一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧还蛋白还原酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程应用领域，具体涉及包含提供来源于马克斯克鲁维酵 母的烷基过氧化物还原酶KmTPXl的基因和氨基酸序列，以及硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的基 因和氨基酸序列。同时本发明也涉及了上述两种酶在提高酿酒酵母胁迫耐受性方面的应 用。
【背景技术】
[0002] 酵母长期以来一直就是被人们广泛关注的微生物，它可以广泛应用与食品、医药、 酿酒等多种工业领域。特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，因其在最初在酿酒 工业的重要应用，一直以来都是研究最为广泛的酵母之一，无论是传统的酿酒工业，还是新 兴的生物乙醇，甚至是基因工程领域，酿酒酵母的应用研究都取得了 了巨大的进展。近年 来，一种非传统酵母，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)越来越受到人们的关 注，因为它具有耐高温条件、生长速率较快、利用底物种类广泛等诸多优势有望广泛应用于 工业生物技术领域。尽管K.marxianus研究的较晚，而且许多问题仍待于进一步的理论研究 来解决，但是随着基因组学和转录组学技术的不断完善，越来越多来源于马克斯克鲁维酵 母的新基因或者新酶被报道（Lertwattanasakul et al.Biotechnol Biofuels.2015,8:l_ 14.)，为其进一步的研究与利用奠定了基础。
[0003] 生物乙醇是目前为止研究最早、技术最为成熟的生物质能源产品，被公认为最有 可能替代化石能源的生物质能源之一。而纤维素乙醇以其广泛的原料来源是国内外燃料乙 醇研发的重点。但是，纤维素结构复杂，需要对纤维素原料进行预处理和水解将其转化成酵 母可直接利用的单糖。然而，当前高效的纤维素预处理方法(如蒸汽爆破法，酸法，碱法等） 在处理过程中都会产生多种抑制物，影响酵母菌的后续发酵过程，成为纤维素质能源工业 化生产的重要挑战（Palmqvis et al.Bioresource Technol.2000,74,25-33.)〇
[0004] 纤维素水解液中的抑制物主要包括三类:弱酸(如甲酸、乙酸等），呋喃醛类(如糠 醛，5-轻甲基糠醛等），酸类化合物（如4-水杨酸，苯酸等）（Palmqvis et al .Bioresource Technol.2000,74,25-33.)。纤维素水解液中的多种抑制物对细胞的毒害作用机理是非常 复杂的，尽管可以通过一些技术对纤维素水解液进行脱毒反应（Lee et al.J Ind Eng Chem. 2013,19,2010-2015.)，但随之导致的糖损失和成本增加使得脱毒并不是一种理想之 选。因此，探索不同的抑制物胁迫因子对细胞产生毒害的机理，从而获得一些耐受性提高的 发酵菌株将是解决纤维素乙醇瓶颈问题的关键。
[0005] 酵母细胞生长需要氧，但是过量的通气会产生对细胞有害的物质，被称为活性氧 (R0S)，包括超氧化物、过氧化物以及氢氧自由基等（Arellan〇-Plaza，et al.World J Microbiol Biotechnol .2013，29:1279-1287.)。因此，为了防御活性氧的伤害，细胞具有一 套完善的防御机制，其中主要涉及一些氧化还原的酶类。之前的一些报道表明，细胞内活性 氧的水平或者一些氧化还原酶的表达与细胞对纤维素水解液中抑制物的耐受能力有关 (Kumar，et al.PloS 〇1^，2015，10(10):60139129.)。但是，目前关于马克斯克鲁维酵母来 源的氧化还原酶的报道十分有限，关于其功能的研究更少。本发明提供了两种马克斯克鲁 维酵母来源的氧化还原酶，烷基过氧化物还原酶KmTPXl和硫氧还蛋白还原酶KmTrxR。
[0006] KmTPXl属于过氧化物还原酶(Peroxiredoxins，Prx)家族，根据序列比对发现这种 酶与酿酒酵母中的硫醇特异的抗氧化蛋白（Tsai)同源性达到90% (Wong et al.J Biol Chem.2004,279:23207-23213·)，在细胞内的含量是最大的（Tachibana et al.J Biol Chem. 2009; 284:4464-72.); KmTrxR与硫氧还蛋白KmTrx在细胞内成对出现，Trx-TrxR系统 广泛存在于酵母细胞的线粒体中，能够保护细胞免受R0S的损伤。本发明提供的这两种酶是 马克斯克鲁维酵母细胞内防御R0S的关键酶，同时也能够有效地提高对多种抑制物或胁迫 因子的耐受能力。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一是提供一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶 KmTPXl的基因和氨基酸序列。
[0008] 本发明的目的之二是提供一种来源于马克斯克鲁维酵母的硫氧还蛋白还原酶 KmTrxR的基因和氨基酸序列。
[0009] 本发明的目的之三是提供一株过表达KmTpXl基因的酿酒酵母。
[0010]本发明的目的之四是提供一株过表达KmTrxR基因的酿酒酵母。
[0011]本发明的目的之五是证明烷基过氧化物还原酶KmTPXl和硫氧还蛋白还原酶 KmTrxR能够提高酿酒酵母细胞对一种或多种抑制物或胁迫因子的耐受性，包括过氧化氢、 甲酸、乙酸、糠醛、乙醇、苯酚、愈创木酚、氯化钠等。
[0012] 本发明的技术方案：
[0013] 一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶KmTPXl，该烷基过氧化物还 原酶KmTPXl的核苷酸序列为：
[0014] 1 ATGGTTGCCC AAGTCCAAAA GCCAGCCCCA GAGTTCAAGA AGACCGCTGT
[0015] 51 CATTGACGGT GTTTTCGACG AAGTTTCCCT AGAAAAATAC AAGGGTAAGT
[0016] 101 ACGTTGTCTT GGCCTTCATT CCATTGGCCT TCACCTTCGT GTGCCCAACT
[0017] 151 GAAATCATTG CCTTCTCTGA AGCTGCCAAG AAGTTCGAAG AAATTGGTGC
[0018] 201 TCAAGTTTTG TTCGCTTCCA CTGACTCCGA ATACTCCTTG TTGGCATGGA
[0019] 251 CCAACGTTGC TAGAAAGGAC GGTGGTCTAG GTCCAGTCAA CATTCCATTG
[0020] 301 ATTGCTGACA CCAACCACTC CTTGTCCAGA GACTACGGTG TCTTGATCGA
[0021] 351 AGAAGAAGGT ATTGCCTTGA GAGGTTTGTT CTTGATCGAT CCAAAGGGTA
[0022] 401 TTGTGAGACA CATCACCATC AACGACTTGC CAGTCGGTAG AAACGTTGAA
[0023] 451 GAAGCTTTGA GATTGGTCGA AGGTTTCCAA TGGACCGACA AGAACGGTAC
[0024] 501 CGTCTTGCCA TGTAACTGGA CTCCAGGTTC CGCTACCATC AAGCCAGACG
[0025] 551 TCGAAGCTTC TAAGGAATAC TTCGCTGCCG CTAACAAGGA ATAA
[0026]该核苷酸序列中含有594个核苷酸，编码197个氨基酸。
[0027] -种来源于马克斯克鲁维酵母的硫氧还蛋白还原酶KmTrxR，该硫氧还蛋白还原酶 KmTrxR的核苷酸序列为：
[0028] 1 ATGGTTCATC ACAAGGTAAC AATTATTGGT TCCGGCCCAG CAGCCCACAC
[0029] 51 CGCCGCCATT TACTTGGCTA GAGCAGAAAT CAAGCCTACC CTATACGAAG
[0030] 101 GTTTCATGGC TAATGGTATC GCCGCCGGTG GTCAACTAAC AACCACCACT
[0031] 151 GAAATCGAAA ACTTCCCAGG TTTCCCAGAA GGTTTGACCG GTAGTGAATT
[0032] 201 GATGGATAAG ATGAAGGCTC AATCTGTCAA GTTTGGTACC GAGGTGATTA
[0033] 251 CCGAAACCGT TGCAAAGGTG GACTTGTCTA GCAAGCCATT CAAGTTCTGG
[0034] 301 ACCGAATTCA ACGAGGACCA AGAACCAGAA ACTACCGATG CCATTATCTT
[0035] 351 GGCTACCGGT GCCTCCGCTA AGCGTCTACA CTTGCCAGGT GAAGAGAAGT
[0036] 401 ACTGGCAACA GGGTATCTCC GCCTGTGCCG TTTGTGACGG TGCAGTGCCA
[0037] 451 ATCTTCAGAA ACAAGCCATT GGCTGTCATC GGTGGTGGTG ACTCTGCCTG
[0038] 501 TGAAGAAGCA CAATTTTTGA CCAAGTACGG TTCCAAGGTG TACATGCTTG
[0039] 551 TCAGAAAGGA CCACTTGCGT GCCTCTCAAA TCATGCAAAG ACGTGCTGAA
[0040] 601 CAAAACGAAA AGATCGAAAT CTTGTACAAC CACGTCACCT TGGAAGCCAA
[0041 ] 651 GGGTGACGAC AAGTACTTGA ATGCATTGAA GGTCAAGAAC GTAAAGACCA
[0042] 701 ATGAAGAATA CGACTTGCCA GTTAACGGAT TATTCTACGC CATTGGTCAC