耐重金属内生真菌Paraconiothyrium cyclothyrioides MR2-1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体设及耐重金属内生真菌Paraconiothyrium cyclothyrioidesMR2-1 及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着工业生产的快速发展，各种化工产品、农药及化肥的广泛使用，W及矿产资源 的不断开发利用，±壤重金属污染已成为我国乃至世界最主要的环境问题之一。重金属污 染具有形态多变、容易在生物体内积累、无法被生物性降解、隐蔽性强等特点，不仅会导致 ±壤退化、农作物产量和质量降低，而且可W通过直接接触、食物链危害人类的健康和生 命。因此，重金属污染问题已经引起世界各国的高度关注，解决运一问题迫在眉睫。
[0003] 内生真菌是一类普遍生活于健康植物的各种组织和器官内部且不引起宿主明显 病症的真菌，与宿主植物协同进化，二者互相进行物质、能量及基因交流，形成互利共生关 系。内生真菌的代谢物能够促进宿主植物的生长发育，增强宿主植物对逆境胁迫即生物胁 迫（食草动物、昆虫、病原菌）及非生物胁迫（高溫、干旱、高盐、重金属等）的抗性。近年 来，已有许多报道证明内生真菌不仅能够吸附污水中的重金属，而且能够促进重金属条件 下植物的生长，帮助植物抵抗重金属毒害，增强植物、特别是超富集植物修复±壤重金属的 能力。Zhang等发现从生长在铅锋矿区的东南景天（Sedum曰1化edii Hance)植物中分离 的镶抱菌（Fusarium.oxysporum)不仅能够增加宿主的根长、分支及生物量，增强宿主营养 物质吸收及叶绿素的合成，而且能够增强宿主对重金属的抵抗作用及植物提取重金属的能 力。然而，国内外一些研究者也发现了一些深色有隔内生真菌（dark S巧tate611(1〇地八6， DS巧能够促进在重金属污染±壤中宿主植物生长，减少植物的重金属富集及转移。Li等发 现将一株重金属耐受DSE(Exophiala pisci地ila)接种到玉米中，在重金属污染±壤条件 下，该菌促进了玉米的生长，限制了重金属从玉米根部向地上部分的转移。因此，利用重金 属耐受内生真菌来增强植物对重金属的抵抗作用，减少重金属进入植物进而通过食物链危 害人类健康，将是一种成本低、环境友好、效率高的途径。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是为减少重金属进入植物提供一种新选择。
[0005] 本发明提供了 一株耐重金属内生真菌Paraconiothyriumcyclothyrioides MR2-1，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中屯、CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101 ;保藏日期：2015年2月4日；保藏号： CGMCCNo. 10522。
[0006] 具体的，该菌株的真菌学特征如下：PDA培养基上菌落初期为灰绿色，逐渐加深， 老熟菌落墨绿色，边缘逐渐呈灰色，基物栋褐色；菌落干燥、疏松而柔软，中央稍有突起；气 生菌丝发达、稠密、绒状，菌丝有隔，栋褐色，直径约1.8~3.6ym。PDA上培养30天后仍然 无分生抱子或子囊抱子产生。
[0007] 具体的，该菌株的口SrDNA具有如SEQIDNo. 1所述的序列。
[0008] 本发明还提供了所述的菌株在增强植物抗性中的用途。
[0009] 本发明还提供了所述的菌株在降低重金属对植物污染中的用途。
[0010] 具体的，所述的植物为玉米。
[0011] 本发明的菌株Paraconiothyrium.cyclothyrioidesMR2-1是来源于疏花水柏枝 根部的内生真菌，属于真菌界I^ungi，子囊菌口Ascomycota，座囊菌纲Dothideomycetes，格 抱菌目Pleosporales，隔抱球壳科，Paraconiothyrium属，cyclothyrioides种。
[0012] 本发明的有益效果：本发明公开了一株可耐受重金属的菌株Paraconiothyrium cyclothyrioidesMR2-1。该菌株对重金属Cd和Hg的最小抑制浓度分别为0. 45和0. 20mg/ ml,还能有效转化k色氨酸为吗I噪乙酸。该菌株能有效提高植物抗性，特别是对重金属的 耐受性，明显降低植物（玉米幼苗）中重金属（Cd和Hg)的由地下向地上部分转移，还能有 效的提高植物的抗氧化能力和叶绿素含量。
[0013] 本发明提供的耐重金属内生真菌ParaconiothyriumcyclothyrioidesMR2-1，该 菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中屯、CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号中国科学院微生物研究所，100101 ;保藏日期：2015年3月；保藏号：CGMCCNo. 10522。
【附图说明】
[0014] 图1为P.巧clothyrioidesMR2-1在PDA培养基上的菌落形态；
[001引 图2为IAA标准曲线；
[0016] 图3为P.巧clothyrioidesMR2-1侵染玉米根部在显微镜下的形态观察：a、b表 示实验组中菌株在P.巧clothyrioidesMR2-1在玉米根部侵染情况；C表示死菌对照组中 玉米根部无被侵染情况；
[0017] 图4为P.巧clothyrioidesMR2-1与玉米幼苗在重金属胁迫下共培养两周后，玉 米地上部分及根部的重金属生物富集系数；
[0018] 图5为P.巧clothyrioidesMR2-1与玉米幼苗在重金属胁迫下共培养两周后，重 金属从根部向地上部分转移系数。
【具体实施方式】
[0019]W下实施例中所用培养基为：
[0020] PDA培养基：马铃馨200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，加蒸馈水定容至1000ml。
[0021]PDB培养液：马铃馨200g，葡萄糖20g，加蒸馈水定容至1000ml。
[0022] 使用前培养基均需要按照常规方式进行高溫高压灭菌处理（12rC、0.24MPa、 30min)。
[002引实施例1内生真菌菌株MR2-1的分离、鉴定
[0024] 峡库区耐淹植物疏花水柏枝（Myricarialaxiflora)为植物材料，将采集的 植物根部样品在水龙头下冲洗干净，剪成1cm长的根段，用75%的酒精浸泡5min，用无菌水 洗=次后在0.1%的升隶溶液中浸泡5min，无菌水洗五次。将表面消毒好的根段放入分离 平板（含125yg/ml硫酸链霉素和100yg/ml氨节青霉素的综合PDA培养基）中。平板于 28°C恒溫培养，待菌丝长出后，挑取单一菌落的菌丝转至新的平板，继续培养，在PDA培养 基上连续=次接种，确定为单菌落，没有其它真菌或者细菌共同生长，认为是获得纯培养， 命名为MR2-1。将最后一次清洗根段用水100y1涂布平板，28°C恒溫培养无菌产生，用W确 定表明消毒是有效的，所获菌株为内生真菌。获得纯的菌株MR2-1后，转接至斜面保存。
[00巧]菌株MR2-1在PDA培养基上培养30天，观察其菌落生长状况及特征，拍照，如图1 所示，并观察其显微特征。该菌株的真菌学特征如下：PDA培养基上菌落初期为灰绿色，逐 渐加深，老熟菌落墨绿色，边缘逐渐呈灰色，基物栋褐色；菌落干燥、疏松而柔软，中央稍有 突起；气生菌丝发达、稠密、绒状，菌丝有隔，栋褐色，直径约1.8~3.6ym;PDA上培养30天 后仍然无分生抱子或子囊抱子产生。
[0026] 将菌株接种到PDB培养液中，28 °C，150巧m振荡培养屯天，取菌液（含菌丝球） 于1. 5ml离屯、管中，500化pm离屯、5min收集菌体，按CTAB法提取真菌DNA，PCR扩增真菌ITS-rDNA,扩增引物为口SU5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和口S4巧'-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3'）。扩增产物经测序后与GenBank中已知序列进行比对分析，与Paraconiothyrium cyclothyrioides的；[TSrDNA序列相似性高达 99 % ,将其鉴定为Paraconiothyrium cyclothyrioides运个种。
[0029] 实施例2内生真菌菌株P.cyclothyrioidesMR2-1的重金属耐受性
[0030] 将P.巧clothyrioidesMR2-1接种到PDA培养基上，28°C恒溫培养7天进行活化。 然后用打孔器取5mm直径的菌块接种到添加不同浓度重金属的100mlPDB培养液中，28°C， 150rpm振荡培养14天，观察其是否生长及生长情况。结果见表1。MR2-1菌株能耐受重金 属Cd和Hg，最小抑制浓度（培养基中终浓度）分别为0. 45和0. 20mg/ml。
[0031] 表1不同重金属浓度下菌株的生长情况。
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