一种马克思克鲁维酵母及其培养方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体设及一种马克思克鲁维酵母化luyveromyces marxianus)及其培养方法和应用。
【背景技术】
[0002] 红茶菌，俗称"海宝"，起源于中国勸海一带，已有几百年的历史。传统红茶菌饮料 又被称为康普茶，经日本传至世界各地，并在欧美和日本兴起了研究的新潮。红茶菌是由= 种有益于人体健康的益生菌，即酵母菌、醋酸菌、乳酸菌组成的共生体系，通过自身特殊作 用，将茶叶等原料经过生物技术发酵工艺转化为极其丰富的营养物质。共生红茶菌通过代 谢产生一系列营养物质，如葡萄糖酸、醋酸、葡萄糖、果糖、蛋白质、氨基酸、维生素、微量元 素、茶多酪、咖啡因、乙醇和二氧化碳等营养物质。具有抵抗癌症抵抗屯、血疾病提高消化能 力刺激免疫系统减少发炎等功效。
[0003] 虽然红茶菌在我国有着悠久的历史，但是对它的科学研究起步较晚，目前还主要 停留在家庭自产自销。红茶菌发酵饮料，采用混菌天然发酵，不同红茶菌含有的微生物种类 和活力不同，产品中产物的成分和含量也不一致，不能从根本上保证饮品的质量和安全，而 且还会因为操作不当而导致污染、变质。另外，菌种在天然发酵过程，容易发生变异、衰退和 死亡。而且利用天然混菌发酵，发酵周期长。而要进行纯菌混合发酵，目前可供选择的酵母 菌种类有限，且效果大多不够理想。
[0004] 乳糖酶是乳制品领域的一种重要原料，针对乳糖酶缺乏或乳糖不耐受人群的乳制 品中通常需要添加乳糖酶。乳糖酶的种属来源各异，其中产乳糖酶的酵母菌主要包括脆壁 克鲁维酵母化luyveromycesfragilis)、乳酸克鲁维酵母化luyveromyceslactis)和热带 假丝酵母（Candidatropicalis)等，而现有的马克思克鲁维酵母的众多菌株都无法生产乳 糖酶。
【发明内容】
阳0化]本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的制备红茶菌发酵饮料工艺中混菌 天然发酵所带来的产品产物的成分和含量不一致、还容易造成操作污染，而纯菌混合发酵 中可供选择的酵母菌种类有限的问题，W及现有的众多马克思克鲁维酵母不生产乳糖酶的 问题，提供了一种马克思克鲁维酵母化luyveromycesmarxianus)及其培养方法和应用。使 用本发明马克思克鲁维酵母菌株制备的红茶菌蛋白饮料，避免了杂菌污染，保证了不同批 次产品的稳定性，有利于工业化生产，不仅具有酸甜相宜、清香爽口的风味。
[0006] 本发明技术方案之一：一种马克思克鲁维酵母，其保藏编号为CGMCCNo. 10060。
[0007] 本发明中，所述马克思克鲁维酵母已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo. 10060,培养物名称是抓1002,分类命名是马克思克 鲁维酉奉母Kluyveromycesmarxianus。
[0008] 本发明技术方案之二：一种培养马克思克鲁维酵母CGMCCNo.10060的方法，其包 括下述步骤：将马克思克鲁维酵母CGMCCNo.10060接种于培养基中培养。
[0009] 本发明中，所述培养可W是各种微生物的培养方式，包括液体培养、固体培养、半 固体培养等，可W是振荡培养，也可W是发酵罐深层发酵，较佳地为振荡培养。所述振荡培 养的转速可W为本领域常规的转速，较佳地为180转/分钟。
[0010] 本发明中，所述培养的溫度可W为本领域常规的溫度，较佳地为30°c。
[0011] 本发明中，所述培养的时间可W为本领域常规的时长，较佳地为18-48小时，更佳 地为24-48小时。
[0012] 本发明中，所述培养基可W为本领域培养酵母的常规的培养基，包括液体培养基 和固体培养基，较佳地为选自PDA培养基、酵母培养基、碳源同化基础培养基、氮源同化基 础培养基和MRS培养基中的一种，更佳地为酵母培养基。
[0013] 本发明技术方案之=:马克思克鲁维酵母CGMCCNo.10060在制备乳糖酶中的应 用。
[0014] 本发明技术方案之四：马克思克鲁维酵母CGMCCNo.10060在食品中的应用。
[0015] 本发明中，所述食品较佳地为红茶菌蛋白饮料。
[0016] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0017] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0018] 本发明的积极进步效果在于：本发明提供了马克思克鲁维酵母的一个新的菌株。 使用本发明马克思克鲁维酵母制备的红茶菌蛋白饮料，避免了杂菌污染，保证了不同批次 产品的稳定性，有利于工业化生产，不仅具有酸甜相宜、清香爽口的风味，还能够生产乳糖 酶，具有较强的水解乳糖的功能，为乳糖酶的制备提供了新的来源。 牛物材料保藏信息
[0020] 本发明的马克思克鲁维酵母抓1002,已于2014年11月26日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo.10060,培养物名称是抓1002,分类命名是马克思 克鲁维酉奉母Kluyveromyces marxianus。
【附图说明】
[0021] 图1 :马克思克鲁维酵母CGMCCNo.10060产生乳糖酶，与IPTG反应呈绿色。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0023] 本发明中所述的室溫是指进行试验的操作间的溫度，一般为25°C。
[0024] 本发明所用到的培养基成分如下： 阳0巧]PDA培养基：马铃馨浸粉5.Og、葡萄糖20.Og、琼脂15.Og、氯霉素0.Ig、蒸馈水1L; 阳0%] MRS培养基：蛋白腺Ig、牛肉浸膏Ig、酵母浸膏0.5g、葡萄糖2g、醋酸钢0.5g、吐 溫 80 0. 1血、巧樣酸二胺 0. 2g、M拆〇4? 7&0 0. 058g、MnS〇4 ? 4&0 0. 025g、K2HPO40. 2g、水 100血，p册.2-6. 6，115°C，杀菌 15min。
[0027] 酵母培养基：鱼腺Ig、酵母膏Ig、葡萄糖2g、水lOOmL，115°C，杀菌15min。
[0028] 本发明中所用到的菌株和主要试剂：
[0029] 干酪乳杆菌LC2W见中国专利化03129450. 2,菌株保藏号CGMCCNo. 0828 ;嗜酸乳 杆菌NCFM菌株购自杜邦公司；红茶粉购自浙江顶亨生物科技有限公司，产品编号TH-B656 ; 脱盐乳清粉购自DaviscoFoodsInternationalInc.。
[0030] 鉴定用培养基：糖发酵肉汤基础培养基、碳源同化基础培养基与氮源同化基础培 养基购买自北京陆桥技术有限责任公司。
[0031] 酵母菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。K0Dplus与K0Dplus 10X缓冲液（不含氯化儀）购自东洋纺（Toyobo)公司。
[0032] 引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR产物由上海生工生物工程有限公司 进行测序。
[0033] 实施例1抓1002菌株的分离和制备
[0034] 从购买的青海藏灵茹中W无菌方式取Img，用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的 方式将稀释液均匀涂布于PDA培养基上，3(TC培养24-48小时。选取单菌落多个，分别转 接到新的PDA培养基上，得到生长出来的菌落，观察其大小、颜色、边缘、光滑度、透明度等 特点，选择在PDA培养基上形成浅黄色、边缘整齐、光滑、表面光泽、半透明的菌落，得菌株 抓1002。
[0035] 实施例2抓1002菌株的微生物特征
[0036] 1、菌落特征：
[0037] 取菌株抓1002的单菌落，转接到PDA培养基上，于30°C恒溫培养箱中培养2地、 3化和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、光滑度、透明度等特点。结果显示，菌株 抓1002在PDA培养基上形成浅黄色、边缘整齐、光滑、表面光泽、半透明的菌落。
[0038] 2、生化特征：
[0039] 酵母菌主要W单细胞形式存在，可供考察的形态特征很有限，所W其种级水平上 可WW下生理生化特性为依据：是否具有有性生殖过程，能否形成子囊抱子，具有掷抱子或 冬抱子，W及抱子的形状、特点、数目W及能否形成真假菌丝分类到纲、目、科，W及根据菌 落形态、细胞形状、增殖方式是否形成真假菌丝，结合少数糖类发酵和硝酸盐利用等试验分 类归属。
[0040] 挑取在PDA培养基上培养24h的新鲜培养物，进行生理生化测试。生化特征如表 1所示。
[0041] 表1菌株抓1002的生化特征
[0042]
[0043] 3、生理特征
[0044] 酵母菌的生理特征中，糖的发酵和同化最为重要，可W利用硝酸盐分类到种。
[0045] 利用液体培养基试管法测马克思克鲁维酵母抓1002菌株的碳源同化及氮源同化 实验。挑取PDA平板培养的的马克斯克鲁维酵母抓1002菌株2-3环接入30ml酵母培养基 中，置于30°C下，ISOr/min振荡培养18h。无菌条件下1200化pm离屯、lOmin收集菌体。用 生理盐水0. 9% (w/v)化C1洗涂2次。
[0046] 取ISOmmX16mm的试管，每试管中加6ml的碳源同化基础培养基或者氮源同化基 础培养基，分别加入50mM的浓度碳源或氮源，高压灭菌。往上述试管中接种10iiL上述生 理盐水重悬的抓1002, 25°C培养2地，4化观察菌株的生长状况。结果见表2所示。
[0047] 表2碳源同化实验及氮源同化实验
[0048]
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