一种nk细胞因子混合物的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于肿瘤生物治疗领域，涉及一种NK细胞的活化方法获得的NK细胞和细胞因子混合物及其应用。本发明获得的NK细胞是在体外培养、激活和扩增的具有细胞毒作用的肿瘤杀伤细胞，将其回输到患者体内可直接杀伤肿瘤细胞、提高免疫力；本发明的NK细胞培养上清液及予以冷冻干燥浓缩制成的冻干粉制剂含有一系列具有生物活性的天然细胞因子混合物，这种天然细胞因子的混合物在抗肿瘤治疗中具有良好的抗肿瘤活性。
【专利说明】—种NK细胞因子混合物的制备方法及其应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于肿瘤生物治疗领域，涉及一种NK细胞因子混合物的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0003]自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK)是人体内第一道与生俱来的免疫防线成员之一，也是对抗癌细胞或病毒最强、最有效的免疫淋巴细胞，与其他抗癌免疫细胞如毒性 T 细胞(Cytotoxic T cells, CTL)或树突状细胞(Dendritic cells, DC)相比，NK 细胞具广谱性、不受组织兼容性抗原限制且不需要致敏作用的启动即可直接发动对癌细胞的攻击，因此称为自然杀伤细胞。NK细胞对多种感染性微生物和肿瘤细胞起着免疫监视的作用，具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节的作用，其靶细胞主要有肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等。
[0004]临床实验表明:获得肿瘤患者的免疫细胞后，进行体外刺激、扩增培养后回输到患者体内，可以直接杀伤肿瘤细胞、恢复或增强患者的免疫机能达到抑制肿瘤生长的作用。
[0005]自然杀伤活性的NK细胞其杀伤介质主要有穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等。活化的NK细胞可合成并分泌多种细胞因子，发挥免疫调节和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用，这些细胞因子包括白介素(Interleukins, ILs )、集落刺激因子(ColonyStimulating Factors, CSFs)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factors, TNFs)、干扰素(Interferons, IFNs)以及穿孔素(Perforin)等。IL_2是参入免疫应答的重要细胞因子,参与炎症反应、抗肿瘤反应和移植排斥反应，在调控T细胞免疫应答中起重要作用；CSFs具有增强细胞介导的抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)，对粒细胞和巨噬细胞有直接的趋化作用，在抗肿瘤免疫中有重要作用，CFSs与IL-2 —起还能诱导前体T细胞的生长等；TNFs可诱导T细胞表达MHC-1I类分子和高亲和力的IL-2受体，协同IL-2促进T细胞产生IFN-Y和增强细胞毒活性，还可增强巨噬细胞的活性和杀伤能力、免疫应答能力，对炎症局部的中性粒细胞的活性和聚集也有促进作用；IFNs是最先发现的具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等活性的细胞因子。能通过多种机制影响肿瘤细胞功能，促进免疫细胞的活性；穿孔素的作用是在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道，使颗粒酶进入靶细胞，引起靶细胞凋亡。
[0006]目前，利用基因工程技术生产的重组细胞因子作为生物应答调节剂(BRM)治疗肿瘤、造血障碍、感染等已收到良好的疗效。美国食品药品监督管理局(FDA)已批准重组白介素12 (rIL-12)作为多毛细胞白血病、卡波济氏肉瘤以及慢性肝炎的临床治疗药物，批准重组IFN-Y用于治疗慢性肉芽肿病以及批准rIL-2在胃细胞癌上的临床应用。
[0007]NK细胞在培养过程中，产生一系列的天然细胞因子并分泌于培养上清液中形成天然细胞因子混合物(nonrecombinant cytokine mixture, NCM)。 [0008]NCM疗法已被国外证实是一种安全有效的治疗方法，不但能够直接发挥抗肿瘤作用，而且还可通过多种途径激活和增强人体免疫系统，清除已发生转移的瘤细胞。美国Cel-Sci公司自主研发的细胞因子混合物白介素注射液(Multikine?)用于抗肿瘤应用，通过改变肿瘤细胞的细胞周期，从而提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性。Hemispherx生物制药公司研发的天然的IFN-α s注射剂(Alferon N)是由二十几种甚至更多的淋巴因子组成的混合物，在治疗尖锐湿疣症中显示了良好的治疗效果。
[0009]传统NK细胞培养方法中需要用PHA和/或肿瘤细胞株(如K562、HFffT以及K562-MB15-41BBL)作刺激因子和滋养层来培养NK细胞，具有繁琐的细胞培养步骤，使用PHA和肿瘤细胞株也带来安全问题。
【发明内容】
[0010]本发明首先所要解决的技术问题提供更加高效安全的NK细胞培养方法，以及提供一种NK细胞因子混合物的制备方法及其应用。
[0011]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种NK细胞的培养方法，包括如下步骤:将分离好的单个核细胞置于含有0KT-3抗体和IL-2细胞因子的培养液中，培养五天后，每2天更换一次新鲜NK细胞培养基，并添加IL-12和IL-15，使其在培养液中浓度分别达到10ng/ml和50ng/ml，培养至21天。
[0012]传统NK细胞培养方 法中，PHA作为一种有丝分裂原，主要用于激活免疫淋巴细胞，由于其较难提纯，且成本极高，一直以来仅在实验室中作为刺激淋巴细胞增殖的试剂，难以大规模普及应用，且对免疫细胞具有过度刺激的作用。本发明仅仅采用IL-2、0KT-3、IL-12以及IL-15的有效组合，本发明中所添加的IL-12和IL-15基本可以取代细胞株分泌的因子对NK的刺激增殖作用，这些因子的共同刺激有利于NK细胞的生长扩增，第5天添加IL-12和IL-15后即可发现NK细胞迅速处于扩增状态，而其它类型的细胞开始逐渐处于抑制生长状态，第20天后可以获得较高纯度的NK细胞，高达64%，以及获得大量的NK细胞，细胞扩增效率高达510倍。
[0013]本发明还提供细胞毒NK细胞制剂的制备方法，具体如下:
从细胞培养第9天开始每隔两天将部分细胞收获，离心后弃上清，细胞沉淀用复方电解质注射液悬浮后再离心，重复一次，弃上清，将细胞沉淀用复方电解质注射液悬浮均匀，加入人血白蛋白，毒性NK细胞制剂的制备完成。
[0014]本发明进一步提供一种细胞因子混合物的制备方法，具体如下:
从细胞培养第6~12天离心收集细胞上清液，将细胞返还细胞培养瓶或细胞培养袋中；低温下将上清液超速离心，弃沉淀，取上清超滤、微滤，将获得的滤液4°C短期保存备用，或-20°C长期保存备用。
[0015]于无菌条件下，将上述滤液等体积分装于安瓿瓶中，并置于冻干盘内，-20°C预冻上清液至凝固状态，同时抽真空，升华干燥，去除冰晶，塞入卤化丁基胶塞，加盖铝塑盖封口，于4°C保存冻干粉或运输。
[0016]本发明方法采用本身具有抗肿瘤免疫效应的NK细胞进行培养，一段时间后可以获得活化的具有细胞毒作用的肿瘤杀伤NK细胞。同时，细胞培养过程中会分泌多种高含量的天然细胞因子于培养基中(如表1、2)在此特定时期收集细胞培养上清，通过超速离心、超滤微滤，可以获得可供临床使用的，含有多种高含量天然细胞因子混合物。所制得的细胞因子混合物中含有如穿孔素、颗粒酶和肿瘤坏死因子等，可以引起恶性肿瘤细胞破裂或凋亡，直接发挥抗肿瘤作用；还含有其它如IL-10、TGF等对机体免疫系统具有调节作用的因子，可以在体内相互协同作用，刺激体内具有肿瘤杀伤作用的免疫细胞增殖、成熟，从而间接发挥抗肿瘤作用。所制得的细胞因子混合物是天然细胞因子，与临床使用的重组细胞因子相t匕，具有天然构象，活性更强；各种细胞因子量是免疫细胞按最佳配比分泌的，有理由推测这种配比可能与NK细胞发挥强大的抗肿瘤作用相关，也可能是在体内发挥作用最合适的。
【具体实施方式】
[0017]1、NK细胞的体外培养、扩增和激活
1)无菌条件下从患者静脉抽取20ml的外周血于50ml离心管中，加入300IU肝素钠抗凝剂；
2)按1:1加入生理盐水或PBS稀释；
3)向空的15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，取IOml稀释血液缓慢加入15ml离心管中，1500rpm,离心20min,取白膜层细胞并用生理盐水洗漆，1200rpm,离心10min后PBS重悬，重复I次，弃上清；
4)用NK细胞培养基重悬上述细胞，并添加抗CD3抗体(Orthoclone0KT-3; Ortho
Biotech, Raritan, NJ),抗体终浓度调至 10ng/ml ;
【权利要求】
1.一种NK细胞的培养方法，其特征在于: 将分离好的单个核细胞置于含有0KT-3抗体和IL-2细胞因子的培养液中，培养五天后，每2天更换一次新鲜NK细胞培养基，并添加IL-12和IL-15，使其在培养液中浓度分别达到10ng/ml和50ng/ml,培养至21天。
2.一种细胞毒NK细胞制剂的制备方法，其特征在于: 将分离好的单个核细胞置于含有0KT-3抗体和IL-2细胞因子的培养液中，培养五天后，每2天更换一次新鲜NK细胞培养基，并添加IL-12和IL-15，使其在培养液中浓度分别达到10ng/ml和50ng/ml,培养至21天; 从细胞培养第9天开始每隔两天将部分细胞收获，置于50mL离心管中，1200rpm，离心IOmin,弃上清，细胞沉淀用复方电解质注射液悬浮，1000rpm,离心10min，重复一次，弃上清，将细胞沉淀用95mL复方电解质注射液悬浮均匀，转移到IOOmL玻璃瓶中，加入5mL 20%人血白蛋白，毒性NK细胞制剂的制备完成。
3.一种细胞因子混合物的制备方法，包括如下步骤: 将分离好的单个核细胞置于含有0KT-3抗体和IL-2细胞因子的培养液中，培养五天后，每2天更换一次新鲜NK细胞培养基，并添加IL-12和IL-15，使其在培养液中浓度分别达到10ng/ml和50ng/ml,培养至21天; 从细胞培养第6~12天离心收集细胞上清液，将细胞返还细胞培养瓶或细胞培养袋中；4°C下将上清通过50000 rpm超速离心2h,弃沉淀,取上清超滤,再用0.Ι?μπι微孔滤膜微滤，将滤液添加进细胞制剂中，或4°C短期保存备用，或_20°C长期保存备用。
4.权利要求3所制备的细胞因子混合物。
5.权利要求4所述的细胞因子混合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103923879SQ201410175015
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】吴皖, 王雄伟, 汤威, 邢文彦, 罗琳 申请人:湖北华赛生物医药技术有限公司