病或免疫性疾病的受试者中增加人类NK细胞的细胞毒性活性(最优选离体或体内)。
另一方面，本发明提供杂交瘤，包括(a)来自哺乳动物宿主(一般为非人类哺乳动物宿主)的B细胞，其以含有抑制性KIR多肽上存在的表位的抗原免疫，所述B细胞与(b)永生化细胞系(例如骨髓瘤细胞)融合，其中所述杂交瘤产生单克隆抗体，该单克隆抗体结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体、并且能够至少基本中和在表达所述至少两种不同的人类抑制性KIR受体的NK细胞群中由KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制。任选地，该杂交瘤不产生单克隆抗体NKVSF1。所述抗体优选结合KIR2DL1和KIR2DL2/3受体。该抗体优选结合KIR2DL1和KIR2DL2/3上存在的共同决定簇。所述杂交瘤优选产生抑制在80位具有Lys残基的HLA-c等位基因分子与人类KIR2DL1受体结合、以及在80位具有Asn残基的HLA-C等位基因分子与人类KIR2DL2/3受体结合的抗体。所述杂交瘤优选产生与杂交瘤DF200产生的单克隆抗体DF200结合KIR2DL1或KIR2DL2/3或KIR2DL1和KIR2DL2/3上基本相同的表位的抗体。这种杂交瘤的实例为DF200。
本发明也提供产生抗体的方法，所述抗体与多种KIR2DL基因产物交叉反应，并中和这类KIR的抑制性活性，所述方法包括步骤为(a)以含有KIR2DL多肽的免疫原免疫非人类哺乳动物；(b)从所述免疫哺乳动物制备抗体，其中所述抗体结合所述KIR2DL多肽，(c)选择(b)中与至少两种不同的KIR2DL基因产物交叉反应的抗体，以及(d)选择(c)中增强NK细胞的抗体。在一个实施方案中，所述非人类哺乳动物是设计为表达人类抗体库的转基因动物(例如含有人类免疫球蛋白基因座并缺失天然免疫球蛋白基因的非人类哺乳动物，例如XenomouseTM(Abgenix-Fremont，CA，USA)，或含有人类Ig编码基因小基因座位(minilocus)的非人类哺乳动物，例如HuMab-mouseTM(Medarex-Princeton，NJ，USA))。该方法任选地另外包括选择结合灵长动物(优选猕猴)NK细胞或KIR多肽的抗体。本发明任选地另外包括评价抗体的方法，其中根据上述方法产生的抗体被施用于灵长动物(优选猕猴)，优选对猴观察抗体毒性指征的存在或缺乏。
发明者也提供产生抗体的方法，所示抗体结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物，其中所述抗体能够中和在表达所述至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的NK细胞群上由KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制，该方法包括步骤为a)以含有抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人类哺乳动物；b)从所述经过免疫的动物制备抗体，其中所述抗体结合所述KIR多肽，c)选择(b)中与至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物交叉反应的抗体，以及选择(c)中能够中和在表达所述至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的NK细胞群上由KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制的抗体，其中步骤(c)和(d)的顺序可任意颠倒，任意步骤任选重复1或多次。用于免疫的抑制性KIR多肽优选为KIR2DL多肽，选自步骤(c)的抗体至少与KIR2DL1和KIR2DL2/3交叉反应。该抗体优选识别存在于至少两种不同的KIR受体基因产物上的共同决定簇；所述KIR最优选为KIR2DL1和KIR2DL2/3。该方法任选另外包括选择与灵长动物(优选猕猴)NK细胞或KIR多肽结合的抗体。本发明任选地另外包括评价抗体的方法，其中根据上述方法产生的抗体被施用于灵长动物(优选猕猴)，优选对猴观察抗体毒性指征的存在或缺乏。
上述方法中选自步骤c)或d)的抗体可选地不是NKVSF1。上述方法步骤(b)中制备的抗体优选为单克隆抗体。选自上述方法步骤(c)中的抗体优选抑制在80位具有Lys残基的HLA-C等位基因分子与人类KIR2DL1受体的结合、以及在80位具有Asn残基的HLA-C等位基因分子与人类KIR2DL2/3受体的结合。选自上述方法步骤(d)中的抗体优选引起NK细胞毒性的增强，例如NK细胞毒性的任何显著增强、或增强至少5％、10％、20％、30％或更高，例如靶NK细胞毒性增强至少约50％(例如NK细胞细胞毒性增强至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％(例如约65-100％))。该抗体优选与单克隆抗体DF200结合KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上基本相同的表位。任选地，该方法也或另外含有制作所选单克隆抗体片段、制作所选单克隆抗体衍生物(例如通过与放射性核素、细胞毒性剂、报告分子等缀合)、或制作抗体片段衍生物的额外步骤，所述抗体片段从这类单克隆抗体产生或含有对应于这类单克隆抗体序列的序列。
本发明另外提供生产抗体的方法，所述抗体结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物，其中所述抗体能够中和在表达所述至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的NK细胞群上由KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制，该方法包括步骤为(a)从文库或库中选择至少与两种不同的人类抑制性KIR2DL受体基因产物交叉反应的单克隆抗体或抗体片段，以及
(b)选择(a)中能够中和在表达所述至少两种不同的人类抑制性KIR2DL受体基因产物的NK细胞群上由KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制的抗体。该抗体优选结合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇。选自步骤(b)的抗体可选地不是NKVSF1。选自步骤(b)中的抗体优选抑制在80位具有Lys残基的HLA-c等位基因分子与人类KIR2DL1受体的结合、以及在80位具有Asn残基的HLA-C等位基因分子与人类KIR2DL2/3受体的结合。选自步骤(b)的抗体优选引起NK细胞毒性的增强，例如NK细胞毒性的任何显著增强、或增强至少5％、10％、20％、30％或更高，例如靶NK细胞毒性增强至少约50％(例如NK细胞细胞毒性增强至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％(例如约65-100％))。该抗体优选与单克隆抗体DF200结合KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上基本相同的表位。该方法任选地含有制作所选单克隆抗体片段、制作所选单克隆抗体衍生物、或制作所选单克隆抗体片段的衍生物的额外步骤。
另外，本发明提供生产抗体的方法，所述抗体结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物，其中所述抗体能够中和在表达所述至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的NK细胞群中由KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制，该方法包括步骤为a)在允许所述单克隆抗体生产的条件下培养本发明的杂交瘤；以及b)从该杂交瘤分离所述单克隆抗体。该方法任选地含有制作该单克隆抗体片段、制作单克隆抗体衍生物、或制作这类单克隆抗体片段的衍生物的额外步骤。抗体优选结合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇。
本发明也提供生产抗体的方法，所述抗体结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物，其中所述抗体能够中和在表达所述至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的NK细胞群中由KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制，该方法包括步骤为a)从本发明的杂交瘤分离编码所述单克隆抗体的核酸；
b)任选地修饰该核酸，从而获得含有编码修饰或衍生抗体的序列的修饰核酸，所述抗体含有对应于所述单克隆抗体功能序列或与其基本相似(例如与这类序列至少约65％、至少约75％、至少约85％、至少约90％、至少约95％(例如约70-99％)一致)的氨基酸序列，其中抗体选自人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、抗体的免疫反应性片段或含有这类免疫反应性片段的融合蛋白质；c)将所述核酸或修饰核酸(或编码相同氨基酸序列的有关核酸)插入表达载体，其中当该表达载体存在于在适宜条件下生长的宿主细胞中时，被编码的抗体或抗体片段能够得到表达；d)以所述表达载体转染宿主细胞，其中所述宿主细胞不另外产生免疫球蛋白蛋白质；e)在引起所述抗体或抗体片段表达的条件下培养所述转染的宿主细胞；以及f)分离由转染的宿主细胞产生的抗体或抗体片段。抗体优选结合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇。
应当理解本发明也提供含有抗体的组合物，其中所述抗体结合至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物，其中所述抗体能够中和在至少表达所述两种不同的人类抑制性KIR受体之一的NK细胞中由KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制，抗体以有效地可检测地增强患者或含有NK细胞的生物样品中NK细胞细胞毒性的量存在；还含有可药用的载体或赋形剂。抗体优选与存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同决定簇结合。所述组合物可以任选地含有另一种治疗剂，该治疗剂选自例如免疫调节剂、荷尔蒙剂、化学治疗剂、抗血管生成剂、凋亡剂、结合并抑制抑制性KIR受体的另一个抗体、抗感染剂、靶向剂或辅助性化合物(adjunct compound)。有利的免疫调节剂可以选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNF-α、TNF-β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-α、IFN-β或IFN-γ。所述化学治疗剂的实例包括烷基化试剂、抗代谢药、细胞毒性抗生素、阿霉素、放线菌素D、丝裂霉素、洋红霉素、正定霉素、多柔比星、他莫西芬、泰素、泰索帝、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、环磷酰胺、塞替派、氨甲蝶呤、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)、氨蝶呤、考布他汀、其它长春花生物碱及其衍生物或前药。荷尔蒙剂的实例包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林、他莫西芬、托瑞米芬、氟他胺、尼鲁米特、环丙孕酮比卡鲁胺阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、fadrozole medroxy、氯地孕酮、甲地孕酮、其它LHRH激动剂、其它抗雌激素物质、其它抗雄激素物质、其它芳香酶抑制剂、以及其它孕激素。所述结合并抑制抑制性KIR受体的另一个抗体优选为结合抑制性KIR受体表位的抗体或其衍生物或片段，其中所述表位不同于与存在于至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物上的共同决定簇结合的抗体所结合的表位。
本发明另外提供在需要增强NK细胞活性的患者中可检测地增强NK细胞活性的方法，包括为患者施用本发明的组合物的步骤。需要增强NK细胞活性的患者可以是任何患有疾病或紊乱的患者，其中，这种增强可能促进、增强和/或诱导治疗作用(或至少在具有该疾病或紊乱、或具有基本相似特征的患者的显著部分中促进、增强和/或诱导这样的作用，可以通过例如临床试验测定)。需要这类治疗的患者可能患有例如癌症、其它增生性疾病、感染性疾病或免疫疾病。该方法优选包括为患者使用合适的额外治疗剂的额外步骤，所述治疗剂选自免疫调节剂、荷尔蒙剂、化学治疗剂、抗血管生成剂、凋亡剂、结合并抑制抑制性KIR受体的另一个抗体、抗感染剂、靶向剂或辅助性化合物，其中所述额外治疗剂与所述抗体一起以单剂形式、或以分开的剂型形式施用于患者。抗体(或抗体片段/衍生物)的剂量及额外治疗剂的剂量整体足以在患者中可检测地诱导、促进和/或增强(包括增强NK细胞活性)治疗反应。分开施用时，在对患者产生可检测的联合治疗效益的条件下(例如关于时间选择、药剂数量等)根据需要施用抗体、片段或衍生物以及额外治疗剂。
本发明包含的其它内容是本发明的能够特异性结合非人类灵长动物(优选猴)NK细胞和/或猴KIR受体的抗体。还包含评价作为候选药物的本发明抗体的毒性、剂量和/或活性或功效的方法。一方面，本发明包含确定对动物或靶组织有毒的抗体剂量的方法，包括将本发明的抗体施用于具有NK细胞的非人类灵长动物受体，评定该试剂对动物或优选对靶组织的任何毒性或有害或不良作用。另一方面，本发明是鉴定对动物或靶组织有毒的抗体的方法，包括将本发明的抗体施用于具有NK细胞的非人类灵长动物受体，评定该试剂对动物或优选对靶组织的任何毒性或有害或不良作用。另一方面，本发明是鉴定治疗感染者、疾病或肿瘤有效的抗体的方法，包括将本发明的抗体施用于非人类灵长动物的感染、疾病或癌症模型，鉴定改善感染、疾病或癌症、或其症状的抗体。本发明的抗体优选为(a)与至少两种人类NK细胞表面的抑制性人类KIR受体交叉反应、以及(b)与非人类灵长动物的NK细胞或KIR受体交叉反应的抗体。
本发明包含的其它内容是检测生物样品或活生物体内存在其细胞表面具有抑制性KIR的NK细胞的方法，所述方法包括步骤a)将所述生物样品或活生物体与本发明的抗体接触，其中所述抗体与可检测部分缀合或共价连接；以及b)在生物样品或活生物体中检测该抗体的存在。
本发明也提供从样品中纯化在其细胞表面具有抑制性KIR的NK细胞的方法，包括步骤a)在允许其细胞表面具有抑制性KIR的NK细胞与所述抗体结合的条件下，将所述样品与本发明的抗体接触，其中抗体与固体支持物(例如珠子、基质等)缀合或共价连接；以及b)从与固体支持物缀合或共价连接的抗体洗脱结合的NK细胞。
另一方面，本发明提供抗体、抗体片段或其任一的衍生物，所述抗体、抗体片段或其任一的衍生物含有抗体DF200或抗体Pan2D的轻链可变区或一个或多个轻链可变区CDR，如
图12所示。另一方面，本发明提供抗体、抗体片段或其任一的衍生物，所述抗体、抗体片段或其任一的衍生物含有与DF200或Pan2D的轻链可变区序列或这些抗体之一或二者的一个或多个轻链可变区CDR的全部或基本全部高度相似的序列。
另一方面，本发明提供抗体、抗体片段或其任一的衍生物，所述抗体、抗体片段或其任一的衍生物含有抗体DF200的重链可变区或一个或多个轻链可变区CDR，如图13所示。另一方面，本发明提供抗体、抗体片段或其任一的衍生物，所述抗体、抗体片段或其任一的衍生物含有与DF200的重链可变区序列全部或基本全部高度相似的序列。
本发明的这些及其它有利方面和特点将在此另外进一步说明。
附图简述图1描述单克隆抗体DF200，所述抗体与多种人类KIR2DL受体的共同决定簇结合。
图2描述单克隆抗体DF200，所述抗体中和在Cw4阳性靶细胞上由KIR2DL介导的KIR2DL1阳性NK细胞的细胞毒性抑制。
图3描述单克隆抗体DF200、DF200Fab片段以及KIR2DL1或KIR2DL2/3特异性常规抗体，所述抗体中和在Cw4阳性靶细胞上由KIR2DL介导的KIR2DL1阳性NK细胞的细胞毒性抑制、以及在Cw3阳性靶细胞上由KIR2DL介导的KIR2DL2/3阳性NK细胞的细胞毒性抑制。
图4描述在DF200和EB6抗体F(ab’)2片段存在下，由HLA Cw4阳性靶细胞的NK克隆导致的细胞裂解。
图5和6描述单克隆抗体DF200、NKVSF1(pan2D)、人抗体1-7F9、1-4F1、1-6F5和1-6F1、以及KIR2DL1或KIR2DL2/3特异性常规抗体，所述抗体中和在Cw4阳性靶细胞上由KIR2DL介导的KIR2DL1阳性NK细胞的细胞毒性抑制(图5中为Cw4转染细胞，图6中为EBV细胞)。
图7描述显示竞争结合实验结果的表位作图，所述结果以针对KIR2DL1的抗KIR抗体通过表面等离子共振(BIAcore_)分析获得，其中重叠的圆圈指结合KIR2DL1的重叠。结果显示1-7F9在KIR 2DL1上与EB6和1-4F1竞争，但是不与NKVSF1和DF200竞争。抗体1-4F1依次与EB6、DF200、NKVSF1和1-7F9竞争。抗体NKVSF1在KIR 2DL1上与DF200、1-4F1和EB6竞争，但是不与1-7F9竞争。DF200在KIR2DL1上与NKVSF1、1-4F1和EB6竞争，但是不与1-7F9竞争。
图8描述显示竞争结合实验结果的表位作图，所述结果以针对KIR2DL3的抗KIR抗体通过BIAcore_分析获得，其中重叠的圆圈指结合KIR2DL3的重叠。结果显示1-4F1在KIR2DL3上与NKVSF1、DF200、g1183和1-7F9竞争。1-7F9在KIR2DL 3上与DF200、g1183和1-4F1竞争，但是不与NKVSF1竞争。NKVSF1在KIR2DL3上与DF200、1-4F1和GL183竞争，但是不与1-7F9竞争。DF200在KIR2DL3上与NKVSF1、1-4F1和1-7F9竞争，但是不与GL183竞争。
图9描述显示竞争结合实验结果的表位作图，所述结果以针对KIR2DS1的抗KIR抗体通过BIAcore_分析获得，其中重叠的圆圈指结合KIR2DS1的重叠。结果显示抗体1-4F1在KIR2DS1上与NKVSF1、DF200和1-7F9竞争。抗体1-7F9在KIR2DS1上与1-4F1竞争，但是不与DF200和NKVSF1竞争。NKVSF1在KIR2DS1上与DF200和1-4F1竞争，但是不与1-7F9竞争。DF200在KIR2DS1上与NKVSF1和1-4F1竞争，但是不与1-7F9竞争。
图10描述证明NKVSF1(pan2D)mAb与猕猴NK细胞结合的NKVSF1(pan2D)mAb滴定。将猕猴NK细胞(总NK16天)与不同量的Pan2DmAb、随后与PE缀合的山羊F(ab’)2片段抗小鼠IgG(H+L)抗体孵育。以同种型对照(纯化的小鼠IgG1)确定阳性细胞百分率。将样品一式两份进行测定。平均荧光强度＝MFI。
图12提供抗体DF200和Pan2D mAb轻链可变区和轻链可变区CDR氨基酸序列的比对。
图13提供抗体DF200的重链可变区。
发明详述抗体本发明提供全新的抗体及其片段或衍生物，所述抗体及其片段或衍生物与人类抑制性KIR受体的共同决定簇(优选存在于至少两种不同KIR2DL基因产物上的决定簇)结合，并引起至少表达那些KIR受体之一的NK细胞的增强。本发明首次公开这类交叉反应和中和抗体是可以生产的，这代表了出乎意料的结果，并且向基于NK的全新的有效治疗(特别是在人类受试者中)打开了道路。在优选的实施方案中，抗体不是单克隆抗体NKVSF1。
在本发明文中，“共同决定簇”指由几个人类抑制性KIR受体基因产物共享的决定簇或表位。共同决定簇优选由至少两种KIR2DL受体组成员共享。该决定簇更优选由至少KIR2DL1和KIR2DL2/3共享。除了识别多个KIR2DL基因产物，本发明的某些抗体也可以识别存在于其它抑制性KIR上的决定簇，例如KIR3DL受体组的基因产物。决定簇或表位可以代表由所述成员共享的肽片段或构象表位。在更特定的实施方案中，本发明的抗体特异性结合与单克隆抗体DF200所识别的基本相同的表位。该决定簇存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上。
在本发明文中，术语“结合”共同决定簇的抗体指具有特异性和/或亲合力地结合所述决定簇的抗体。
除非另外声明或与上下文明显矛盾，此处所用的术语“抗体”指多克隆和单克隆抗体、以及所述多克隆和单克隆抗体的片段和衍生物。根据重链恒定区的类型，一般将全长抗体指定为五个主类之一IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。将其中数个进一步划分为亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。分别将对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型广为人知。IgG和/或IgM是本发明中采用抗体的优选类，因为它们是生理状态下最普通的抗体并且因为它们最容易在实验室环境中产生。本发明的抗体优选为单克隆抗体。因为本发明的目标之一是体内阻断抑制性KIR与其相应HLA配体的相互作用而不消耗NK细胞，一般优选对应于介导低效应物功能的Fc受体的同种型，例如IgG4。
可以通过多种本领域已知的技术生产本发明的抗体。一般通过以含有抑制性KIR多肽(优选KIR2DL多肽、更优选人类KIR2DL多肽)的免疫原免疫非人类动物(优选小鼠)生产本发明的抗体。抑制性KIR多肽可以含有人类抑制性KIR多肽的全长序列或其片段或衍生物，一般为免疫原性片段，即含有暴露于表达抑制性KIR受体的细胞表面的表位的多肽部分。这类片段一般至少含有成熟多肽序列的大约7个连续氨基酸，甚至更优选其至少大约10个连续氨基酸。片段一般基本衍生自受体的细胞外结构域。更优选的是人类KIR2DL多肽，该多肽包括全长KIRDL多肽的至少一个(更优选两个)细胞外Ig结构域，并且能够模拟至少一个存在于KIR2DL受体中的构象表位。在另一个实施方案中，该多肽至少含有KIR2DL1多肽氨基酸1-224位的细胞外Ig结构域的大约8个连续氨基酸(氨基酸编码根据描述KIR基因家族的PROW网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082.htm)。
在最优选的实施方案中，免疫原含有脂膜中(一般在细胞表面)的野生型人类KIR2DL多肽。在特定的实施方案中，免疫原含有完整的NK细胞，具体为任选经过处理或裂解的完整人类NK细胞。
可以用本领域熟知的刺激小鼠生产抗体的任何方式(见例如E.Harlow和D.Lane，《AntibodiesA Laboratory Manual》，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1988))执行以抗原免疫非人类哺乳动物的步骤。将免疫原任选地与佐剂(例如完全弗氏佐剂)悬浮或溶解于缓冲液中。确定免疫原的量、缓冲液类型和佐剂量的方法为本领域技术人员所熟知，并且不以任何形式限制本发明。对于不同的免疫原，这些参数可能不同但是易于阐明。
类似地，本领域也熟知足以刺激抗体生产的免疫位置和频率。在典型的免疫方案中，在第一天和约一周后以抗原腹膜内注射非人类动物。随后为约第20天的抗原记忆注射(recall injection)，任选地含有佐剂例如弗氏不完全佐剂。静脉内执行记忆注射，并且可以连续数天重复。此后为第40天静脉内或腹膜内加强注射，一般不含佐剂。该方案在约40天后引起产生抗原特异性抗体的B细胞的产生。也可以利用其它方案，只要它们引起B细胞的产生，所述B细胞表达针对用于免疫的抗原的抗体。
对于制备多克隆抗体，从免疫的非人类动物获得血清，通过公知的技术分离其中存在的抗体。可以使用连接到固体支持物的上述任何免疫原对血清亲合纯化，从而获得与抑制性KIR受体反应的抗体。
在替代实施方案中，分离并体外培养未免疫的非人类哺乳动物淋巴细胞。然后将其在细胞培养物中暴露于免疫原。然后收获淋巴细胞，执行下述融合步骤。
对于单克隆抗体，下一步是从免疫的非人类哺乳动物分离脾细胞、以及随后将那些脾细胞与永生化细胞融合以形成产生抗体的杂交瘤。从非人类哺乳动物分离脾细胞为本领域所熟知，一般涉及从麻醉的非人类哺乳动物取出脾脏、将其切成小块、将脾细胞挤压出脾被膜并穿过细胞滤网的尼龙网孔进入合适的缓冲液中从而产生单细胞悬液。将细胞洗涤、离心并重悬于裂解任何红细胞的缓冲液中。将溶液再次离心，并将保留在沉淀中的淋巴细胞最终重悬于新鲜缓冲液中。
一旦分离并以单细胞悬液存在，淋巴细胞可以与永生化细胞系融合。尽管本领域公知许多其它用于产生杂交瘤的永生化细胞系，其一般为小鼠骨髓瘤细胞系。优选的鼠科骨髓瘤系包括(但是不限于)可以从Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.U.S.A.，X63 Ag8653获得的衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些、以及可以从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，Rockville，Maryland U.S.A获得的SP-2细胞。使用聚乙二醇等实现融合。然后将产生的杂交瘤在含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长的物质的选择性培养基上培养。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤培养基一般将含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
一般在巨噬细胞饲养层上培养杂交瘤。巨噬细胞优选来自用于分离脾细胞的非人类哺乳动物的同窝出生仔畜，一般在接种杂交瘤前数日以弗氏不完全佐剂等引发。在Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103页(Academic Press，1986)中描述了融合方法，其公开内容在此引用作为参考。
允许细胞在选择培养基上生长足够形成克隆并产生抗体的时间。通常在约7至约14天之间。然后测定杂交瘤克隆产生与多种抑制性KIR受体基因产物交叉反应的抗体。尽管可以采用任何能够适应于培养杂交瘤的孔的测定法，该测定法一般为比色ELISA型测定。其它测定包括免疫沉淀和放射性免疫测定。检查所需抗体生产为阳性的孔是否出现一个或多个不同克隆。如果存在多于一个克隆，可以将细胞再次克隆并培养，以保证产生所需抗体的克隆仅由单个细胞产生。一般将具有单个明显克隆的阳性孔再次克隆并再次测定，以保证仅检测并产生一种单克隆抗体。
也可以通过选择免疫球蛋白组合文库生产抗体，如Ward等人，Nature，341(1989)544页中所公开。
本发明的抗体也可以中和KIR介导的NK细胞细胞毒性抑制；具体由KIR2DL受体介导的抑制以及更具体的至少KIR2DL1和KIR2DL2/3抑制。这些抗体因此为“中和”或“抑制性”抗体，就此意义而言，当其与MHC I类分子相互作用时，它们至少部分地或可检测地阻断由KIR受体介导的抑制性信号通路。更重要地，该抑制性活性涉及几型抑制性KIR受体，优选几种KIR2DL受体基因产物，更优选至少KIR2DL1和KIR2DL2/3，从而可以将这些抗体高效地用于多种受试者。可以通过多种测定或测试(例如结合或细胞测定)评定对KIR介导的NK细胞细胞毒性抑制的抑制。
一旦确定了与多种抑制性KIR受体交叉反应的抗体，可以测试其中和完整NK细胞中的那些KIR受体的抑制性作用的能力。在特定的变体中，可以通过所述抗体再现由KIR2DL阳性NK克隆造成HLA-C阳性靶细胞裂解的能力来阐明中和活性。在另一个特定的实施方案中，通过抗体抑制HLA-C分子与KIR2DL1和KIR2DL3(或关系密切的KIR2DL2)受体结合的能力将该抗体的中和活性另外优选地定义为该抗体改变-HLA-C分子与KIR2DL2/3结合，所述HLA-C分子选自Cw1、Cw3、Cw7和Cw8(或在80位具有Asn残基的HLA-C分子)；以及-HLA-C分子与KIR2DL1结合，所述HLA-C分子选自Cw2、Cw4、Cw5和Cw6(或在80位具有Lys残基的HLA-C分子)的能力。
在另一个变体中，可以在基于细胞的细胞毒性测定中评定本发明的抗体的抑制性活性，如在此提供的实施例中所公开。
在另一个变体中，可以在细胞因子释放测定中评定本发明抗体的抑制性活性，其中将NK细胞与测试抗体及表达一种被NK群KIR分子识别的HLA-C等位基因的靶细胞系孵育，刺激NK细胞产生细胞因子(例如产生IFN-γ和/或GM-CSF)。在示范性方案中，培养约4天后，通过细胞表面和细胞质内染色及流式细胞术分析评价从PBMC产生的IFN-γ。简而言之，可以在孵育的最后约4小时加入终浓度约为5μg/ml的Brefeldin A(Sigma Aldrich)。然后可以在透化(IntraPrepTM；Beckman Coulter)前将细胞与抗CD3和抗CD56mAb孵育，并以PE-抗IFN-γ或PE-IgG1(Pharmingen)染色。可以使用ELISA在上清中测量由多克隆活化的NK细胞产生的GM-CSF和IFN-γ(GM-CSFDuoSetElisa，R&D Systems，Minneapolis，MN；IFN-γOptE1A set，Pharmingen)。
本发明的抗体可以部分或完全中和KIR介导的NK细胞细胞毒性抑制。此处所用的术语“中和KIR介导的NK细胞细胞毒性抑制”指当表达给定KIR的NK细胞群与表达相关MHC I类分子(由NK细胞上表达的KIR识别)的靶细胞接触时，与不含抗体所获得的特异性裂解水平相比，以未因其KIR阻断的NK细胞或NK细胞系的相同比率所获得的特异性裂解增加至少约20％、优选至少约30％、至少约40％、至少约5O％或以上(例如约25-100％)的能力(通过细胞毒性经典铬释放测试测量)。例如，本发明优选的抗体能够诱导匹配的或HLA相容的或自体靶细胞群(即缺乏所述抗体时将不被NK细胞有效裂解的细胞群)的裂解。因此，也可以将本发明的抗体定义为促进NK细胞体内活性。
另外，术语“中和KIR介导的抑制”指在铬测定中以抗体获得的细胞毒性水平应当是以已知的阻断性抗MHC I类分子(例如W6/32抗MHC I类抗体)获得的细胞毒性的至少约20％、优选至少约30％、至少约40％、至少约50％(例如约25-100％)或更多，其中铬测定使用表达一种或几种抑制性KIR的NK细胞克隆或转染子以及仅表达一种被NK细胞KIR之一识别的HLA等位基因的靶细胞。
在特定的实施方案中，该抗体与单克隆抗体DF200(由杂交瘤DF200产生)结合基本相同的表位。在此将这类抗体称为“DF200样抗体”。在另一个优选的实施方案中，抗体为单克隆抗体。本发明更优选的“DF200样抗体”是除单克隆抗体NKVSF1之外的抗体。最优选单克隆抗体DF200(由杂交瘤DF200产生)。
术语与目的抗体“结合基本相同的表位或决定簇”指抗体与所述目的抗体“竞争”。术语与单克隆抗体DF200“结合基本相同的表位或决定簇”指抗体与DF200“竞争”。通常，与目的单克隆抗体(例如DF200、NKVSF1、17F9)“结合基本相同表位或决定簇”的抗体指抗体与所述目的抗体竞争多个KIR分子中任一个(优选选自KIR2DL1和KIR2DL2/3的KIR分子)。在其它实施例中，与目的抗体结合KIR2DL1分子上基本相同的表位或决定簇的抗体与目的抗体“竞争”结合KIR2DL1。与目的抗体结合KIR2DL2/3分子上基本相同表位或决定簇的抗体与目的抗体“竞争”结合KIR2DL2/3。
术语与目的抗体“结合本质相同的表位或决定簇”指抗体与所述目的抗体“竞争”该目的抗体特异性结合的任何及所有KIR分子。术语与单克隆抗体DF200“结合本质相同的表位或决定簇”指抗体与DF200“竞争”DF200特异性结合的任何及所有KIR分子。例如，与单克隆抗体DF200或NKVSF1结合本质相同的表位或决定簇的抗体分别与DF200或NKVSF1竞争结合KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DS1和KIR2DS2。
使用多种可评定抗体竞争的免疫学筛选测定法中的任何一种，可以容易地确定一种或多种抗体的身份，所述抗体与在此描述的单克隆抗体识别基本或本质相同的表位。许多这样的实验被本领域常规实施并熟知(见例如1997年8月26日公布的美国专利No.5,660,827，该专利在此明确引用作为参考)。应当理解，实际上并不以任何方式要求确定在此描述的抗体的结合表位以鉴定与在此描述的单克隆抗体结合相同或基本相同表位的抗体。
例如，当待检查的测试抗体获自不同来源的动物、或甚至是不同Ig同种型时，可以采用简单的竞争测定，其中，将对照(例如DF200)和测试抗体混合(或预先吸附)，并施加于含有KIR2DL1和KIR2DL2/3(各已知被DF200结合)的样品。基于ELISA、放射性免疫测定、蛋白质印迹的方案以及BIACORE分析(列举于例如实施例部分中)的使用适合用于这类简单的竞争研究中。
在某些实施方案中，在施加于抑制性KIR抗原样品之前，应当把对照抗体(例如DF200)与不同量的测试抗体(例如约1∶10或约1∶100)预先混合一段时期。在其它实施方案中，可以在暴露于KIR抗原样品期间将对照和不同量的测试抗体简单混合。只要能够区分结合的与游离的抗体(例如使用分离或清洗技术消除未结合的抗体)、并区分DF200与测试抗体(例如使用种特异性或同种型特异性二级抗体或以可检测标签特异性标记DF200)，将能够确定测试抗体是否降低DF200与这两种不同KIR2DL抗原的结合，从而说明测试抗体与DF200识别基本相同的表位。在不存在完全无关的抗体时，(标记的)对照抗体的结合可以作为对照高值。将标记的(DF200)抗体与未标记的完全同型抗体(DF200)孵育(在此将出现竞争，并降低标记抗体的结合)，可以获得对照低值。在测试测定中，标记抗体的反应性在测试抗体存在下的显著降低，表明了识别基本相同表位的测试抗体(即与标记(DF200)抗体“交叉反应”的抗体)。在DF200测试抗体为大约1∶10和大约1∶100之间的任何比值下，将DF200与KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原中每一个的结合降低至少约50％、例如至少约60％、或更优选至少约70％(例如约65-100％)的测试抗体，被认为是与DF200结合基本相同表位或决定簇的抗体。这类测试抗体优选将DF200与KIR2DL抗原中每个的结合降低至少约90％(例如约95％)。
可以通过例如流式细胞术测试评定竞争。在这样的测试中，可以首先将具有给定KIR的细胞与例如DF200、然后与荧光染料或生物素标记的测试抗体孵育。如果在以饱和量DF200预孵育时获得的结合是抗体在没有以DF200预孵育时所获结合的约80％、优选约50％、约40％或更低(例如约30％)(通过荧光测定)，则称该抗体与DF200竞争。另外，如果在与饱和量测试抗体预孵育的细胞上以(用荧光染料或生物素)标记的DF200获得的结合是没有以该抗体预孵育所获结合的约80％、优选约50％、约40％或更低(例如约30％)，则称该抗体与DF200竞争。
也可以有利地采用简单竞争测定，在该测定中，将测试抗体以饱和浓度预先吸附并施加到也固定了KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面上。简单竞争测定中的表面优选BIACORE芯片(或其它适于表面等离子共振分析的介质)。然后将对照抗体(例如DF200)以对KIR2DL1和KIR2DL2/3饱和的浓度与表面接触，测量对照抗体的KIR2DL1和KIR2DL2/3表面结合。将所述对照抗体的结合与不存在测试抗体时对照抗体与含有KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面的结合比较。在测试实验中，由对照抗体在测试抗体的存在下显著降低含有KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面的结合指示该测试抗体与对照抗体识别基本相同的表位，所以该测试抗体与对照抗体“交叉反应”。将对照(例如DF200)抗体与KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原中每个的结合降低至少约30％或更优选约40％的测试抗体可被认为是与对照(例如DF200)结合基本相同表位或决定簇的抗体。这类测试抗体优选将对照抗体(例如DF200)与KIR2DL抗原中每个的结合降低至少约50％(例如至少约60％、至少约70％或更多)。应当理解，可以颠倒对照和测试抗体的顺序即在竞争测定中，可以首先将对照抗体结合到表面，其后将测试抗体与表面接触。对KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原具有高亲合力的抗体优选首先结合到含有KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面，因为预期第二抗体(假定抗体是交叉反应的)的结合将降低更大的数量。在实施例及例如Saunal和Regenmortel，(1995)J.Immunol.Methods 18333-41中提供了这类测定的其它实例，其中Saunal和Regenmortel，(1995)J.Immunol.Methods 18333-41的公开内容在此引用作为参考。
尽管为了示范以DF200为例进行说明，应当理解，上述免疫学筛选测定也可以用于鉴定与NKVSF1、1-7F9、EB6、GL183竞争的抗体及其它本发明的抗体。
在脊椎动物或细胞的免疫和抗体生产后，可以执行特定的选择步骤分离本发明抗体。关于这一点，在特定的实施方案中，本发明也涉及生产这类抗体的方法，包括(a)以含有抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人类哺乳动物；(b)从所述免疫动物制备抗体，其中所述抗体结合所述KIR多肽，(c)选择(b)的抗体，所述抗体与至少两种不同的抑制性KIR基因产物交叉反应，及(d)选择(c)的抗体，所述抗体能够中和在表达所述至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物的NK细胞群上由KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制。
可以通过筛选抗两种或多种不同的抑制性KIR抗原的抗体实现对与至少两种不同的抑制性KIR基因产物交叉反应的抗体的选择，例如上文所述。
在更优选的实施方案中，步骤(b)中制备的抗体是单克隆抗体。因此，在此使用的术语“从所述免疫动物制备抗体”包括从免疫动物获得B细胞及使用那些B细胞生产表达抗体的杂交瘤，以及直接从免疫动物血清获得抗体。在另一个优选的实施方案中，在步骤(c)中选择的抗体是至少与KIR2DL1和KIR2DL2/3交叉反应的抗体。
在另一个优选的实施方案中，如标准铬释放测定中所测量，同以未被其KIR阻断的NK细胞以相同的效应细胞/靶细胞比获得的裂解或细胞毒性相比，步骤(d)中选择的抗体引起由NK细胞向靶细胞介导的至少约10％的特异性裂解，优选至少约40％的特异性裂解、至少约50％的特异性裂解或更优选至少约70％特异性裂解(例如约60-100％的特异性裂解)，所述NK细胞展示至少一种由该抗体识别的KIR，所述靶细胞表达相关HLA I类分子。另外，当步骤(d)中选择的抗体用于铬试验时，以该抗体获得的细胞毒性水平应当是以阻断性抗MHC I类mAb(例如W6/32抗MHC I类抗体)获得的细胞毒性的至少约20％、优选至少约30％或更多，所述铬试验采用表达一种或几种抑制性KIR的NK细胞克隆以及仅表达一种由NK克隆上的KIR之一识别的HLA等位基因的靶细胞。
上文刚刚所述方法的步骤(c)和(d)的顺序可以改变。任选地，该方法也或可能另外包括制作单克隆抗体片段或单克隆抗体或这类片段的衍生物的额外步骤，例如在此另外所述。
在优选的实施方案中，根据本发明的可适用方法用于生产抗体的非人类动物是哺乳动物，例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠等)、牛、猪、马、兔、山羊、绵羊等。非人类哺乳动物也可以经过遗传修饰或经改造产生“人类”抗体，例如XenomouseTM(Abgenix)或HuMAb-MouseTM(Medarex)。
在另一个变体中，本发明提供获得抗体的方法，包括(a)从文库或库中选择单克隆抗体、单克隆抗体片段或其任一的衍生物，所述单克隆抗体、单克隆抗体片段或其任一的衍生物与至少两种不同的人类抑制性KIR2DL受体基因产物交叉反应，并(b)选择(a)中的抗体、片段或衍生物，所述抗体、片段或衍生物能够中和在表达所述至少两种不同人类抑制性KIR2DL受体基因产物的NK细胞群上由KIR介导的NK细胞细胞毒性抑制。
所述库可以是抗体或其片段的任何(重组)库，任选地由任何适当结构(例如噬菌体、细菌、合成复合物等)展示。抑制性抗体的选择可以按照上文所公开的执行，并在实施例中得到进一步阐述。
根据另一个实施方案，本发明提供含有非人类宿主B细胞的杂交瘤，其中所述B细胞产生与存在于至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物上的决定簇结合的抗体，所述抗体能够中和该受体的抑制性活性。本发明此方面的杂交瘤更优选不是产生单克隆抗体NKVSF1的杂交瘤。可以如上所述将免疫的非人类哺乳动物脾细胞与永生化细胞系融合产生本发明此方面的杂交瘤。可以对通过该融合产生的杂交瘤筛选如本文另外所述的这类交叉反应抗体的存在。杂交瘤优选产生识别至少存在于两种不同KIR2DL基因产物上的决定簇的抗体，所述抗体引起表达至少那些KIR受体之一的NK细胞的增强。杂交瘤更优选产生与DF200结合基本相同的表位或决定簇、并且增强NK细胞活性的抗体。杂交瘤最优选为生产单克隆抗体DF200的杂交瘤DF200。
可以在合适的培养基(例如DMEM或RPMI-1640)中大量培养经证实产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。另外，可以将杂交瘤细胞作为动物腹水肿瘤体内培养。
充分培养产生所需单克隆抗体后，将含有单克隆抗体的生长培养基(或腹水液体)与细胞分离，纯化其中存在的单克隆抗体。一般通过凝胶电泳、透析、色谱实现纯化，其中色谱使用蛋白质A或蛋白质G-Sepharose、或与固体支持物例如琼脂糖或Sepharose珠子连接的抗小鼠Ig(所有都在例如《Antibody Purification Handbook》，AmershamBiosciences，出版号No.18-1037-46，AC版中说明，其中《AntibodyPurification Handbook》在此引用作为参考)。一般使用低pH缓冲液(pH3.0或更低的甘氨酸或醋酸缓冲液)通过直接中和含抗体级份从蛋白质A/蛋白质G柱洗脱结合的抗体。根据需要将这些级份集中、透析并浓缩。
根据备选的实施方案，从本发明的杂交瘤分离编码抗体的DNA，并将其置入转染合适宿主的适宜的表达载体，所述抗体结合存在于至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物上的决定簇。然后将宿主用于重组生产抗体或其变体(例如该单克隆抗体的人源化形式、该抗体的活性片段或含有该抗体的抗原识别部位的嵌合抗体)。用于该实施方案的DNA优选编码识别存在于至少两种不同KIR2DL基因产物上的决定簇的抗体，所述抗体引起表达至少那些KIR受体之一的NK细胞的增强。该DNA更优选编码与DF200结合基本相同表位并增强NK细胞活性的抗体。该DNA最优选编码单克隆抗体DF200。
使用常规方案易于将编码本发明的单克隆抗体的DNA分离并测序(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重和轻链的基因的寡核苷酸探针)。一旦分离，可以将DNA置入表达载体，该表达载体然后被转染到宿主细胞(例如不另外产生免疫球蛋白的大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，得到单克隆抗体在重组宿主细胞内的合成。抗体编码DNA在细菌中的重组表达为本领域所熟知(见例如Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.，5，256页(1993)；Pluckthun，Immunol.Revs.，130，151页(1992)。
单克隆抗体片段及衍生物可以通过本领域公知的技术产生本发明的抗体片段和衍生物(除非另外声明或与上下文明显矛盾，本申请中所用的术语“抗体”包含抗体片段和衍生物)，优选DF-200样抗体。“免疫反应性片段”含有完整抗体的一部分，通常为抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2和Fv片段；微型双功能抗体；任何抗体片段，所述抗体片段是一级结构具有连续氨基酸残基的不间断序列的多肽(在此称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv(scFv)分子(2)含有仅一个轻链可变结构域的单链多肽，或其含有轻链可变结构域的三个CDR、没有相关重链部分的片段以及(3)含有仅一个重链可变结构域的单链多肽，或其含有重链可变结构域的三个CDR、没有相关轻链部分的片段；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，可以根据常规技术通过蛋白酶消化分离的抗体产生Fab或F(ab’)2片段。应当理解，可以使用已知方法修饰免疫反应性片段，从而例如延缓体内清除并得到更需要的药物代谢动力学特征。可以以聚乙二醇(PEG)修饰片段。在例如Leong等人，Cytokine16(3)106-119(2001)和Delgado等人，Br.J.Cancer73(2)175-182(1996)中描述了PEG向Fab’片段的耦连和位点特异性缀合方法，Leong等人及Delgado等人的公开内容在此引用作为参考。
在特定的方面，本发明提供含有图12中列出的DF200轻链可变区序列的抗体、抗体片段及抗体衍生物。另一个特定方面，本发明提供含有图12中列出的Pan2D轻链可变区序列的抗体、抗体片段及抗体衍生物。另一方面，本发明提供含有图12中列出的DF200的一个或多个轻链可变区CDR的抗体、抗体片段及其衍生物。另一方面，本发明提供含有图12中列出的Pan2D的一个或多个轻链可变区CDR的抗体、抗体片段及其衍生物。可以使用标准技术(还可进行序列比较)通过在这些公开的氨基酸序列中进行合适的取代、添加、和/或删除以产生这类序列的功能性变体/类似物。因此，例如，Pan2D和DF-200之间保守的CDR残基可能是合适的修饰靶，因为这类残基可能对这些抗体关于其它在此公开的抗体的竞争中的不同特征没有贡献(尽管Pan2D和DF-200竞争)，因此可能对这些抗体对于其各自特定表位的特异性没有贡献。另一方面，在残基存在于这些抗体之一的序列中(而非另一个)的位置，该位置可能适于删除、取代和/或插入。
在特定的方面，本发明提供含有图13中列出的DF200重链可变区序列的抗体、抗体片段及抗体衍生物。另一方面，本发明提供含有图13中列出的DF200的一个或多个重链可变区CDR的抗体、抗体片段及其衍生物。可以使用标准技术通过在这些公开的氨基酸序列中制作合适的取代、添加、和/或删除以产生这类序列的功能性变体/类似物，这将得益于序列比较。另一方面，那些其中残基存在于这些抗体之一的序列中但不存在于其它序列的位置可能适于删除、取代和/或插入。
另外，可以修饰产生本发明的抗体(优选DF-200样抗体)的杂交瘤DNA从而编码本发明的片段。然后将修饰DNA插入表达载体并用于转化或转染合适的细胞，所述细胞然后表达所需片段。
在备选实施方案中，可以在插入表达载体之前，通过例如以人类重和轻链恒定结构域编码序列取代同源非人类序列(例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6851页(1984))、或通过将全部或部分非免疫球蛋白多肽编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接修饰产生本发明的抗体(优选DF-200样抗体)的杂交瘤DNA。在这种形式中，制备具有原始抗体结合特异性的“嵌合”或“杂交”抗体。一般，以这类非免疫球蛋白多肽置换本发明的抗体的恒定结构域。
因此，根据另一个实施方案，本发明的抗体(优选DF-200样抗体)是人源化的。根据本发明的抗体的“人源化”形式是含有衍生自鼠免疫球蛋白的最小序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、或其它抗原结合子序列)。大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受者抗体)，所述人类免疫球蛋白中，来自受者互补决定区(CDR)的残基被来自原始抗体(供者抗体)CDR的残基取代，同时保留原始抗体的所需特异性、亲合力和能力。在一些实例中，可以用相应的非人类残基取代人类免疫球蛋白的Fv构架残基。另外，人源化抗体可以含有受体抗体中或引入的CDR或构架序列中没有的残基。制造这些修饰以进一步精制和优化抗体性能。通常，人源化抗体将包括几乎所有至少一个(一般为两个)可变结构域，在所述可变结构域中所有或几乎所有CDR区对应于原始抗体的CDR区，并且所有或几乎所有FR区是人类免疫球蛋白一致序列的FR区。人源化抗体最好也将包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)(一般为人类免疫球蛋白恒定区)。进一步细节见Jones等人，Nature，321，522页(1986)；Reichmann等人，Nature，332，323页(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2，593页(1992)。
将本发明的抗体人源化的方法为本领域所熟知。通常，根据本发明的人源化抗体具有一个或多个从原始抗体引入其中的氨基酸残基。常把这些鼠科或其它非人类氨基酸残基称为“引入的”残基，一般取自“引入的”可变结构域。可以基本按照Winter与同事的方法(Jones等人，Nature，321，522页(1986)；Riechmann等人，Nature，332，323页(1988)；Verhoeyen等人，Science，239，1534页(1988))执行人源化。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体，由原始抗体的相应序列取代基本小于完整的人类可变结构域(Cabilly等人，美国专利No.4,816,567)。实际上，根据本发明的人源化抗体一般为人类抗体，所述人类抗体中一些CDR残基及可能一些FR残基被原始抗体相似位点的残基置换。
用于制作人源化抗体的人类可变结构域(轻和重链)的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适合”方法，对已知人类可变结构域序列的完整文库筛选本发明的抗体的可变结构域序列。然后接受与小鼠序列最接近的人类序列作为人源化抗体人类构架(FR)(Sims等人，J.Immunol.，151，2296页(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196，901页(1987))。另一个方法使用来自轻或重链特定亚群的所有人类抗体的一致序列的特定构架。相同构架可以用于几个不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89，4285页(1992)；Presta等人，J.Immunol.，51，1993等人))。
更为重要的是将抗体人源化而保持对多种抑制性KIR受体的高亲合力和其它有利的生物学特性。为了实现这个目标，根据优选的方法，通过使用母本和人源化序列的三维模型分析母本序列及多种概念上的人源化产物的方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型一般可获得，并且是本领域技术人员所熟悉的。可以获得图解并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白机能中的可能角色，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基。这样，可以从一致和引入序列中选择并组合FR残基，从而实现所需的抗体特征，例如对靶抗原的亲合力增加。通常，CDR残基直接并最主要涉及影响抗原结合。
制作“人源化”单克隆抗体的另一种方法是使用XenoMouse_(Abgenix，Fremont，CA)作为免疫小鼠。XenoMouse是根据本发明的鼠科宿主，其免疫球蛋白基因被功能性人类免疫球蛋白基因取代。因此，由该小鼠或由该小鼠B细胞制作的杂交瘤产生的抗体已经经过人源化。在美国专利No.6,162,963中描述了XenoMouse，其中美国专利No.6,162,963在此全文引用作为参考。使用HuMAb-MouseTM(Medarex)可以完成类似方法。
也可以根据多种其它技术产生人类抗体，例如使用经设计表达人类抗体库的其它转基因动物用于免疫(Jakobovitz等人，Nature362(1993)255)，或使用噬菌体展示方法选择抗体库。这类技术为技术人员公知，并可以从本申请公开的单克隆抗体开始执行。
也可以将本发明的抗体(优选DF-200样抗体)衍生为“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，只要它们显示所需的生物学活性，所述“嵌合”抗体中重和/或轻链的一部分与原始抗体的相应序列一致或同源，而链的剩余部分与衍生自其它物种或属于其它抗体类或亚类的抗体、以及这类抗体的片段的相应序列一致或同源(Cabilly等人，如上；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6851页，(1984))。
在本发明范围内的其它衍生物包括功能化抗体，即与毒素(例如蓖麻毒素、白喉毒素、相思豆毒蛋白和假单胞菌(Pseudomonas)外毒素)；可检测部分(例如荧光部分、放射性同位素或成像剂)；或固体支持物(例如琼脂糖珠子等)缀合或共价连接的抗体。这些其它试剂与抗体缀合或共价连接的方法为本领域熟知。
与毒素缀合有益于在其细胞表面展示交叉反应性KIR受体之一的NK细胞的靶向杀伤。本发明的抗体一旦与这类细胞的细胞表面结合，它将被内化，毒素被释放到细胞内，选择性杀伤该细胞。这类用途是本发明的备选实施方案。
当本发明的抗体用于诊断目的时，与可检测部分缀合是有用的。这类目的包括(但是不限于)对生物样品测定在其细胞表面具有交叉反应性KIR的NK细胞的存在、以及在活生物体内检测具有交叉反应性KIR的NK细胞的存在。这类测定和检测方法也是本发明的备选实施方案。
作为从来源(例如生物液体)亲合纯化在其细胞表面具有交叉反应性KIR的NK细胞的工具，本发明的抗体与固体支持物缀合是有用的。如产生的纯化的NK细胞群一样，所述纯化方法是本发明的另一个备选在备选实施方案中，可以将抗体(包括NKVSF1)单独或与另一种用于向动物靶向输送的物质一起整合到脂质体(“免疫脂质体”)中，其中所述抗体与存在于至少两种不同的人类抑制性KIR受体基因产物上的共同决定簇结合，能够中和在至少表达所述本发明两种不同的人类抑制性KIR受体之一的NK细胞上由KIR介导的NK细胞细胞毒性抑制。这类其它物质包括为基因治疗输送基因、或为在NK细胞中抑制基因输送反义RNA、RNAi或siRNA的核酸；或用于NK细胞靶向杀伤的毒素或药物。
基于其发表的晶体结构(Maenaka等人，(1999)，Fan等人，(2001)，Boyington等人，(2000))，KIR2DL1、2和3(KIR2DL1-3)细胞外结构域的计算机模拟预测了涉及KIR2DL1与KIR2DL1-3交叉反应性小鼠单克隆抗体DF200和NKVSF1之间相互作用的某些区域或KIR2DL1、2和3。因此，在一个实施方案中，本发明提供在由氨基酸残基(105、106、107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181、192)定义的区域内与KIR2DK1专一结合的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供与KIR2DL1和KIR2DL2/3结合而不与由残基(105、106、107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181、192)定义的区域之外的氨基酸残基相互作用的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供与KIR2DL1结合并且不与KIR2DL1突变体结合的抗体，所述KIR2DL1突变体中，R131为Ala。
在另一个实施方案中，本发明提供与KIR2DL1结合并且不与KIR2DL1突变体结合的抗体，所述KIR2DL1突变体中，R157为Ala。
在另一个实施方案中，本发明提供与KIR2DL1结合并且不与KIR2DL1突变体结合的抗体，所述KIR2DL1突变体中，R158为Ala。
在另一个实施方案中，本发明提供与KIR2DL1残基(131、157、158)结合的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供与KIR2DS3(R131W)结合、但是不与野生型KIR2DS3结合的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供与KIR2DL1和KIR2DL2/3以及KIR2DS4结合的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供与KIR2DL1和KIR2DL2/3结合、但是不与KIR2DS4结合的抗体。
可以用本领域技术人员公知的方法进行确定抗体是否在上述定义的表位区之一内结合。作为这类作图/表征方法的一个实例，可以使用KIR2DL1或KIR2DL2/3蛋白质中暴露的氨基/羧基的化学修饰通过表位“足迹法(foot-printing)”确定抗KIR抗体的表位区。这类足迹法技术的一个特定实例是使用HXMS(质谱法检测的氢-氘交换)，其中出现受体和配体蛋白质酰氨质子的氢/氘交换、结合和换回(backexchange)，其中参与蛋白质结合的骨架酰氨基团受保护免于换回，因而将保持氘化。通过胃蛋白酶蛋白质水解、快速微孔高效液相色谱分离和/或电喷雾离子化质谱法可以在该点鉴定有关区域。见例如Ehring H，Analytical Biochemistry，Vol.267(2)252-259页(1999)和/或Engen，J.R.和Smith，D.L.(2001)Anal.Chem.73，256A-265A。合适的表位鉴定技术的另一个实例是核磁共振表位作图(NMR)，一般比较二维NMR谱中游离抗原和与抗原结合肽(例如抗体)复合的抗原的信号位置。一般以15N选择性同位素标记抗原，因此NMR谱上仅见对应于抗原的信号，而没有来自抗原结合肽的信号。与游离抗原谱相比，源自涉及与抗原结合肽相互作用的氨基酸的抗原信号一般将在复合物谱中位移，这样可以鉴定涉及结合的氨基酸。见例如Ernst Schering Res Found Workshop.2004；(44)149-67；Huang等人，Journal of Molecular Biology，Vol.281(1)61-67页(1998)；以及Saito和Patterson，Methods.1996 Jun；9(3)516-24。
也可使用质谱方法执行表位作图/表征。见例如Downward，J MassSpectrom.2000 Apr；35(4)493-503及Kiselar和Downard，AnalChem.1999 May1；71(9)1792-801。
蛋白酶消化在表位作图和鉴定中也可以是有用的。可以通过蛋白酶消化(例如，用与KIR2DL1或KIR2DL2/3大约1∶50的比例使用胰蛋白酶于37℃和pH7-8 o/n消化)及随后的肽鉴定质谱(MS)分析，确定抗原决定簇相关区域/序列。随后可以通过比较经受胰蛋白酶消化的样品和与抗体孵育、然后经受例如胰蛋白酶消化的样品(从而为结合物展示足迹)，鉴定由抗KIR结合物保护免于胰蛋白酶切割的肽。像糜蛋白酶、胃蛋白酶等其它酶也或另外可以用于类似的表位表征方法。此外，酶消化可以提供快速方法，用于分析非表面暴露并因此最可能与免疫原性/抗原性无关的抗-KIR多肽情况下KIR2DL1区域内是否存在潜在的抗原决定簇序列。类似技术的讨论见例如Manca，AnnIst Super Sanita.1991；27(1)15-9。
与猕猴的交叉反应性发现抗体NKVSF1也与猕猴NK细胞结合，见实施例7。本发明因此提供抗体及其片段和衍生物，其中所述抗体、片段或衍生物与人类NK细胞表面至少两种抑制性人类KIR受体交叉反应，而且结合猕猴NK细胞。在一个实施方案中，该抗体不是抗体NKVSF1。本发明也提供测试抗体及其片段和衍生物毒性的方法，其中所述抗体、片段或衍生物与人类NK细胞表面至少两种抑制性人类KIR受体交叉反应，其中方法包括在猕猴中测试该抗体。
组合物及施用本发明也在合适的载体中以可检测地增强患者或含有NK细胞的生物样品的NK细胞细胞毒性的有效量提供含有抗体及其片段和衍生物的药物组合物，其中所述抗体、片段或衍生物与NK细胞表面至少两种抑制性KIR受体交叉反应、中和其抑制性信号并增强那些细胞的活性。该组合物另外含有可药用载体。也将这类组合物称为“本发明的抗体组合物”。在一个实施方案中，本发明的抗体组合物含有上文抗体实施方案中公开的抗体。抗体NKVSF1包括在可能出现于本发明的抗体组合物中的抗体范围内。
此处所用的术语“生物样品”包括但是不限于生物液体(例如血清、淋巴液、血液)、细胞样品或组织样品(例如骨髓)。
可用于这些组合物的可药用载体包括(但是不限于)离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质(例如人血清白蛋白)、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
在增强患者或生物样品NK细胞活性的方法中可以采用本发明的组合物。该方法包括将组合物与患者或生物样品接触的步骤。这类方法将有益于诊断和治疗目的。
对于结合生物样品使用，依赖于样品性质(液体或固体)，可以与样品简单混合或直接应用于样品而施用抗体组合物。可以在任何合适的装置(板、袋、瓶等)中将生物样品与抗体直接接触。对于结合患者使用，该组合物必须经过配制施用于患者。
可以口服、胃肠外、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经口腔、经阴道或通过植入贮库(implanted reservoir)施用本发明的组合物。此处所用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输液技术。优选口服、腹膜内或静脉内施用该组合物。
本发明的组合物的消毒可注射形式可以是水性或油性悬浮液。可以根据本领域公知的技术使用合适的分散或润湿剂和悬浮剂配制悬浮液。消毒可注射剂也可以是胃肠外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的消毒可注射溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的载体和溶剂中可采用的是水、Ringer溶液和等张氯化钠溶液。另外，常规采用消毒的固定油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸(例如油酸及其甘油酯衍生物)在注射剂的制备中是有用的，如天然可药用油(例如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如常用于配制包括乳剂和悬浮液在内的可药用剂量形式的羧甲基纤维素或类似分散剂。其它常用的表面活性剂(例如常用于制造可药用固体、液体或其它剂量形式的Tween、Span和其它乳化剂或生物利用度增强物)也可以用于配制目的。
可以以任何口服可接受的剂量形式口服施用本发明的组合物，所述口服可接受的剂量形式包括(但是不限于)胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在口服使用片剂的情况下，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般也加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当要求水性悬浮液口服使用时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，也可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
另外，可以以直肠施用的栓剂形式施用本发明的组合物。可以通过将试剂与合适的无刺激性赋形剂混合制备这些，所述合适的无刺激性赋形剂在室温为固体，但是在直肠温度为液体，因此将在直肠中融化释放药物。这类原料包括可可油、蜂蜡和聚乙二醇。
也可以局部施用本发明的组合物，尤其是当治疗靶标包含局部应用易于到达的区域或器官时(包括眼、皮肤、或下肠道疾病)。易于为这些区域或器官中的每个制备合适的局部制剂。
可以通过直肠栓剂制剂(见上)或通过合适的灌肠剂制剂实现下肠道局部应用。也可以使用局部透皮贴剂。
对于局部应用，可以将该组合物配制在合适的软膏中，所述软膏含有悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性成分。用于局部施用本发明的化合物的载体包括(但是不限于)矿物油、液体矿脂(liquidpetrolatum)、白矿脂、丙二醇、聚环氧乙烷、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。另外，可以将该组合物配制在合适的洗剂或乳膏中，所述洗剂或乳膏含有悬浮或溶解于一种或多种可药用载体中的活性成分。合适的载体包括(但是不限于)矿物油、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酸酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼科使用，可以将该组合物配制为调节pH的等张消毒盐溶液中的微粉化悬浮液，或优选调节pH的等张消毒盐溶液中的溶液，含有或不含诸如benzylalkonium chloride这类防腐剂。另外，对于眼科使用，可以将该组合物配制在软膏中，例如矿脂。
也可以通过鼻气溶胶或吸入剂施用本发明的组合物。根据药物制剂领域众所周知的技术制备这类组合物，并可采用苯甲醇或其它合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规增溶或分散剂在盐溶液中制备为溶液。
几种单克隆抗体显示在临床状态中有效，例如Rituxan(Rituximab)、Herceptin(Trastuzumab)或Xolair(Omalizumab)，可以对本发明的抗体使用类似的施用方案(即制剂和/或剂量和/或施用方法)。可以根据关于这些产物的已知方法(例如使用厂商说明书)确定施用本发明的药物组合物中抗体的方案和剂量。例如，可以将本发明的药物组合物中存在的抗体以10mg/mL的浓度储备在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性使用瓶中。将产品配制在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨酸酯80和用于注射的消毒水中用于IV施用。调节pH至6.5。本发明的药物组合物中抗体的合适的示范性剂量范围可以在大约10mg/m2和500mg/m2之间。然而，应当理解，这些方案是示范性的，可以考虑药物组合物中特定抗体的亲合力和耐受性调整最佳方案，所述药物组合物中特定抗体的亲合力和耐受性是临床试验中必须确定的。将考虑抗体亲合力及其药物代谢动力学参数确定注射本发明的药物组合物中的抗体浸透NK细胞24小时、48小时、72小时或一周或一个月的量和方案。
根据另一个实施方案，本发明的抗体组合物可以另外含有另一种治疗剂，包括通常用于施用所述抗体的特定治疗目的的试剂。额外的治疗剂通常以该试剂在治疗特定疾病或病症的单一疗法中的一般用量出现在组合物中。这类治疗剂包括(但是不限于)用于癌症治疗的治疗剂、用于治疗感染性疾病的治疗剂、用于其它免疫治疗的治疗剂、细胞因子(例如IL-2或IL-15)、其它抗体及其它抗体的片段。
例如，可以利用许多癌症治疗的治疗剂。本发明的抗体组合物和方法可以与任何常用于治疗特定疾病(具体为肿瘤、癌症疾病或患者表现的其它疾病或紊乱)的其它方法组合。只要知道特定的治疗方法本质上对患者无害，并且不显著抵消本发明的组合物中的抗体活性，设想将其与本发明组合。
关于实体瘤治疗，可以与经典方法(例如手术、放射治疗、化学治疗等)组合使用本发明的药物组合物。本发明因此提供组合治疗，其中，在手术或放射治疗同时、之前或之后使用本发明的药物组合物；或在常规化学治疗、放射治疗或抗血管生成剂、或靶向的免疫毒素或coaguligand的同时、之前或之后施用于患者。
在治疗方案中一种或多种试剂与本发明含有抗体的组合物组合使用时，不要求组合的结果是单独执行每个治疗时观察到的作用的加成。尽管通常需要至少加成作用，任何比一种单独治疗增加的抗癌作用将是有利的。同样，对组合治疗没有特定要求表现协同作用，尽管这是的确可能并且有利的。
为了实行组合抗癌治疗，与另一种抗癌剂组合、以能够在动物体内有效引起其组合的抗癌作用的方式给动物简单施用本发明的抗体组合物。因此以能够引起其在肿瘤血管内的组合出现以及在肿瘤环境中的组合作用的有效量和有效时期提供该试剂。为了实现此目标，可以将本发明的抗体组合物和抗癌剂以单个组合的组合物或作为两种不同组合物使用不同施用途径同时施用于动物。
另外，可以以例如从数分钟至周和月范围内的间隔在抗癌剂治疗之前或之后施用本发明的抗体组合物。人们将确保抗癌剂和本发明的抗体组合物中的抗体对癌症发挥有利的组合效果。
在抗血管生成治疗中大多数抗癌剂将在本发明的抑制性KIR抗体组合物之前给予。然而，当在本发明的抗体组合物中使用抗体的免疫缀合物时，可以同时或随后施用多种抗癌剂。
在有些情况下，甚至可能需要显著延长治疗时程，在分别施用抗癌剂或抗癌治疗与施用本发明的抗体组合物之间间隔数天(2、3、4、5、6或7)、数周(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至数月(1、2、3、4、5、6、7或8)。在抗癌治疗旨在基本破坏肿瘤(例如手术或化学治疗)、施用本发明的抗体组合物旨在防止微小转移或肿瘤再生长的情况下，这将是有利的。
也预想将利用一次以上施用本发明的基于抑制性KIR抗体的组合物或抗癌剂。可以在交替的天或周；或本发明的抑制性KIR抗体组合物治疗周期继之以抗癌剂治疗周期交替施用这些试剂。无论如何，为了使用组合治疗实现肿瘤抑制，无论施用次数，所有要求是输送两种试剂有效发挥抗肿瘤作用的组合量。
关于手术，可以与本发明组合实行任何手术干预。关于放射治疗，考虑在癌细胞内诱导DNA局部损伤的任何机制，例如γ放射、X射线、UV放射、微波甚至电子发射等。也考虑将放射性同位素靶向输送至癌细胞，这可以与靶向抗体或其它靶向手段联合使用。
在其它方面，可以与本发明的抗体组合物组合或作为其部分施用免疫调节化合物或方案。免疫调节化合物的优选实例包括细胞因子。在这类组合方法中可以采用多种细胞因子。在本发明设想的组合中有用的细胞因子实例包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNF-α、TNF-β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF，IFN-α、IFN-β、IFN-γ。根据与临床指征(例如患者病症)及细胞因子相对毒性一致的标准方案施用用于本发明的组合治疗或组合物中的细胞因子。
在某些实施方案中，本发明的含有交叉反应抑制性KIR抗体的治疗组合物可以与化学治疗或荷尔蒙治疗剂组合施用，或者可以另外含有所述化学治疗或荷尔蒙治疗剂。在此公开的组合治疗方法中可以使用多种荷尔蒙治疗和化学治疗剂。考虑为示范性的化学治疗剂包括(但是不限于)烷基化试剂、抗代谢物、细胞毒性抗体、长春花生物碱、例如阿霉素、放线菌素D、丝裂霉素、洋红霉素、正定霉素、多柔比星、他莫西芬、泰素、泰索帝、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、环磷酰胺、塞替派、氨甲蝶呤、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)、氨蝶呤、考布他汀及其衍生物和前药。
荷尔蒙剂包括(但是不限于)例如LHRH拮抗剂，例如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林和布舍瑞林；抗雌激素例如他莫西芬和托瑞米芬；抗雄激素例如氟他胺、尼鲁米特、环丙孕酮和比卡鲁胺；芳香酶抑制剂例如阿那曲唑、依西美坦、来曲唑和法倔唑；以及孕激素例如medroxy、氯地孕酮和甲地孕酮。
如本领域普通技术人员将理解的，化学治疗剂的合适剂量将接近临床治疗中已经采用的剂量，其中化学治疗剂单独或与其它化学治疗药物组合施用。仅作为实例，可以使用例如顺铂和其它DNA烷基化试剂。顺铂已被广泛用于治疗癌症，以用于临床应用中的有效剂量20mg/m2每三周使用5天，总共三个疗程。顺铂口服不吸收，因此必须通过静脉内、皮下、肿瘤内或腹膜内注射输送。
其它有用的化学治疗剂包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物、以及破坏多核苷酸前体合成和保真度的试剂。许多用于组合治疗的示范性化学治疗剂列举在美国专利No.6,524,583的表C中，所述美国专利No.6,524,583的试剂和说明的公开内容在此明确引用作为参考。每个列出的试剂是示范性的，并且是非限制性的。技术人员受《Remington′s Pharmaceutical Sciences》第十五版，第33章，具体为624-652页指导。根据所治疗的病症，可能出现剂量变化。施用治疗的医师将能够为个体受试者确定合适的剂量。
本发明的交叉反应抑制性KIR抗体组合物可以与一种或多种其它抗血管生成治疗组合使用，或另外含有抗血管生成剂。这类试剂的实例包括各针对VEGF或VEGF受体的中和抗体、反义RNA、siRNA、RNAi、RNA aptamer和核酶(美国专利No.6,524,583，其公开内容在此引用作为参考)。也可以采用具有拮抗性质的VEGF变体，如WO 98/16551中所描述，其中WO 98/16551在此引用作为参考。对于组合治疗有用的其它示范性抗血管生成剂列举在美国专利No.6,524,583的表D中，所述美国专利No.6,524,583的试剂和指征的公开内容在此明确引用作为参考。
本发明的抑制性KIR抗体组合物也可以有利地与诱导凋亡的方法组合使用，或含有凋亡剂。例如，许多抑制凋亡或程序性细胞死亡的癌基因得到鉴定。该范畴内的示范性癌基因包括(但是不限于)bcr-ab1，bc1-2(不同于bc1-1、细胞周期蛋白D1；GenBank登录号M14745、X06487；美国专利No.5,650,491；及5,539,094；每个在此引用作为参考)以及家族成员，包括Bc1-x1、Mc1-1、Bak、A1和A20。在T细胞淋巴瘤中首先发现了bc1-2的过表达。癌基因bc1-2通过结合并失活凋亡途径中的蛋白质Bax起作用。抑制bc1-2的功能阻止Bax的失活，并允许凋亡途径进行。考虑使用例如反义核苷酸序列、RNAi、siRNA或小分子化学化合物抑制这类癌基因，用于本发明以增加凋亡(美国专利No.5,650,491；5,539,094；及5,583,034；每个在此引用作为参考)。
本发明的抑制性KIR抗体组合物也可以包含含有靶向部分的分子(例如抗体、配体或其缀合物)或与所述分子组合使用，所述含有靶向部分的分子针对靶细胞(例如靶肿瘤细胞)特异性标志(“靶向剂”)。一般而言，用于本发明这些额外方面的靶向剂将优选识别可接近的肿瘤抗原，所述肿瘤抗原优选或特异性表达于肿瘤位点。靶向剂一般将结合肿瘤细胞的表面表达的、表面可及的或表面定位的成分。靶向剂也将优选展示高亲合特性；并且不会在体内对维持生命的正常组织发挥显著副作用，所述维持生命的正常组织例如选自心、肾、脑、肝、骨髓、结肠、乳腺、前列腺、甲状腺、胆囊、肺、肾上腺、肌肉、神经纤维、胰腺、皮肤中的一个或多个组织、或人体内其它维持生命的器官或组织。此处所用的术语“不发挥显著副作用”指靶向剂被体内施用时将仅产生可忽略的或临床可以处理的副作用(例如化学治疗期间通常遇到的那些)的事实。
在肿瘤治疗中，本发明的抗体组合物可以另外含有辅助化合物或与其组合使用。作为实例，辅助化合物可以包括止吐药例如5-羟色胺拮抗剂及治疗剂例如吩噻嗪、取代的苯甲酰胺、抗组胺剂、丁酰苯类、皮质类固醇类、苯二氮杂_类和大麻素类；双膦酸化合物例如唑来膦酸和帕米膦酸；以及造血生长因子例如促红细胞生成素和G-CSF，例如非格司亭、来格司亭和达比波亭(darbepoietin)。
在另一个实施方案中，可以将本发明的两个或多个具有不同交叉反应性的抗体(包括NKVSF1)组合在单个组合物中，从而中和尽可能多的抑制性KIR基因产物的抑制性作用。含有本发明的交叉反应抑制性KIR抗体或其片段或衍生物组合的组合物将允许更广泛的效用，因为可能缺乏被单个交叉反应性抗体识别的每个抑制性KIR基因产物的人群的低百分率可能存在。类似地，本发明的组合物可以另外含有一种或多种识别单个抑制性KIR亚型的抗体。这类组合将再次在治疗情况下提供更广泛的效用。
本发明也提供在需要增强NK细胞活性的患者体内增强NK细胞活性的方法，包括给所述患者施用根据本发明的组合物的步骤。该方法更具体地针对在患有疾病的患者体内增强NK细胞活性，所述疾病中，增加患者NK细胞活性是有益的，该疾病涉及、影响或由对NK细胞造成的裂解易感的细胞引起，或者该疾病由NK细胞活性不足引起、或以其为特征(例如癌症、另一种增生性疾病、感染性疾病或免疫紊乱)。本发明的方法更具体地用于治疗多种癌症和其它增生性疾病，包括(但是不限于)膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、前列腺、胰腺、胃、子宫颈、甲状腺和皮肤(包括鳞状上皮细胞癌)癌；淋巴系造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤；髓系造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和早幼粒细胞白血病；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤(schwannomas)；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎瘤。
可以根据本发明治疗的优选疾病包括淋巴系造血肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤(包括但是不限于T细胞疾病例如T前淋巴细胞白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑回样细胞型的；优选T细胞型的大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)；Sezary综合征(SS)；成人T细胞白血病淋巴瘤(ATLL)；a/d T-NHL肝脾细胞淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞性亚型)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤；血管中心性(鼻性)T细胞淋巴瘤；间变性(Ki 1+)大细胞淋巴瘤；肠T细胞淋巴瘤；T淋巴母细胞性；以及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)。
也可以根据本发明治疗其它增生性疾病，包括例如增生、纤维化(尤其是肺部、但是包括其它类型的纤维化，例如肾纤维化)、血管生成、牛皮癣、动脉粥样硬化和血管内平滑肌增生，例如狭窄或血管成形术后再狭窄。本发明的交叉反应抑制性KIR抗体可以用于治疗或预防感染性疾病，优选地包括任何由病毒、细菌、原生动物、霉菌或真菌引起的感染。这类病毒性感染性生物包括(但是不限于)甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流行性感冒病毒、水痘病毒、腺病毒、I型单纯疱疹(HSV-1)、2型单纯疱疹(HSV-2)、牛瘟病毒、鼻病毒、欧可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头状瘤病毒(papillomavirus)、巨细胞病毒、echinovirus、虫媒病毒(arbovirus)、huntavirus、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、小儿麻痹症病毒(polio virus)和I型或2型人类免疫缺陷病毒(HIV-1，HIV-2)。
可以根据本发明治疗的细菌感染包括(但是不限于)由下列引起的感染葡萄球菌；链球菌，包括化脓性链球菌(S.pyogenes)；肠球菌；芽孢杆菌，包括炭疽杆菌(Bacillus anthracis)和乳酸杆菌；利斯特菌；白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；加德纳菌，包括阴道加德纳菌(G.vaginalis)；诺卡氏菌；链霉菌；普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)；密螺旋体属；弯曲杆菌；假单胞菌，包括Raeruginosa；军团菌；奈瑟菌，包括淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟菌(N.meningitides)；黄杆菌，包括脑膜脓毒血性黄杆菌(F.meningosepticum)和气味黄杆菌(F.odoraturn)；布鲁氏菌；博德特氏菌，包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)和支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)；埃希氏菌，包括大肠杆菌(E.coli)、克雷伯菌；肠杆菌、沙雷氏菌，包括粘质沙雷氏菌(S.marcescens)和液化沙雷氏菌(S.liquefaciens)；爱德华氏菌；变形杆菌，包括奇异变形杆菌(P.mirabilis)和普通变形杆菌(P.vulgaris)；链杆菌；立克次体，包括R.fickettsfi，衣原体，包括鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和砂眼衣原体(C.trachomatis)；分枝杆菌，包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、M.folluiturn、麻风分枝杆菌(M.laprae)、鸟分枝杆菌(M.avium)、牛分枝杆菌(M.boyis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)及鼠麻疯分枝杆菌(M.lepraemurium)；以及诺卡氏菌。
根据本发明可以治疗的原生动物感染包括(但是不限于)由利氏曼原虫(leishmania)、kokzidioa以及锥形虫(trypanosoma)引起的感染。在疾病控制中心(CDC)的国家传染病中心(NCID)(http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/)网站可见感染性疾病的完整列表，所述完整列表在此引用作为参考。上述所有疾病都是使用本发明的交叉反应抑制性KIR抗体治疗的候选疾病。
这类治疗多种感染性疾病的方法可以单独或与其它治疗和/或已知用于治疗这类疾病的治疗剂组合采用本发明的抗体，所述治疗试剂包括抗病毒剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗生素、抗寄生虫剂和抗原生动物剂。当这些方法涉及使用额外治疗剂的额外治疗时，可以将这些试剂与本发明的抗体一起以单剂形式或以分离的、多剂形式施用。当以分离的剂量形式施用时，可以在施用本发明的抗体之前、同时或随后施用额外的试剂。
本发明的其它方面和优点将在下面的实验部分公开，所述实验部分应视为说明性的，而非限制本申请的范围。
实施例1PBL的纯化及多克隆或克隆NK细胞系的产生。
通过Ficoll Hypaque梯度及耗尽粘附塑料的细胞从健康供体获得PBL。为了获得富集的NK细胞，将PBL与抗CD3、抗CD4和抗HLA-DRmAb(4℃，30分钟)孵育，随后为山羊抗小鼠磁珠(Dynal)(4℃，30分钟)以及使用本领域已知方法的免疫磁选择(Pende等人，1999)。在经过照射的饲养细胞和100U/ml白介素2(Proleukin，ChironCorporation)和1.5ng/ml植物凝集素A(Gibco BRL)上培养CD3-、CD4-、DR-细胞以获得多克隆NK细胞群。通过有限稀释克隆NK细胞，并通过流式细胞术关于细胞表面受体表征NK细胞克隆。
使用的mAb是JT3A(IgG2a、抗CD3)、EB6和GL183(IgG1，分别抗KIR2DL1和KIR2DL3)、XA-141 IgM(以与EB6相同的特异性抗KIR2DL1)、抗CD4(HP2.6)、以及抗DR(D1.12、IgG2a)。可以使用可通过商业途径获得、具有相同特异性的mAb(Beckman CoulterInc.，Fullerton，CA)取代由申请人生产的JT3A、HP2.6及DR1.12。EB6和GL183可通过商业途径获得(Beckman Coulter Inc.，Fullerton，CA.XA-141不可通过商业途径获得，但是可以按照(Moretta等人，1993)中所述使用EB6作为对照再现裂解)。
用合适的抗体(4℃，30分钟)继之以PE或FITC缀合的多克隆抗小鼠抗体(Southern Biotechnology Associates Inc)染细胞。在FACSAN仪器(Becton Dickinson，Mountain View，CA)上通过细胞荧光测定分析法分析样品。
在该研究中使用下列克隆。CP11、CN5和CN505为KIR2DL1阳性克隆，由EB6(IgG1抗KIR2DL1)或XA-141(与EB6抗体相比具有相同特异性的IgM抗KIR2DL1)染色。CN12和CP502为KIR2DL3阳性克隆，由GL183抗体(IgG1抗KIR2DL3)染色。
通过标准4小时51Cr释放测定评定NK克隆的溶细胞活性，在所述标准4小时51Cr释放测定中，在已知其对NK细胞裂解的灵敏度的Cw3或Cw4阳性细胞系上测试效应NK细胞。以微滴定板中每孔5000个细胞使用所有靶细胞，效应细胞靶细胞比显示于图中(通常每个靶细胞4个效应细胞)。使用或不使用_稀释的所示单克隆抗体上清执行溶细胞测定。程序与(Moretta等人，1993)中所述基本相同。
实施例2新mAb的产生按照(Moretta等人，1990)中所述，以活化的多克隆或单克隆NK细胞系免疫5周龄Balb C小鼠以产生mAb。不同细胞融合后，首先对其与EB6和GL183阳性NK细胞系和克隆交叉反应的能力选择mAb。对其再现分别由EB6阳性或GL183阳性NK克隆造成的Cw4或Cw3阳性靶细胞裂解的能力进一步筛选阳性单克隆抗体。
如下执行细胞染色。以一组抗体(1μg/ml或50μl上清，4℃，30分钟)继之为PE缀合的山羊F(ab’)2片段抗小鼠IgG(H+L)或PE缀合的山羊F(ab’)2片段抗人IgG(Fcγ)抗体(Beckman Coulter)染细胞。在Epics XL.MCL仪器(Beckman Coulter)上执行细胞荧光测定分析。
单克隆抗体之一(DF200mAb)与包括KIR2DL1、KIR2DL2/3的多个KIR家族成员反应。KIR2DL1+和KIR2DL2/3+NK细胞均被DF200mAb亮染(图1)。
使用表达这些HLA I类特异性抑制性受体中一种或另一种(或甚至两种)的NK克隆作为针对表达一种或多种HLA-C等位基因的靶细胞的效应细胞。如下执行细胞毒性测定。通过标准4小时51Cr释放测定评定YTS-KIR2DL1或YTS-Eco细胞系的溶细胞活性。在HLA-Cw4阳性或阴性EBV细胞系和HLA-Cw4转染的721.221细胞上测试效应细胞。以微滴定板中每孔3000个细胞使用所有靶细胞。效应细胞/靶细胞比显示于图中。使用或不使用所示单克隆小鼠或人类抗体的全长或F(ab’)2片段执行溶细胞测定。KIR2DL1+NK克隆如期对表达HLA-Cw4的靶细胞展示即使有也很少的溶细胞活性，KIR2DL3+NK克隆在Cw3阳性靶细胞上展示很少或者没有活性。然而，在DF200mAb(用于掩盖其KIR2DL受体)存在下，NK细胞变得不能识别其HLA-C配体，并对Cw3或Cw4靶细胞表现出强烈的溶细胞活性。
例如C1R细胞系(CW4+EBV细胞系，ATCC n℃RL 1993)不被KIR2DL1+NK克隆(CN5/CN505)杀伤，但是使用DF200或常规抗KIR2DL1 mAb可以有效逆转该抑制。另一方面，表达KIR2DL2/3+KIR2DL1-表型的NK克隆(CN12)有效杀伤C1R细胞，而且这种杀伤不受DF200 mAb影响(图2)。以KIR2DL2或KIR2DL3阳性NK克隆在Cw3阳性靶细胞上获得类似结果。
类似地，Cw4+221EBV细胞系不被KIR2DL1+转染的NK细胞杀伤，但是使用DF200、DF200 Fab片段或常规抗KIR2DL1 mAb EB6或XA141可以有效逆转该抑制。同样，Cw3+221EBV细胞系不被KIR2DL2+NK细胞杀伤，但是使用DF200或DF200Fab片段可以逆转该抑制。最后，后面的Cw3+221 EBV细胞系不被KIR2DL3+NK细胞杀伤，但是使用DF200 Fab片段或常规KIR2DL3 mAb GL183或Y249可以逆转该抑制。结果显示于图3中。
对F(ab’)2片段测试其再现Cw4阳性靶细胞裂解的能力。DF200和EB6抗体的F(ab’)2片段都能逆转对KIR2DL1转染的NK细胞裂解Cw4转染的221细胞系和Cw4+TUBO EBV细胞系的抑制。结果显示于图4中。
实施例4新的人类mAb的产生通过以重组KIR蛋白质免疫经改造表达人类抗体库的转基因小鼠产生人类抗KIR单克隆抗体。不同细胞融合后，首先对其与固定的KIR2DL1和KIR2DL2蛋白质交叉反应的能力选择mAb。几种单克隆抗体(包括1-7F9、1-4F1、1-6F5和1-6F1)与KIR2DL1和KIR2DL2/3反应。
对其再现由表达KIR2DL1的EB6阳性NK转染子造成的Cw4阳性靶细胞裂解的能力进一步筛选阳性单克隆抗体。使用表达HLA I类特异性抑制性抗体的NK细胞作为针对表达一种或多种HLA-C等位基因的靶细胞的效应细胞(图5和6)。如上所述执行细胞毒性测定。效应细胞/靶细胞比显示于图中，以10ug/ml或30ug/ml使用抗体。
KIR2DL1+NK细胞如期对表达HLA-Cw4的靶细胞展示出即使有也很少的溶细胞活性。然而，在1-7F9mAb存在下，NK细胞变得不能识别其HLA-C配体，并对Cw4靶细胞展示强烈的溶细胞活性。例如，测试的两个细胞系(HLA-Cw4转染的721.221和CW4+EBV细胞系)不被KIR2DL1+NK细胞杀伤，但是使用mAb 1-7F9或常规抗KIR2DL1 mAb EB6可以有效逆转该抑制。将抗体DF200和panKIR(也称为NKVSF1)与1-7F9比较。另一方面，抗体1-4F1、1-6F5和1-6F1不能再现NK细胞造成的Cw4阳性靶细胞细胞裂解。
实施例5DF200 mAb/KIR2DL1与DF200 mAb/KIR2DL3相互作用的Biacore分析重组蛋白质的生产和纯化在大肠杆菌中生产KIR2DL1和KIR2DL3重组蛋白质。使用PCR分别从pCDM8克隆47.11载体(Biassoni等人，1993)和RSVS(gpt)183克隆6载体(Wagtman等人，1995)扩增编码KIR2DL1和KIR2DL3完整细胞外结构域的cDNA，使用下列引物有义5’-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3’反义5’-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3’将其与编码生物素化信号的序列按读码框克隆到pML1表达载体中(Saulquin等人，2003)。
在BL21(DE3)菌株(Invitrogen)中执行蛋白质表达。在添加氨苄青霉素(100μg/ml)的培养基中于37℃将转染的细菌培养至OD600＝0.6，以1mM IPTG诱导表达。
在变性条件下(8M尿素)从包涵体回收蛋白质。通过在六步透析(分别为4、3、2、1、0.5和0M尿素)中降低尿素浓度，在含有L-精氨酸(400mM，Sigma)和β-巯基乙醇(1mM)的20mM Tris，pH7.8，NaCl 150mM缓冲液中于室温进行重组蛋白质的再折叠。在0.5和0M尿素透析步骤期间加入还原型和氧化型谷胱甘肽(分别为5mM和0.5mM，Sigma)。最后，针对10mM Tris、pH7.5、NaCl 150mM缓冲液大量透析蛋白质。浓缩并然后在Superdex 200大小排阻柱上(Pharmacia；AKTA系统)纯化可溶性再折叠蛋白质。
在Biacore仪器(Biacore)上执行表面等离子共振测量。在所有Biacore实验中，以添加0.05％表面活性剂P20的HBS缓冲液作为运行缓冲液。
蛋白质固定。
将如上所述产生的重组KIR2DL1和KIR2DL3蛋白质共价固定至传感器芯片(Sensor Chip)CM5(Biacore)葡聚糖层的羧基上。以EDC/NHS(N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，Biacore)活化传感器芯片表面。注射偶联缓冲液(10mM醋酸，pH4.5)中的蛋白质。使用100mM乙醇氨pH8(Biacore)执行残余活化基团的钝化。
亲合力测量。
对于动力学测量，将多种浓度的可溶性抗体(1×10-7至4×10-10M)施加于固定的样品上。以20μl/分钟的连续流速执行测量。对于每个循环，注射5μl 10mM NaOH pH11再生传感器芯片表面。使用BIAlogueKinetics Evaluation程序(BIAevaluation 3.1，Biacore)分析数据。在含有500或540个反射系数单位(RU)及分别1000或700RU的KIR2DL1和KIR2DL3的葡聚糖层上，以20μl/分钟的流速注射HBS缓冲液中的可溶性分析物(多种浓度，40μl)。数据代表六个独立实验。结果显示于表1中，见下。
表1.DF200mAb结合固定的KIR2DL1和KIR2DL3的BIAcore分析。
KD解离常数。
实施例6鼠和人类抗KIR抗体的Biacore竞争性结合分析按照前面说明(Gauthier等人1999，Saunal及van Regenmortel1995)，在固定的KIR 2DL1(900RU)、KIR 2DL3(2000RU)和KIR2DS1(1000RU)上以小鼠抗KIR 2D抗体DF200、Pan2D、gl183和EB6以及人抗KIR 2D抗体1-4F1、1-6F1、1-6F5和1-7F9实施表位作图分析。
用15μg/ml的不同抗体的两分钟注射在HBS缓冲液中于5μl/分钟的流速完成所有实验。分两个步骤对每对抗体进行竞争性结合分析。第一个步骤中，将第一个单克隆抗体(mAb)注射到KIR 2D靶蛋白质上，随后为第二个mAb(不去除第一个mAb)，并监测第二个mAb的RU值(RU2)。在第二步中，首先将第二个mAb直接注射到裸露的KIR2D蛋白质上，并监测mAb的RU值(RU1)。通过100*(1-RU2/RU1)计算由第一个mAb造成的第二个mAb对KIR 2D蛋白质结合的抑制百分数。
结果显示于表2、3和4中，其中指定为“第一个抗体”的抗体列于垂直栏内，“第二个抗体”列于水平栏内。对于测试的每个抗体组合，抗体对芯片直接结合水平的值(RU)列于表中，其中第二个抗体对KIR2D芯片的直接结合列于格的上部，第一个抗体存在时第二个抗体对KIR2D芯片结合的值列于格的下部。列于各格右侧的是第二个抗体结合的抑制百分比。表2显示KIR2DL1芯片上的结合，表3显示抗体对KIR2DL3芯片的结合，表4显示抗体对KIR2DS1芯片的结合。
评定鼠抗体DF200、NKVSF1和EB6、以及人抗体1-4F1、1-7F9和1-6F1对固定的KIR2DL1、KIR2DL2/3和KIR2DS1的竞争性结合。来自抗KIR抗体结合KIR2DL1实验的表位作图(图7)显示(a)抗体1-7F9与EB6和1-4F1竞争，但是不与NKVSF1和DF200竞争；(b)抗体1-4F1依次与EB6、DF200、NKVSF1和1-7F9竞争；(c)NKVSF1与DF200、1-4F1和EB6竞争，但是不与1-7F9竞争；以及(d)DF200与NKVSF1、1-4F1和EB6竞争，但是不与1-7F9竞争。来自抗KIR抗体结合KIR2DL3实验的表位作图(图8)显示(a)1-4F1与NKVSF1、DF200、gl183和1-7F9竞争；(b)1-7F9与DF200、gl183和1-4F1竞争，但是不与NKVSF1竞争；(c)NKVSF1与DF200、1-4F1和GL183竞争，但是不与1-7F9竞争；以及(d)DF200与NKVSF1、1-4F1和1-7F9竞争，但是不与GL183竞争。来自抗KIR抗体结合KIR2DS1实验的表位作图(图9)显示(a)1-4F1与NKVSF1、DF200和1-7F9竞争；(b)1-7F9与1-4F1竞争但是不与DF200和NKVSF1竞争；(c)NKVSF1与DF200和1-4F1竞争，但是不与1-7F9竞争；以及(d)DF200与NKVSF1和1-4F1竞争，但是不与1-7F9竞争。
实施例7以猕猴NK细胞滴定抗KIR mAb测试抗KIR抗体NKVSF1结合猕猴NK细胞的能力。抗体与猴NK细胞的结合显示于图10中。
猴PBMC的纯化及总的多克隆NK细胞的产生。
从柠檬酸钠CPT管(Becton Dickinson)制备猕猴PBMC。使用负消耗法(negative depletion)执行NK细胞纯化(猕猴NK细胞富集试剂盒，Stem Cell Technology)。在经放射处理的人类饲养细胞、300U/ml白介素2(Proleukin，Chiron Corporation)和1ng/ml植物凝集素A(Invitrogen，Gibco)上培养NK细胞以获得多克隆NK细胞群。
以猕猴NK细胞滴定Pan2D mAb。
将猕猴NK细胞(总NK16天)与不同量的Pan2D mAb以及继之以PE缀合的山羊F(ab’)2片段抗小鼠IgG(H+L)抗体孵育。用同种型对照(纯化的小鼠IgG1)确定阳性细胞百分率。一式两份处理样品。平均荧光强度＝MFI。
表2KIR2DL1表位作图←第二Ab→
表3KIR2DL3表位作图←第二Ab→
表4KIR2DS1表位作图←第二Ab→
实施例8DF200及pan2D结合KIR2DL1的表位作图基于其发表的晶体结构(Maenaka等人，(1999)；Fan等人，(2001)；Boyington等人，(2000))，KIR2DL1、2和3(KIR2DL1-3)细胞外结构域的计算机模拟预测氨基酸R1311涉及KIR2DL1与KIR2DL1-3交叉反应性小鼠单克隆抗体(mAb)DF200和pan2D之间的相互作用。制备融合蛋白质以验证该预测，所述融合蛋白质由与人类Fc(hFc)融合的野生型或点突变(例如R131W2)KIR2DL1的完整细胞外结构域(氨基酸H1-H224)组成。在(Winter和Long(2000))中描述了用于生产和评价多种KIR2DL1-hFc融合蛋白质的材料和方法。简而言之，基于PCR诱变(Quickchange II，Promega)已发表的生产野生型KIR2DL1-hFc的cDNA载体CL42-Ig(Wagtmann等人，(1995))，产生编码KIR2DL1(R131W)-hFc的cDNA载体。基本按照所述(Wagtmann等人，(1995))在COS7细胞中生产KIR2DL1-hFc和KIR2DL1(R131W)-hFc，并将其从组织培养基中分离。为了测试其正确折叠，将KIR2DL1-hFc和KIR2DL1(R131W)-hFc与表达HLA-Cw3(无KIR2DL1配体)或HLA-Cw4(KIR2DL1配体)的LCL721.221细胞孵育，通过研究细胞表面蛋白质相互作用的标准技术FACS分析KIR-Fc融合蛋白质与细胞之间的相互作用。在图11A栏中给出了独立实验的实例。正如从文献所预测的，没有KIR2DL1-hFc融合蛋白质与表达HLA-Cw3的LCL721.221细胞结合。相反，KIR2DL1-hFc和KIR2DL1(R131W)-hFc都与表达HLA-Cw4的LCL721.221细胞结合，从而证实其正确折叠。
使用研究蛋白质相互作用的标准技术ELISA研究KIR2DL1(R131W)-hFc和KIR2DL1-hFc与KIR-特异性mAb(DF200、pan2D、EB6和GL183)的结合。简而言之，通过山羊抗人抗体将KIR2DL1(R131W)-hFc和KIR2DL1-hFc与96孔板连接，此后以多种浓度(0-1μg/ml，于PBS中)加入KIR特异性mAb。使用对小鼠抗体特1单字母氨基酸编码2在KIR2DL1中的氨基酸131位(从N末端数起)以R取代W异的过氧化物酶耦连的二级抗体转化TMB底物，通过分光光度法(450nm)显现KIR2DL1-hFc变体与mAb之间的相互作用。在图11B栏中给出了独立实验的实例。尽管KIR2DL2-3特异性mAb GL183不能结合任何KIR2DL1-hFc融合蛋白质，KIR2DL1特异性mAb EB6、DF200和pan2D以剂量依赖的方式结合KIR2DL1-hFc变体。单独的点突变(R131W)影响DF200及pan2D的结合，在mAb的最高浓度(1μg/ml)与野生型相比约降低10％的结合，证实R131是DF200和pan2D在KIR2DL1的细胞外结构域2中的结合位点的一部分。
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本发明在适用法律允许的最大程度包括在此提出的方面和权利要求书中陈述的所有修改和等价物。
权利要求
1.产生抗体的方法，所述抗体与多种KIR2DL基因产物交叉反应并中和这类KIR的抑制活性，所述方法包括步骤(a)以含有KIR2DL多肽的免疫原免疫非人类哺乳动物；(b)从所述免疫的哺乳动物制备抗体，其中所述抗体与所述KIR2DL多肽结合，(c)选择(b)中的抗体，所述抗体与至少两种不同的KIR2DL基因产物交叉反应，并且(d)选择(c)中的抗体，所述抗体增强NK细胞(e)选择抗体，所述抗体与灵长动物NK细胞或KIR多肽结合。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(e)中的灵长动物是猕猴。
3.评估抗体毒性的方法，其中将根据权利要求1或2的方法产生的抗体施用于灵长动物。
4.根据权利要求3的方法，其中灵长动物是猕猴。
5.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图12中列出的DF-200的轻链可变区序列。
6.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图12中列出的Pan2D的轻链可变区序列。
7.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图12中列出的DF-200的一个或多个轻链可变区CDR。
8.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图12中列出的Pan2D的一个或多个轻链可变区CDR。
9.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图13中列出的DF-200的重链可变区序列。
10.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图13中列出的DF-200的一个或多个重链可变区CDR。
11.抗体，所述抗体在由氨基酸残基(105、106、107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181、192)定义的区域内与KIR2DK1专一结合。
12.抗体，所述抗体与KIR2DL1和KIR 2DL2/3结合而不与由残基(105、106、107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181、192)定义的区域之外的氨基酸残基相互作用。
13.抗体，所述抗体与KIR2DL1结合并且不与KIR2DL1突变体结合，所述KIR2DL1突变体中R131是Ala。
14.抗体，所述抗体与KIR2DL1结合并且不与KIR2DL1突变体结合，所述KIR2DL1突变体中R157是Ala。
15.抗体，所述抗体与KIR2DL1结合并且不与KIR2DL1突变体结合，所述KIR2DL1突变体中R158是Ala。
16.抗体，所述抗体与KIR2DL1残基(131、157、158)结合。
17.抗体，所述抗体与KIR2DS3(R131W)结合、但是不与野生型KIR2DS3结合。
18.抗体，所述抗体与KIR2DL1和KIR2DL2/3以及KIR2DS4结合。
19.抗体，所述抗体与KIR2DL1和KIR2DL2/3结合，但是不与KIR2DS4结合。
全文摘要
本发明涉及调节受试者免疫应答的新组合物和方法。本发明更具体地涉及调节哺乳动物受试者体内NK细胞活性、并允许NK细胞细胞毒性增强的特异性抗体。本发明也涉及这类抗体的片段和衍生物以及含有它们的药物组合物、及其具体在治疗中增加受试者体内NK细胞活性或细胞毒性中的用途。
文档编号G01N33/52GK1842541SQ200480021897
公开日2006年10月4日 申请日期2004年7月1日 优先权日2003年7月2日
发明者S·B·帕德克杰尔, A·莫雷塔, M·D·谢萨, P·安德烈, L·戈捷, P·A·N·R·瓦格特曼 申请人:诺沃挪第克公司, 伊纳特医药两合公司, 热纳亚大学