酵母β-葡聚糖的制备方法
【专利摘要】本发明公开一种酵母β?葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：(1)将5?15重量份的酿酒酵母加入30?90重量份的酶液中，调节pH至5?10，在45?65℃水浴下诱导自溶10?30小时，然后在90?100℃水浴下灭酶活5?15分钟，得到酶解液；(2)将酶解液离心，水洗2?4次，得到沉淀物；(3)将沉淀物加入到10?30重量份的酸液中，在65?125℃下酸解1?5小时，离心，水洗1?3次，得到酸解物；(4)将酸解物用乙醇洗涤1?3次，过滤，烘干，即得。本发明提供的酵母β?葡聚糖制备方法，与现有技术相比，本发明最终得到的产品纯度高。本发明可实现工业副产物废啤酒酵母的综合利用，增加工业副产物的利用率和附加价值，具有重大的经济效益和环保意义。
【专利说明】
酵母e-葡聚糖的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及营养食品领域，具体设及一种酵母0-葡聚糖的制备方法。
【背景技术】
[0002] 0-葡聚糖是一类广泛存在于细菌、真菌、藻类和植物体内的多糖，它的主要来源之 一即为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisisae)。
[0003] 酵母细胞壁从内向外分为=层，分别为葡聚糖层、蛋白层和甘露聚糖层。酵母的细 胞壁占酵母细胞干重的25-30 %，其中0-葡聚糖占50-60 %、甘露聚糖占31 %左右，除此之外 还有11-13%左右的蛋白质、9%的脂类和1-2%的几下质。其中，0-葡聚糖和几下质主要作 用是维持细胞壁结构的稳定性，从而保持细胞正常的生理形态。甘露聚糖的主要作用是特 异性地识别外来的物质，从而达到维持细胞的免疫功能。
[0004] 葡聚糖构成了细胞壁的基质，是酵母细胞壁最为重要的结构成分之一。根据0-葡 聚糖的不同提取方法，可W分为碱溶性葡聚糖、碱不溶酸溶葡聚糖和碱不溶酸不溶葡聚糖 S种。根据葡聚糖的连接方式，又可W分为0-1，3-葡聚糖和0-1，6-葡聚糖。0-1，3-葡聚糖具 有良好的生物活性，运主要由它的连接方式、分子大小和构象来决定。高分子的e-1,3-葡聚 糖具有独特的分子结构，会形成=股螺旋的构象，正是运种=股螺旋的结构，0-1,3-葡聚糖 才具有免疫调节等活性。研究表明，分子量大于90kDa的分子才能形成S重螺旋的有序结 构，有利于分子与受体发生作用，才具有生物效应。酵母细胞壁中85%的葡聚糖是由0-1，3 糖巧键连接，同时含有3 %的0-1，6糖巧键，聚合度和分子量都相当高，具有很强的免疫活 性。
[0005] 酿酒酵母0-葡聚糖的制备方法主要分为酸法、碱法、酸碱法、超声波法和结合法 等。
[0006] 本发明提供了一种酵母0-葡聚糖的制备方法，对于酵母的综合利用有重要意义。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种酵母0- 葡聚糖的制备方法。
[000引本发明目的是通过如下技术方案实现的：
[0009] -种酵母0-葡聚糖的制备方法，包括W下步骤：
[0010] (1)将5-15重量份的酿酒酵母加入30-90重量份的酶液中，调节抑至5-10,在45-65 °(：水浴下诱导自溶10-30小时，然后在90-100°C水浴下灭酶活5-15分钟，得到酶解液；
[0011] (2)将酶解液离屯、，水洗2-4次，得到沉淀物；
[001^ (3)将沉淀物加入到10-30重量份的酸液中，在65-125°C下酸解1-5小时，离屯、，水 洗1-3次，得到酸解物；
[OOU] (4)将酸解物用乙醇洗涂1-3次，过滤，烘干，即得。
[0014]所述的步骤(1)中调节抑值可W采用NaOH溶液、肥1溶液等。
[0015] 优选地，所述步骤（I)中的酶液由下述质量百分比的原料组成：无花果蛋白酶1- 5%、溶菌酶1-5%、e-甘露聚糖酶1-5%、水87-97%。
[0016] 优选地，所述步骤(2)中的酸液由下述质量百分比的原料组成:乳酸0.2-2%、苹果 酸0.2-2 %、巧樣酸0.2-2 %、水94-99 %。
[0017] 优选地，所述步骤(4)中的过滤为板框过滤机过滤，采用150-200目的滤布。
[0018] 本发明提供的酵母0-葡聚糖制备方法，W酿酒酵母为原料，经酶解、酸解、过滤等 步骤后烘干制得。与现有技术相比，本发明最终得到的产品纯度高。本发明可实现工业副产 物废啤酒酵母的综合利用，增加工业副产物的利用率和附加价值，具有重大的经济效益和 环保意义。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，W下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述掲示 的技术内容加 W变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对W下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0020] 实施例中各原料介绍：
[0021] 无花果蛋白酶，CAS号:9001-33-6,采用南京蠢越源生物科技有限公司提供的酶活 为lOOU/mg的无花果蛋白酶。
[0022] 溶菌酶，CAS号：12650-88-3,采用西安浩天生物工程有限公司提供的酶活力为 lOOU/mg的溶菌酶。
[0023] 0-甘露聚糖酶，CAS号：37288-54-3,采用广州亿添元生物科技有限公司提供的酶 活为lOOU/mg的0-甘露聚糖酶。
[0024] 乳酸，CAS 号：849585-22-4。
[00巧]苹果酸，为D-苹果酸，CAS号：636-61-3。
[00%]巧樣酸，CAS 号:77-92-9。
[0027] 酿酒酵母，采用山东隆兴生物工程有限公司提供的酿酒酵母。
[0028] 实施例1
[0029] 酵母0-葡聚糖的具体制备方法，包括W下步骤：
[0030] (1)将100g的酿酒酵母加入500g的酶液中揽拌混合均匀，并用2mol/L的氨氧化钢 溶液调节pH至7.0,在55°C水浴下诱导自溶24小时，然后在95°C水浴下灭酶活10分钟，得到 酶解液；
[0031] (2)将酶解液用离屯、机5000转/分离屯、10分钟，得到沉淀物a;将沉淀物a加入到 200g蒸馈水300转/分揽拌5分钟后，用离屯、机5000转/分离屯、10分钟，得到沉淀物b;将沉淀 物b加入到200g蒸馈水300转/分揽拌5分钟后，用离屯、机5000转/分离屯、10分钟，得到沉淀物 C；
[0032] (3)将沉淀物C加入到200g的酸液中，在80°C下酸解2小时，用离屯、机5000转/分离 屯、10分钟，得到酸解物a;将酸解物a加入到200g蒸馈水300转/分揽拌5分钟后，用离屯、机 5000转/分离屯、10分钟，得到酸解物b;将酸解物b加入到200g蒸馈水300转/分揽拌5分钟后， 用离屯、机5000转/分离屯、10分钟，得到酸解物C;
[0033] (4)将酸解物C加入到100g乙醇中300转/分揽拌5分钟后，用板框过滤机采用180目 的滤布过滤，将滤渣在-30°C下冻干。得到实施例1的酵母0-葡聚糖。
[0034] 所述步骤（1)中的酶液由下述质量百分比的原料组成:无花果蛋白酶2%、溶菌酶 2%、护甘露聚糖酶2%、蒸馈水94%;将无花果蛋白酶、溶菌酶、0-甘露聚糖酶加入到蒸馈中 揽拌混合均匀即得酶液。
[0035] 所述步骤(2)中的酸液由下述质量百分比的原料组成:乳酸0.8%、苹果酸0.8%、 巧樣酸0.8%、蒸馈水97.6%;将乳酸、苹果酸、巧樣酸加入到蒸馈水中揽拌混合均匀即得酸 液。
[0036] 实施例2
[0037] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤（1)中的酶液由下述质量百分比的 原料组成:溶菌酶3%、e-甘露聚糖酶3%、蒸馈水94%。将溶菌酶、0-甘露聚糖酶加入到蒸馈 水中揽拌混合均匀即得酶液。得到实施例2的酵母0-葡聚糖。
[003引实施例3
[0039] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤（1)中的酶液由下述质量百分比的 原料组成:无花果蛋白酶3%、e-甘露聚糖酶3%、蒸馈水94%。将无花果蛋白酶、0-甘露聚糖 酶加入到蒸馈水中揽拌混合均匀即得酶液。得到实施例3的酵母0-葡聚糖。
[0040] 实施例4
[0041] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤（1)中的酶液由下述质量百分比的 原料组成:无花果蛋白酶3%、溶菌酶3%、蒸馈水94%。将无花果蛋白酶、溶菌酶加入到蒸馈 水中揽拌混合均匀即得酶液。得到实施例4的酵母0-葡聚糖。
[0042] 实施例5
[0043] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤(2)中的酸液由下述质量百分比的 原料组成:苹果酸1.2%、巧樣酸1.2%、蒸馈水97.6%。将苹果酸、巧樣酸加入到蒸馈水中揽 拌混合均匀即得酸液。得到实施例5的酵母0-葡聚糖。
[0044] 实施例6
[0045] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤(2)中的酸液由下述质量百分比的 原料组成:乳酸1.2%、巧樣酸1.2%、蒸馈水97.6%。将乳酸、巧樣酸加入到蒸馈水中揽拌混 合均匀即得酸液。得到实施例6的酵母0-葡聚糖。
[0046] 实施例7
[0047] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤(2)中的酸液由下述质量百分比的 原料组成:乳酸1.2%、苹果酸1.2%、蒸馈水97.6%。将乳酸、苹果酸加入到蒸馈水中揽拌混 合均匀即得酸液。得到实施例7的酵母0-葡聚糖。
[004引测试例1
[0049] 对实施例1-7制备的酵母0-葡聚糖的产率进行测试。
[0050] 称取IOmg样品于具塞试管中，加1.5血72% (m/m)的硫酸溶液，混匀，室溫放置化， 然后加入去离子水使硫酸的最终浓度为2mol/L，于100°C下水解地，取出冷却至室溫，调pH 至中性(6.5~7.0)，再用0.2mo 1 /L憐酸缓冲液(pH7.0)定容至100血，取2mL(空白取2mL水） 置于IOmL容量瓶中，加3血GOPGD双酶试剂，37°C反应比，加水定容至IOmL,紫外分光光度计 测定吸光值，计算样品葡聚糖含量。
[005。 产率（％ )=酵母(6-葡聚糖质量/酿酒酵母质量X 100
[0052] 具体结果见表1。
[0053] 表1:酵母0-葡聚糖产率结果表单位：％
[0化4]
[0化5]
[0056] 比较实施例1与实施例2-4,实施例1(无花果蛋白酶、溶菌酶、0-甘露聚糖酶复配） 酵母e-葡聚糖产率明显高于实施例2-4(无花果蛋白酶、溶菌酶、0-甘露聚糖酶中任意二者 复配）；比较实施例1与实施例5-7,实施例1(乳酸、苹果酸、巧樣酸复配)酵母0-葡聚糖产率 明显高于实施例5-7(乳酸、苹果酸、巧樣酸中任意二者复配）。
[0057] 测试例2
[005引将实施例1-7制备的酵母0-葡聚糖，置于25°C，相对湿度85%环境下保藏半年，采 用《GB/T 4789.2-2010食品卫生微生物学检验菌落总数测定》进行菌落总数测试。具体测试 结果见表2。
[0059]表2:菌落总数测试表cfu/g 「00601
[0061] 发明人意外的发现，比较实施例1与实施例2-4,实施例1(无花果蛋白酶、溶菌酶、 e-甘露聚糖酶复配)防腐性能明显优于实施例2-4(无花果蛋白酶、溶菌酶、0-甘露聚糖酶中 任意二者复配）；比较实施例1与实施例5-7,实施例1(乳酸、苹果酸、巧樣酸复配)防腐性能 明显优于实施例5-7(乳酸、苹果酸、巧樣酸中任意二者复配）。
[0062] 测试例3
[0063] 将实施例1-7制备的酵母0-葡聚糖进行DPra自由基清除活性测试。
[0064] DPPH法是一种快速、简便、重复性高的测定抗氧化活性的方法。称取DPPH粉末 0.0039g，用无水乙醇溶解DPPH粉末，并定容至IOOmL,配制成最终浓度为0.1 mmol/L的DPPH 乙醇溶液。将实施例1-6制备的酵母0-葡聚糖配制成相同浓度的样品，将2.Oml的样品与 2. OmL的DPPH乙醇溶液混合均匀，在25°C下避光反应化后，测定在517nm初的吸光值As ;同 时，用水和DPPH乙醇溶液反应作为对照组测定吸光值标记为Ac，用样品和不含有DPPH的无 水乙醇溶液反应作为背景组测定吸光值标记为Ax。
[00化]DPPH 自由基清除率（％ ) = IOO-(As-Ax)Ac X 100
[0066] 测试结果见表3。
[0067] 表3:DPPH自由基清除活性测试结果表单位：％
[006引
[0069]在比较实施例1与实施例2-4,实施例1(无花果蛋白酶、溶菌酶、0-甘露聚糖酶复 配)DPPH自由基清除活性明显高于实施例2-4(无花果蛋白酶、溶菌酶、0-甘露聚糖酶中任意 二者复配）；比较实施例1与实施例5-7,实施例1(乳酸、苹果酸、巧樣酸复配)DPPH自由基清 除活性明显高于实施例5-7(乳酸、苹果酸、巧樣酸中任意二者复配）。
【主权项】
1. 一种酵母β-葡聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将5-15重量份的酿酒酵母加入30-90重量份的酶液中，调节pH至5-10，在45-65°C水 浴下诱导自溶10-30小时，然后在90-100°C水浴下灭酶活5-15分钟，得到酶解液； (2) 将酶解液离心，水洗2-4次，得到沉淀物； (3) 将沉淀物加入到10-30重量份的酸液中，在65-125°C下酸解1 -5小时，离心，水洗1 -3 次，得到酸解物； (4) 将酸解物用乙醇洗涤1-3次，过滤，烘干，即得。2. 如权利要求1所述的酵母β_葡聚糖的制备方法，其特征在于:所述步骤（1)中的酶液 由下述质量百分比的原料组成:无花果蛋白酶1-5%、溶菌酶1-5%、β-甘露聚糖酶1-5%、水 87-97% 〇3. 如权利要求1或2所述的酵母β-葡聚糖的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的酸 液由下述质量百分比的原料组成：乳酸〇 . 2-2 %、苹果酸0.2-2 %、柠檬酸0.2-2 %、水94-99% 〇4. 如权利要求1或2所述的酵母β-葡聚糖的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中的过 滤为板框过滤机过滤，采用150-200目的滤布。
【文档编号】C12P19/08GK105925640SQ201610324256
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】张露引
【申请人】上海艾苛密进出口有限公司