一种重组g-csf（15-75）多肽毕赤酵母菌的发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及重组毕赤酵母的发酵，尤其设及制备重组人粒细胞刺激因子多肤 G-CSF(15-75)的毕赤酵母菌的发酵方法
【背景技术】
[0002] 人粒细胞刺激因子化umangranuloc}ftecolony-stimulatingfactors,hG-CSFO 是一种特异的作用于粒系祖细胞，促进其向成熟中性粒细胞增殖、分化并维持其功能、存活 所必须的糖蛋白造血生长因子。1986年，由化gata等从人鱗状细胞癌细胞系CHU-II中分 离了hG-CSF基因，首次确定了其核巧酸序列并在COS细胞中表达（化gataSetal，化化re， 1986,319 :415-418)。人类有两种不同的G-CSF的cDNA，分别编码含207和204个氨基酸 的前体蛋白，均有30个氨基酸的信号肤，成熟蛋白分子为177和174个氨基酸，前者除了在 成熟分子N端35位处插了 3个氨基酸外，其余的序列与174氨基酸分子相同。 阳00引人G-CSF分子量19.6kD，PI为6. 1,0-糖基化，对酸碱（P肥~10)、热W及变性剂等 相对较稳定。hG-CSF有5个半脫氨酸残基，其中4个半脫氨酸残基在切s36与切s42,切s74 与切s64之间形成两对二硫键；切sl7为不配对半脫氨酸，二硫键的形成对于维持G-CSF生 物学功能非常重要。G-CSF在临床应用上具有重要意义，骨髓移植时可促进中性白细胞的恢 复；改善再生障碍性贫血伴随的中性白细胞缺乏症；明显改善癌症化疗时引起的严重的中 性粒细胞缺乏，加大肿瘤治疗的力度，增强治疗效果；广泛应用于其他伴有中性粒细胞减少 的疾病及抗感染等的治疗。
[0004] G-CSF于1991年被美国FDA批准投放市场，用于治疗放疗后中性粒细胞减少症，长 效的阳G化的G-CSF也获得抑A的批准，国内开发的G-CSF二聚体F-627也已完成II期临 床，并取得较好的效果。John.F.Rei化aar-Olson研究发现G-CSF的Leul5、Glul9、Gln25、 Leu31、Lys34、Lys40、Leu47、Val48、Leu49、Leu54对蛋白活性起重要作用，二硫键对于受体 的二聚化，激活下游信号传导起重要作用。目前，国内生产的G-CSF大多数为大肠杆菌表达 产物，在生产过程中，大肠杆菌表达蛋白的纯化工艺繁琐，周期长，回收率低的特点限制了 其在大规模生产中的应用。毕赤酵母表达外源蛋白技术已经成熟，且分泌表达外源蛋白时 更易于纯化，关于G-SCF的发酵，国内也有报道。 阳0化]中国发明专利CN98103011. 4公开了粒细胞集落刺激因子的制备的技术方案，该 技术方案利用工程菌部分蛋白酶基因被突变、外膜易破裂的特点，通过控制较低的发酵溫 度，提高了发酵产量，使分泌速度减慢，降低了蛋白被降解的机率，利用该发明得到的蛋白 经纯化后获得的蛋白纯度为99%，产品活性及稳定性达到天然G-CSF的水平。
[0006] 中国发明专利CN1313612C公开了重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，通过 该技术方案中公开的发酵方法，诱导结束后虽说表达量达50%，但仍采用42°C热诱导。
[0007] 中国发明专利CN10215489A公开了一种riiG-CSF重组工程菌的发酵培养方法，使 用大肠杆菌发酵，但是表达量均在60%W下。
[0008] 针对现有技术中采用了大肠杆菌和酵母菌进行发酵表达产生完成片段的G-CSF， 但利用大肠杆菌难W解决复性问题，且要求的技术较高，由于表达的片段是完成的G-CSF， 因此表达量可能会有所降低，在进行表达载体的转化过程中，带来一定的困难。
【发明内容】
[0009] 鉴于W上技术的缺陷，本发明提供一种表达重组G-CSF(15-75)多肤的毕赤酵母 的发酵方法，得到了一种表达量高，活性好的重组G-CSF(15-75)。
[0010] 根据G-CSF的cDNA然后用毕赤酵母偏爱密码子对所选氨基酸序列对应的 G-CSF(15-75)基因进行优化，并在其5'端加EcoRI位点和kex2酶切位点，3'端加TAA 终止密码子和NotI位点。进一步的，将优化的G-CSF(15-75)基因克隆入PPIC9K表达载 体中，制备成PPIC9K-G-CSF(15-75)表达载体，将上述重组表达载体转化到整合到毕赤酵 母GS115基因组中，保存菌种并标记为CSF(15-75)的己斯德毕赤酵母菌。
[0011] 本发明中所用的工程菌保藏号为CGMCCNO: 10713,分类命名为己斯德毕赤酵母 Pichiapastoris，并于2015年4月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 屯、保藏（CGMCC)，保藏单位地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所。
[0012] 本发明的一个目的在于提供一种重组G-CSF(15-75)多肤毕赤酵母的种子培养方 法。重组G-CSF(15-75)多肤毕赤酵母的种子培养方法为： 阳01引 ①、挑取毕赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115单菌落接种至含0. 5mg/ml G418的10mlYro培养基中，26-32°C，250巧m培养10-25小时，得到一级种子液。
[0014] ②、将一级种子液按照2 %的体积接种到200mlBMGY培养基中，26-32°C，250巧m 培养10-25小时，得到二级种子液。
[0015]所述的步骤①的培养条件优选为30°C，250rpm培养18小时；所述的步骤②的培养 条件优选为30°C，250rpm培养18小时，对比实验发现，合适的溫度及培养时间能够使毕赤 酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在30°C时，0D600为5,菌种的特性比较稳定，同时确 保了转入G-CSF(15-75)基因的稳定性。
[0016] 重组G-CSF(15-75)多肤毕赤酵母的发酵培养方法为：
[0017] (1)甘油培养：
[0018] ①、3化发酵罐中加入1化含有4%甘油的BMS培养基，12rC，30min灭菌；
[0019] ②、待培养基冷却至30°C，调整揽拌速度40化pm，通气量0. 6m/h，用pH调节剂调节 抑至 4. 5-6. 0 ;
[0020] ③、培养基中添加适量的PTM1微量元素溶液，按照初始体积6-12%的接种量接 种，开始发酵，发酵液中的溶氧量50~80 %时培养18~24小时后，溶氧量值为95 %~ 100%，细胞的湿重为160~180邑/1;
[0021] (2)甘油补料培养：
[0022] 每升甘油中含有12ml的PTM1微量元素溶液，进行甘油补料时，按重量比计算，甘 油的浓度在1~3%，细胞湿重为240~280g/L。 阳02引 做甲醇诱导：
[0024] 调整发酵罐溫度至26-32°C，开始流加甲醇，其中每升甲醇中含有12ml的PTM1微 量元素溶液，诱导55-65小时之后检测细胞湿重。 阳0巧]所述的甘油培养步骤①的BMS培养基的配方为：85%憐酸25ml/L、硫酸钢0. 4.g/ ^硫酸巧0. 48g/l、硫酸钟20. 13g/L、氨氧化钢4g/L、硫酸儀14. 9g/l、甘油45g/L。 阳0%] 对培养基进行优化，毕赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115生长状况良好。
[0027] 所述的甘油培养步骤②抑调节剂为氨氧化钢、氨水、二乙胺、S乙胺中的一种或 两种，优选为氨水，抑值优选为5.0,为了下一步的甲醇诱导做准备。
[0028] 所述的甘油培养步骤③中接种量优选为为初始体积的8% ;所述的PTM1的用量为 41. 5-43. 5mU更好的接种量W及PTM1的用量有助于发酵菌种的生长W及性状的稳定，DO值接近100%充分说明发酵罐中甘油完全消耗完毕，应该进行下一步的补料培养阶段。 W29] 所述甘油补料培养中补料时的转速为45化pm，补料速度为0-2小时流速为 24. 35ml/ (LA)，2-4 小时为 18. 55ml/OVh)，4-5 小时为 14. 25ml/OVh)，完毕之后将转速调 整为520巧m。
[0030] 补加过程中的转速适当提高，可W充分使甘油混合完全，不加完毕之后的低转速 有利于菌种对甘油的利用且不破坏菌种，采用不同流速进行加入甘油有利于避免发酵过 程中出现气泡，同时也能控制最终的甘油浓度在1~3%内，优选为1%。检测细胞湿重 240-280g/l，优选为 280g/L。 W31] 所述的甲醇诱导中的转速为52化pm-直发酵结束，流加的速度为：0-3小 时1. 0ml/化A)，3-6小时2. 0ml/化A)，6-8小时6. 35~6. 65ml/化A)，8小时至结束 9. 5-10. 8ml/化A)，甲醇诱导过程的溶氧维持在50%~80%之间，抑为4. 9