>[0099] (5)去上清，再用1/2体积的灭菌超纯水重复清洗细胞一次。
[0100] (6)离心后去上清，留菌体，用预冷的40ml的1M山梨醇重悬细胞。
[0101] (7)4°C，3000g，离心 5min，收集细胞。
[0102] (8)重复(6)和(7)。
[0103] (9)去上清，用适量的1M山梨醇重悬细胞团。
[0104] 3.2酵母电转化
[0105] 具体步骤如下：
[0106] (1)取1.5ml EP灭菌离心管(放冰上），先将感受态细胞分装至1.5mL EP离心管中， 再加入2yL质粒，然后用手指温柔轻弹混匀，放置冰上。
[0107] (2)将80yL感受态细胞和质粒(重组质粒PRS423-TPX1和空载质粒PRS423)混合液 分别加入0.4em的电转杯中，冰浴后放置在电转仪上。
[0108] (3)在1.5kV 25yF，500Q的条件下进行电极转化。
[0109] (4)加入lml冰浴的山梨醇，用枪轻轻吹打，再温和转移至1.5ml灭菌离心管中，30 °C静置，孵育5-7h.
[0110] (5)3000g 离心 5min。
[0111] (6)将孵育后的转化子浓缩至200yL左右，涂至选择培养基。
[0112] 3.3转化子的筛选与验证
[0113] 转化后的酵母菌在缺少组氨酸的SD培养基(0.67 %酵母氮碱，2 %葡萄糖，3 %琼脂 粉和其他必须的氨基酸营养成分）中培养2~3天。挑取单菌落于液体组氨酸的SD培养基中， 培养16~18h。
[0114] 提取酵母转化子质粒(0MEGA，USA)，将其按照上述方法转化进入E.coli DH5a中进 行PCR验证，酶切验证。验证确认后的转化子即为过表达KmTPXl基因的酿酒酵母菌株。
[0115]实施例2过表达硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的酿酒酵母菌株的构建
[0116] 同样，采用Primer Premier 5.0引物设计软件，根据K.marxianus的硫氧还蛋白还 原酶KmTrxR全序列（转录组测序获得）为依据设计上游引物TrxR-F，5 ' -TCCGAGCTCCCCATGTCAAATGATGAAACG-3,和下游引物ΤΓχΚ-Κ,δ'-1'(：〇〇^〇66厶〇6厶66厶厶(：〇厶厶0：1'17厶1'1'-3'，分别在5'端引入5&(31酶切位点和3 /端引入5&(311酶 切位点。以K.cicerisporus CBS4857基因组为模板，进行PCR扩增反应。PCR的反应体系与反 应条件与实施例1中相同，获得的PCR产物共含有1472个核苷酸，其中含有497bp长的其自身 启动子和960bp编码序列。
[0117]纯化后的PCR产物与酿酒酵母多拷贝载体pRS425(图2)进行连接反应，随后转化到 E.coli DH5a中，实验方法与实施例1中完全一致。确认无误的重组质粒命名为PRS425-TrxR〇
[0118] 依旧选取S. cere vis iae 280作为KmTrxR基因的过表达宿主。按照实施例1中的方 法制备感受态细胞并进行电转化。转化后的细胞在缺少亮氨酸的SD培养基中进行筛选。将 获得的转化子经过验证确认后即为过表达KmTrxR基因的酿酒酵母菌株。
[0119] 实施例3实时定量PCR验证KmTPXl基因和KmTrxR基因的表达强度
[0120] 为了确认实施例1和2中构建的含有KmTPXl基因和KmTrxR基因的重组质粒能够在 酿酒酵母中成功进行转录，我们采用实时定量PCR的方式验证这两个基因的表达强度。
[0121] 首先，验证KmTPXl基因的表达情况。将过表达的KmTPXl酿酒酵母菌株（命名为 TPX1)和含有空载质粒PRS423的对照酵母菌株（命名为423)均在缺少组氨酸的SD培养基 (0.67 %酵母氮碱，2 %葡萄糖和其他必须的氨基酸营养成分，SD-His)中进行培养。经活化 后的两种酵母菌分别按照1%(v/v)的接种量接种至SD-His培养基中，30°C，150rpm培养至 对数生长期（16-18h)。收集细胞，用于总RNA的提取。RNA提取过程采用液氮冷冻研磨的方式 破碎酵母细胞壁，之后利用RNAsimple总RNA提取试剂盒(天根，中国）提取细胞内的总RNA， 具体操作步骤可参见说明书。获得的总RNA样品经测定浓度和纯度后用于后续的反转录和 实时定量PCR的实验操作。反转录和实时定量PCR的具体操作步骤详见TaKaRaPrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（Takara，Japan)和SYBRK Premix Ex TaqTM II试剂盒（Takara，Japan)说明书。PCR反应中所用引物为TPX1-F(5'_ CTCAAGTTTTGTTCGCTTCCAC-3 '）和ΤΡΠ-R (5 ' -AAGTCGTTGATGGTGATGTGTCT-3 '）。同时，利用 八(^111作为管家基因，引物序列为厶(：1'1-卩(5/-厶0^丁61'丁(：0^66丁厶176(：-3'）和厶(：1'1-1?(5 /-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-30。将获得的数据进行基因相对表达量分析，实验结果如图5A所 示。实验结果表明，实施例1中构建的含有KmTPXl基因的重组质粒能够在酿酒酵母内正常转 录，并且其较大的转录活性能够证实KmTPXl基因过表达过程的实现，在正常的翻译以及翻 译后修饰过程后能够实现蛋白的较高的表达量，后续将进一步验证其功能。
[0122] 同时，我们也验证了 KmTrxR基因的表达情况。同样，将过表达的KmTrxR酿酒酵母菌 株（命名为TrxR)和含有空载质粒pRS425的对照酵母菌株（命名为425)均在缺少亮氨酸 (Leucine，Leu)SD培养基(SD-Leu)中进行培养。总RNA的提取、反转录和实时定量PCR的过程 与上述完全一致。所用引物为TrxR-F( 5 ' -GCGTGCCTCTCAAATCATGC-3 '）和TrxR-R(5 ' -AACGTAGCCAGCATCGTCAA-3 '），同样以Act in为管家基因。实验结果如图5B所示，与KmTPXl基 因相似，KmTrxR基因也能够在酿酒酵母正常转录并实现较高的表达量，其功能有待于进一 步的实验进行验证。
[0123] 实施例4烷基过氧化物还原酶KmTPXl对不同胁迫因子耐受性检测
[0124] 为了验证KmTPXl的功能，将过表达的KmTPXl酿酒酵母菌株(命名为TPX1)和含有空 载质粒PRS423的对照酵母菌株(命名为423)均在缺少组氨酸(Histidine，Hi S)的SD培养基 (0.67 %酵母氮碱，2 %葡萄糖和其他必须的氨基酸营养成分，SD-His)中进行培养。经活化 后的两种酵母菌分别按照1 % (v/v)的接种量接种至含有ImM H2〇2的SD-His培养基中，30°C， 150rpm培养16-18h。将种子液0D 62Q调成一致（10左右），10倍梯度稀释，取10μ1点样于SD-His 固体检测平板。平板中事先添加不同的抑制物或者胁迫因子，包括2mM过氧化氢、0.3g/L甲 酸、1.5g/L乙酸、1. Og/L糠醛、5 %乙醇、0.23g/L苯酚、0.3g/L愈创木酚、3M氯化钠、高温(42 °C )和FAF混合物（甲酸0.2g/L，乙酸1.5g/L和糠醛0.6g/L)。通过观察菌体生长状况来表征 不同菌株对于不同抑制物或胁迫因子的耐受能力。
[0125] 实验结果如图6所示，过表达KmTPXl酿酒酵母菌株对大部分抑制物或者胁迫因子 的抗性均有不同程度的提高。在不添加任何抑制物的平板上，过表达KmTPXl酿酒酵母菌株 与对照菌的生长没有显著差别，说明KmTPX 1过表达不会影响细胞生长；在含有2mM H2〇2、 〇. 3g/L甲酸、1.5g/L乙酸或1. Og/L糠醛培养基中，不含有KmTPXl的菌株的生长受到了较为 明显的抑制作用，其在点板实验中的生长比实验菌少1~2个梯度。同样，在含有FAF的混合 抑制物的条件下，TPX1菌株的耐受性也得到了明显的提高;与我们之前的推测一致，过表达 KmTPXl能够提高菌株对于乙醇的耐受性，使其生长比对照菌提高了一个梯度;意料之外的 是，KmTPXl能够提高细胞对高浓度盐的耐受能力，使其生长提高2个梯度;此外，我们还试验 了 KmTPXl对两种常见的环境污染物，苯酚和愈创木酚的耐受能力。尽管KmTPXl对愈创木酚 的耐受能力有一定的提高，但对于苯酚而言的效果不是十分明显。因此，KmTPXl对这两种污 染物的效应还有待于进一步的验证;但是，KmTPXl对提高酿酒酵母的耐高温能力没有作用。 [0 126] 实施例5硫氧还蛋白还原酶KmTrxR对不同胁迫因子耐受性检测 [0? Z7]同样，为了验证KmTrxR的功能，将过表达的KmTrxR酿酒酵母菌株(命名为TrxR)和 含有空载质粒PRS425的对照酵母菌株(命名为425)均在缺少亮氨酸(Leu Cine，Leu)SD培养 基(SD-Leu)中进行培养。实验方法与2.2.1中相同，添加的抑制物为3111]\1过氧化氢、0.48/1甲 酸、3g/L乙酸、l.Og/L糠醛、5%乙醇、0.88/1苯酚、0.88/1愈创木酚、31氯化钠、高温(42°〇 和FAF混合物（甲酸0.3g/L，乙酸1.2g/L和糠醛0.5g/L)。通过观察菌体生长状况来表征不同 菌株对于不同抑制物或胁迫因子的耐受能力。
[0128]实验结果如图7所示，出发菌株425在SD-Leu培养基中对大部分抑制物或者胁迫因 子的抗性高于在SD-His培养基中。过表达KmTrxR酿酒酵母菌株对某些抑制物或者胁迫因子 也得到了较为明显的提高。在不添加任何抑制物的平板上，过表达KmTrxR酿酒酵母菌株与 对照菌的生长没有显著差别，说明的KmTrxR过表达同样不会影响细胞生长;过表达KmTrxR 能够提高细胞对H2〇2、甲酸和乙酸的耐受能力，使其生长提高1~2个梯度。但是，在含有 1. 〇g/L的糠醛和FAF的混合抑制物的条件下，TrxR菌株的生长与对照菌没有显著差别，说明 过表达KmTrxR对糠醛和混合抑制物耐受性的提高无关；而且，过表达KmTrxR