专利名称：一种利用鹰嘴豆胞克鲁维酵母表达系统大规模制备外源蛋白的发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传工程和发酵工程领域，具体涉及一种鹰嘴豆胞克鲁维酵母菌株Y179U及其重组蛋白表达系统，以及利用该表达系统高效制备外源蛋白的方法。
背景技术：
随着生物技术工业的发展，异源蛋白的表达引起了广泛的重视，其中涉及到医药、轻工、食品、饲料等行业，至今已建立了多种基因工程表达系统，如大肠杆菌表达系统、枯草杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统等。在真核表达系统中应用的最多的就是酵母表达系统，因为酵母表达系统相比于原核表达系统以及哺乳动物等真核表达系统有其自身的优势，与哺乳动物表达系统相比酵母细胞便于培养，细胞繁殖快，生长周期短，基因操作简单，与原核表达系统相比酵母表达系统可以实现分泌表达，能对基因产物进行翻译后加工，得到正确折叠构象且有活性的蛋白。近年来，除了以酿酒酵母为代表的酵母表达系统应用较为广泛外，几种非常规酵母表达系统的研究也在进一步开展，特别是甲醇酵母表达系统、产脘假丝酵母表达系统，克鲁维酵母表达系统等。已经商业化的毕赤酵母表达系统，利用醇氧化酶基因及其启动子建立了一套有效的基因表达系统，并已用于多种外源蛋白的表达(Sreekrishna， K. et al. :J Basic Microbiol. ， 28 :265-278， 1988.Ellis， S.B.et al. :Mol. Cell Biol. ， 5 :1111—1121， 1985. Tschopp， J. et al. :NucleicAcids Res. ，15 :3859-3876， 1987.)。鹰嘴豆胞克鲁维酵母中利用其自身菊粉酶的启动子和终止子以及鹰嘴豆胞克鲁维酵母营养缺陷型菌株Y179U建立的一套新型的表达系统，并已用于表达外源蛋白，如菊粉酶、人a2a干扰素、人a2b干扰素等(Cai XP et al.:Appl Microbiol Biotechnol. ，67 (3) :364-369，2005. Zhang J et al. :ApplMicrobiolBiotechnol. ，62(4) :387-391，2003.)。 近年来，发酵工艺在酿酒业、食茄加工业，医药行业等领域得到了广泛的应用。在生物技术领域，为了尽可能地提高单位时间单位体积内的目的蛋白的产出量，不断地对发酵工艺进行优化，已针对不同的表达系统建立了不同的发酵生产工艺。但是对于鹰嘴豆胞克鲁维酵母这一新型酵母表达系统的发酵工艺，特别是在发酵罐中利用该系统高效制备外源蛋白的发酵工艺至今未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是建立一套利用一种新型的鹰嘴豆胞克鲁维酵母表达系统高效制备外源蛋白的发酵工艺。 本发明提供了一种利用鹰嘴豆胞克鲁维酵母表达系统大规模制备外源蛋白的发酵工艺，鹰嘴豆胞克鲁维酵母表达系统的宿主菌(Y179U)保藏号为CCTCCNo.M202031，将含有外源蛋白编码序列的鹰嘴豆胞克鲁维酵母基因工程菌株制备成种子液，转接发酵罐中，28-32t:条件下发酵2-6天，然后去除菌体即得；发酵液初始菌浓度0D值为0. 4-0. 6 ;在发酵过程中维持葡萄糖浓度为0. 5-1%，质量体积比；在发酵过程的12h-18h连续补加12% (质量体积比)酵母粉，补加酵母粉的总量为发酵体积的3-5%，质量体积比；发酵过程中发 酵液pH值为5. 0-5.5。 本发明中，所述的外源蛋白是指生物酶，多肽，细胞因子或者表面抗原。 所述的含有外源蛋白编码序列的鹰嘴豆胞克鲁维酵母基因工程菌株，是利用基因
工程方法，将外源蛋白的基因序列克隆至可用于鹰嘴豆胞克鲁维酵母表达系统的表达载体
中，并转入鹰嘴豆胞克鲁维酵母而得到的基因工程重组菌株。用于鹰嘴豆胞克鲁维酵母表
达系统的表达载体可以采用P區DS。 本发明的一个实施例中，将genbank登录号为AY534912的碱性甘露聚糖酶基因编 码序列中499位一 1392位序列克隆到p區DS载体，形成p區DS-MAN330 ;(重组载体示意图 参见图7)再将重组表达载体p區DS-MAN330电转化鹰嘴豆胞克鲁维酵母Y179U(CCTCC No : M202031)，从而构建获得组成型分泌表达的碱性甘露聚糖酶的鹰嘴豆胞克鲁维酵母基因工 程菌株。 本发明中，所述的种子液制备，是将含有外源蛋白编码序列的鹰嘴豆胞克鲁维酵 母基因工程菌株在28-32t:条件下培养12-24小时制备成种子液。种子液的制备可以在摇 瓶中，也可以在发酵罐中。 本发明中，可以在发酵液初始成分中加入0.53%的酵母粉和1_3%的葡萄糖，质 量体积百分比。 本发明中，发酵液初始成分可以含有氯化钾0.1-0.4%，质量体积百分比。
本发明中，发酵液初始成分可以含有氯化钙0. 02-0. 05%，质量体积百分比。
本发明中，发酵液初始成分可以含有硫酸镁0. 2-0. 4% ，质量体积百分比。
本发明中，发酵液初始成分可以含有硫酸钾0. 2-0. 3%，质量体积百分比。
本发明中，发酵液初始成分可以含有维生素8^*10—5_5*10—%，质量体积百分比。
本发明中，发酵液初始成分可以含有磷酸氢二钾0. 10. 3%，质量体积百分比。
本发明的发酵工艺中，大规模制备是指发酵液体积大，可以满足工业化应用的要 求，发酵液体积可以是几十升，几十吨，甚至百吨。 本发明的发酵工艺中，ODe。。表示菌体浓度，是在分光光度计(UNIC 7200，上海仪器
有限公司)600nm处测定获得的光密度(Optical Density)来表示。 本发明的发酵工艺中，测pH值可以采用pH值试纸、pH计等常规方法。 本发明提供的发酵工艺可以适用于含有各种外源基因的鹰嘴豆胞克鲁维酵母基
因工程菌，发酵制备外源蛋白，这些外源蛋白包括生物酶，多肽，细胞因子，重组抗原等。 本发明利用新型鹰嘴豆胞克鲁维酵母表达系统，首次建立了一种大规模制备外源
蛋白的发酵工艺。用本发明的发酵工艺可以制备的外源蛋白包括生物酶，蛋白等。用本发明
的发酵工艺可以制备的外源蛋白在发酵液上清中，去除发酵液中的菌体即得发酵液上清。
与实验室制备或者摇瓶发酵方法相比，本发明的发酵工艺制备的外源蛋白数量大。与其他
基因工程酵母系统制备外源蛋白相比，本发明的发酵工艺制备外源蛋白产量高，发酵周期
短，发酵成本低，工艺简单，适用于大规模工业化的需求。
图1在大摇瓶中建立鹰嘴豆胞克鲁维酵母基因工程菌株发酵的基本条件。图中显
示的是鹰嘴豆胞克鲁维酵母基因工程菌株在2_4%国产酵母抽提物和1_3%葡萄糖基本培
养基中的菌体湿重以及发酵液上清中的酶活性随培养时间的变化。 图2发酵罐制备外源蛋白过程中的pH值变化 图3发酵罐制备外源蛋白过程中的菌体湿重变化。 图4发酵罐制备外源蛋白过程中的溶氧变化。 图5发酵罐制备外源蛋白过程中的发酵产物酶活变化。 图6发酵罐制备外源蛋白SDS-PAGE电泳图。 图7含有外源基因的p區DS重组载体结构示意图。
具体实施例方式实施例1 :种子液的培养 将生长在SD平板(0. 5-1. 0% YNB， 1_3%葡萄糖，1. 5-2. 5%琼脂糖，质量体积比)上的含有外源基因的鹰嘴豆胞克鲁维酵母基因工程菌接种一环到200mlSD液体培养基(0. 67% YNB，2X葡萄糖，质量体积比)中，28。C -32。C振荡培养12-24hrs，待菌液浓度达到0D6。。 = 3-6，即为种子液。 实施例2 :摇瓶放大发酵实验建立发酵罐发酵的基本条件 在500-1000ml的摇瓶中进行放大发酵实验，培养基体积30_100ml，以确定发酵罐发酵基本条件。选择八种不同的培养基，分别为l号(酵母粉2-4%，葡萄糖1-3%)、2号(国产酵母抽提物2-4%，葡萄糖1-3% )、3号(玉米桨8-12%，葡萄糖1-3% )、4号(糖蜜8-12%)、5号(玉米浆1_3%，葡萄糖2-4%)、6号(糖蜜1-3% ) 、7号(国产酵母抽提物1_3%，葡萄糖2-4%，氯化钠0. 1-0. 2% )以及8号(国产酵母抽提物3-5%，葡萄糖6_9%;氯化钠0. 1-0. 2% )。将种子培养液分别接种上述八种不同的发酵培养基中，发酵液初始菌浓度为0D6。。 = 0. 4-0. 6 ;发酵液pH值为5. 0-5. 5， 28°C -32t:振荡培养2-6天，摇床转速200-240rpm。发酵培养液离心，沉淀进行菌体湿重的测定，发酵液上清进行表达蛋白的活性分析检测。 以含有碱性甘露聚糖酶突变体基因的鹰嘴豆胞克鲁维酵母基因工程菌发酵制备碱性甘露聚糖酶作为一个例子，结果表明酵母基因工程菌在2号培养基中发酵108小时碱性甘露聚糖酶的活性达到最高值，为1978. 5U/ml，此时的菌体湿重为7. 5%。工程菌在2号培养基发酵过程中菌体湿重的变化以及发酵上清酶活的变化见图1。 碱性甘露聚糖酶活性的检测方法是将发酵液上清液用Gly-NaOH缓冲液(pH9. 5)稀释一定倍数，取100 iU稀释液，加入900 ii 1底物(0. 5%槐豆胶-缓冲液)，混匀样品和底物，70。C水浴反应10min，立即取出，置于冰上。略为冷却(约需5min)后，各管加入lmlDNS试剂，混匀，沸水浴中10min，冷水冷却。酶标仪下测0D570nm，最后根据甘露糖标准曲线计算碱性甘露聚糖酶酶活。 碱性甘露聚糖酶活性单位定义为每分钟水解产生1微摩尔甘露糖所需要的酶量定义为一个单位(U)。 实施例3 :15L发酵罐制备外源蛋白发酵工艺的建立
将种子液接种到15L发酵罐中，发酵液初始菌浓可以是0D6。。 = 0. 4。发酵液初始 培养基成分为酵母粉1 % ，葡萄糖2 % ，硫酸镁0.3%，硫酸钾0.2%，磷酸氢二钾0.1%，氯化 钾O. 1X，氯化钙0.03^和维生素B^W0—5%，质量体积百分比。在ll(TC下灭菌10min。发 酵温度为2『C。发酵过程中用12X氨水和2M盐酸溶液调节pH值5.2左右，发酵过程中使 用pH值5. 0-5. 5的消泡剂控制泡沫。发酵过程中当菌体处于对数生长期时，即在发酵过程 的12h-30h连续补80%葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为0. 5-1%;在菌体处于对数生长初期 时，即在发酵过程的12h-18h连续补加12X酵母粉，补加酵母粉的总量为发酵体积的3-5X (质量体积比)。发酵过程中间隔6小时取样一次，发酵液离心，沉淀进行菌体湿重的测定， 发酵液上清进行蛋白活性分析以及SDS-PAGE电泳检测。 以含有碱性甘露聚糖酶突变体基因的鹰嘴豆胞克鲁维酵母基因工程菌发酵制备 碱性甘露聚糖酶作为一个例子，发酵过程中的PH值变化见图2 ;菌体湿重变化见图3 ;溶氧
变化见图4 ;发酵制备的碱性甘露聚糖酶活性变化见图5(各数值均为平行三罐的平均值)；
发酵液上清SDS-PAGE电泳图见图6。 结果表明，用该发酵工艺制备碱性甘露聚糖酶，在发酵72h时，发酵液菌体浓度以 及发酵液上清酶活均达到最高，发酵液菌体浓度0D6。。为24. 58，菌体湿重为17. 82%，发酵 液上清酶活达3795U/ml。 实施例4 :3L发酵罐制备外源蛋白发酵工艺的建立 将种子液接种到3L发酵罐中，发酵液初始菌浓是0D6。。 = 0. 6。发酵液初始培养基 成分为酵母粉3.0%，葡萄糖3 % ，硫酸镁0.4%，硫酸钾0.3%，磷酸氢二钾0.3%，氯化钾 0.4X，氯化钙0.04X和维生素BJW0—5%，质量体积百分比。在ll(TC下灭菌10min。发酵 温度控制在28-3(TC 。发酵过程中用12X氨水和2M盐酸溶液调节pH值5. 5左右，发酵过 程中使用pH值5. 5的消泡剂控制泡沫。其余同实施例3。 结果表明，在发酵约70h时，发酵液菌体浓度以及发酵液上清酶活均达到最高，三 次重复实验发酵液上清酶活均达三千U/ml以上。
权利要求
一种利用鹰嘴豆胞克鲁维酵母表达系统大规模制备外源蛋白的发酵工艺，鹰嘴豆胞克鲁维酵母表达系统的宿主菌保藏号为CCTCC No.M202031，其特征是，将含有外源蛋白编码序列的鹰嘴豆胞克鲁维酵母基因工程菌株制备成种子液，转接发酵罐中，28-32℃条件下发酵2-6天，然后去除菌体即得；发酵液初始菌浓度OD值为0.4-0.6；在发酵过程中维持葡萄糖浓度为0.5-1％，质量体积比；在发酵过程的12h-18h连续补加12％酵母粉，补加酵母粉的总量为发酵体积的3-5％，质量体积比；发酵过程中发酵液pH值为5.0-5.5。
2. 如权利要求1所述的发酵工艺，其特征是，所述的外源蛋白是指生物酶，多肽，细胞 因子或者表面抗原。
3. 如权利要求1所述的发酵工艺，其特征是，所述的菌株活化是将含有外源蛋白编码 序列的鹰嘴豆胞克鲁维酵母基因工程菌株在28-32t:条件下培养12-24小时制备成种子 液。
4. 如权利要求1所述的发酵工艺，其特征是，在发酵液初始成分中加入1_4%的酵母粉 和1_3%的葡萄糖，质量体积百分比。
5. 如权利要求1所述的发酵工艺，其特征是，发酵液初始成分含有氯化钾0. 1-0. 4%， 质量体积百分比。
6. 如权利要求1所述的发酵工艺，其特征是，发酵液初始成分含有氯化钙 0. 02-0. 05%，质量体积百分比。
7. 如权利要求1所述的发酵工艺，其特征是，发酵液初始成分含有硫酸镁0. 2-0. 4%， 质量体积百分比。
8. 如权利要求1所述的发酵工艺，其特征是，发酵液初始成分含有硫酸钾0. 2-0. 3%， 质量体积百分比。
9. 如权利要求1所述的发酵工艺，其特征是，发酵液初始成分含有维生素 B^氺10—5*10—5%，质量体积百分比。
10. 如权利要求l所述的发酵工艺，其特征是，发酵液初始成分含有磷酸氢二钾 0. 1-0. 3%，质量体积百分比。
全文摘要
本发明属于遗传工程和发酵工程领域，是利用含有外源蛋白编码序列的鹰嘴豆孢克鲁维酵母基因工程菌高效制备外源蛋白的发酵工艺。发酵时，取上述基因工程菌株发酵2-6天，然后去除菌体，即得；发酵液初始菌浓度OD值为0.4-0.6，在发酵过程中维持葡萄糖浓度为0.5-1％；在发酵过程的12h-18h连续补加12％酵母粉，补加酵母粉的总量为发酵体积的3-5％(质量体积比)；发酵过程中调节发酵液pH值为5.0-5.5。用本发明方法可以大规模制备外源蛋白，蛋白活性高，发酵产量高，发酵周期短，发酵成本低，适用于推广至大规模工业化生产。
文档编号C12P21/02GK101781670SQ20091004539
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月15日 优先权日2009年1月15日
发明者乐科易, 吕红, 潘贤, 袁汉英 申请人:复旦大学