煤矸石中耐重金属青霉菌的分离鉴定及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种从矿区煤矸石中筛选出的耐重金属镉的青霉菌BJKD4(Penicillium?sp.)，该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC?NO.6620。本发明青霉菌BJKD4菌株对镉盐及多种重金属复合污染有强耐性，在煤矸石山的复垦和土壤重金属污染的生态修复中起着重要作用。
【专利说明】煤矸石中耐重金属青霉菌的分离鉴定及应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及治理重金属污染的生物修复【技术领域】，具体涉及一种耐重金属镉青霉菌的分离及其应用。
【背景技术】:
[0002]高硫煤矸石经风化淋溶作用可产生强酸性的淋溶液，导致其中的重金属被淋溶出来，这些含重金属的酸性废水沿矸石堆径流，向周边土壤和水体迁移，导致矸石山及周边土壤和水体受到严重酸化和重金属污染，如镉、铜、铅、锌等。有些金属是有机体生命活动不可缺少的元素，但过量的重金属都存在潜在的毒性效应，Berny P等报道了重金属对人类、动物、植物和微生物造成的一系列严重危害。广泛用于重金属污染修复的物理或化学等方法，存在许多缺点，费用昂贵，处理过程中向土壤中加入的试剂等又给周边环境造成二次污染，另外Wang and chen等研究表明当重金属污染物含量低于100mg/L时,这些方法都不能有效降低重金属毒性。而生物修复被认为是一种清洁、无污染且效率高的方法，越来越受到广大学者关注，其中微生物修复是主要的修复技术。
[0003]用于修复重金属污染的微生物主要是土著真菌和细菌，不同微生物种类对重金属污染的耐性也不同，通常为真菌 > 细菌 > 放线菌，又由于真菌在自然界中分布很广，对环境适应能力强，且许多具有重金属抗性和富集能力，在生物处理技术中得到广泛关注。污染土壤中的微生物往往具有较高的重金属抗性，从污染区分离筛选的土著微生物适应了当地的自然环境，所以能有效修复重金属污染。杜爱雪等从铜矿尾矿土壤中分离出一株高抗Cu2+、Zn2+和Cd2+等的青霉菌。在铜矿冶炼废水中筛选出高抗铜的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida strain S4) 能在提供营养液条件下有效去除水体中的Cu2+和Zn2+。白腐真菌对铅有较强的去除作用，其最大吸附量可达108.4mg/g，吸附率可达95%。从镉污染土壤中筛选出2株酵母菌，对Cd2+吸附率可分别达到79.85%和89.04%。尽管多种耐重金属真菌已被分离，但由于高硫煤矸石经风化淋溶作用产生含较高浓度重金属的强酸性废水，致使多数微生物无法繁衍，另外，用于治理煤矸石污染的微生物和修复菌剂未见报道。因此，在酸性矸石山中筛选耐重金属真菌，研究其重金属的耐性和富集机理，对煤矸石山重金属污染的修复具有十分重要的意义。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的是提供一种能够耐受重金属镉的菌种——青霉菌BJKD4 (Penicillium sp.)。
[0005]本发明所提供的菌株为青霉菌BJKD4菌株，该菌株于2012年09月25日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC N0.6620。
[0006]本发明所述耐重金属镉的青霉菌具有以下有益效果:耐受重金属镉的能力强，可以耐受3.2g/L镉离子浓度，且对多种重金属盐具有较强的耐性，在对生物修复由酸性煤矸石淋溶引起的重金属污染中起着重要作用。
【专利附图】
【附图说明】:
[0007]图1:BJKD4菌株在固体查氏培养基中的菌落形态
[0008]图2:显微镜下BJKD4菌株的分生孢子梗
[0009]图3:BJKD4菌株的系统进化发育分析树
[0010]图4:不同浓度CdCl2胁迫对BJKD4菌株生长的影响
[0011]图5:不同重金属对BJKD4菌株生长的影响
[0012]图6:不同浓度煤矸石浸出液对BJKD4生长的影响
【具体实施方式】
[0013]以下通过具体实施例来详细说明本发明
[0014]实施例1:本发明青霉菌的分离。
[0015]从淮南谢家集煤矿区随机取12个样点混合组成代表样，进行富集筛选。将5g矸石样加入到45mL马丁氏液体培养基中，28°C、180r/min富集培养48h，然后，取2mL富集菌液接种于含100mg/L Cd2+的新鲜培养基中培养，浑浊后取ImL富集培养液接种于含200mg/L Cd2+的液体培养基中培养，依此类推，逐级提高Cd2+浓度，在300-5000mg/L Cd2+的培养基中进行驯化培养。取0.2mL1000mg/L Cd2+的菌液涂布在5000mg/L Cd2+的固体培养基上，倒置于28°C恒温培养箱中培养120h，分离耐Cd菌株。根据菌落形态初步观察BJKD4单克隆菌株为霉菌，将其接种到500~3500mg/L Cd2+查氏培养基中驯化培养，进行菌种鉴定和耐重金属特性研究。
[0016]马丁氏培养基:葡萄糖IOg,磷酸二氢钾Ig,蛋白胨5g,硫酸镁0.5g, 1/3000孟加拉红IOOmL,加蒸馏水800mL，pH自然。121°C灭菌30min，临用前加入0.03%链霉素稀释液IOOmL,使每毫升培养基中含链霉素30 μ g。固体培养基是在此培养基中加入15~20g琼脂。
[0017]查氏培养基:硝酸钠2g，磷酸氢二钾lg，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.018，蔗糖308，琼脂18-208，去离子水10001^，？!1自然。重金属筛选培养基是在此培养基中加入不同浓度的重金属盐。
[0018]菌落形态特征:BJKD4菌株在固体查氏培养基中培养14d后(图1)，菌落为毡状，表面有渗出液，有规则的放射状褶裂，中心有脐状突起并有几道同心纹，显微镜观察到菌丝有隔膜(图2)，从气生菌丝生出单生的分生孢子梗，分生孢子梗有横隔膜，顶端生排列成帚状的间枝，分支I次或多次，分生孢子串成不分支的链状，分生孢子呈球形。
[0019]实施例2:本发明青霉菌BJKD4菌株的18S rDNA序列测定
[0020] 菌株的18S rDNA序列分析:采用CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)法提取基因组。使用扩增引物:SSU817TTA GCA TGG AAT AAT RRAATA GGA 和 SSU1536AAT GCAATG CYC TATCCC CA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA。50 μ L反应体系含有:10*PCR缓冲液5 μ L、IOmmoI/L Dntp0.25L、45pmol/ μ L 引物 0.5 μ L、2.5U/ μ L Taq 酶 0.5 μ L、DNA 模板 I μ L 和灭菌的去离子水42.25 μ L0 PCR反应条件:94°C变性lmin，50°C退火30s、72°C延伸90s、40个循环，72°C最终延伸5min。PCR反应产物2 μ L于I %的琼脂凝胶电泳。DNA序列由北京华大基因公司测定，用BLAST (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST)程序进行DNA序列比对。
[0021]BLAST比对分析表明:BJKD4的18S rDNA序列(基因序列注册号:HM439093)与青霉属(Penicilliumsp.)、正青霉属(Eupenicillium sp.)和子囊菌纲(Ascomycetesp.)的同源性均为99%，用MEGA5.0软件构建18S rDNA系统发育树(图3)。结合形态观察和分子分析，我们认为BJKD4属于青霉属(Penicilliumsp.)。
[0022]实施例3:本发明所述青霉菌耐重金属的能力测定
[0023]1、BJKD4菌株对重金属镉的耐性:将活化2天的菌株接种到含0、1、3、9、18或36mmol/LCd2+的固体查氏培养基中，28°C下培养16d，第3d时开始测量菌落直径。[0024]测试结果表明:BJKD4菌株在含0-36mmol/L Cd2+的查氏固体培养基中生长16d，其菌落直径随着培养天数的延长而增加，随着Cd2+浓度的增加而降低(图4)。在无Cd2+培养基(对照)中，菌落生长的延滞期为0-4d，对数生长期为4-15d，16d时进入稳定期；而添加重金属Cd2+(l-36mm0l/L)后，延滞期延长到第6d，然后进入对数期，14_15d时达到稳定期。与对照相比，BJKD4菌株在l-36mmol/L Cd2+平板上生长5_16d时，其菌落直径显著低于对照，而不同浓度Cd2+处理对菌落直径大小无明显影响，说明BJKD4为耐镉菌。
[0025]2、BJKD4菌株对不同重金属的耐性:菌株在液体查氏培养基中活化2d，取2 μ L菌液接种到含有单一不同浓度重金属 Cd2+(0、1、3、9、18 和 36mmol/L)、Cu2+(0,0.05,0.1、0.2、
0.3 和 0.4mmol/L) ,Ni2+ (0,0.9、1.8、2.7、3.6 和 4.5mmol/L)、Pb2+(0、1、2、4、6 和 8mmol/L)、Zn2+(0、14、28、42、56 和 70mmol/L)、或 Mn2+(0、20、40、60、80 和 IOOmmoI/L)的固体查氏培养基中，倒置于恒温培养箱中，28°C培养8d时测量菌落直径。
[0026]测试结果表明:不同重金属对BJKD4菌株生长的抑制效果不同(图5)，其菌落直径随着重金属浓度的升高逐渐减小。BJKD4菌落直径在含有0.05mmol/L Cu2+培养基中迅速下降，0.2mmol/L Cu2+时菌株不能生长；Cd2+浓度为lmmol/L时,菌落直径显著降低,之后随着 Cd 浓度(l-36mmol/L)的增加缓慢减小；随着 Ni2+(0_4.5mmol/L)、Pb2+(0-8mmol/L)和Zn2+(0-70mmol/L)浓度的升高，菌落直径直线下降，且重金属浓度相同时，Pb2+和Zn2+胁迫时菌斑直径大于Ni2+胁迫时的直径；在小于20mmol/LMn2+(低浓度)时可以促进BJKD4菌株生长，而在大于20mmol/L Mn2+(高浓度)时其直径随Mn2+浓度升高而迅速减小。在y轴最大生长速率的50%处作水平线，其与生长率曲线相交点处所对应X轴上的浓度则为EC50。比较EC50得知不同重金属对BJKD4的毒性大小依次为:Cu2+ > Ni2+ > Cd2+ > Pb2+或Zn2+ >Mn2+。
[0027]3、BJKD4菌株对复合重金属污染的耐性:根据单一重金属(Cd2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+)对菌株生长的影响，设计L25 (54)正交试验，配制不同重金属复合污染的固体培养基，接种2yL菌液，28°C培养8d，测定菌落直径。实验重复三次，用SPSS软件分析。
[0028]测试结果表明:BJKD4菌株在重金属复合污染培养基生长8d的菌落直径见表1。BJKD4菌落直径在4种重金属复合污染条件下均增加；从直观分析表中极差(R)的大小(表I)看出不同重金属对BJKD4生长影响的大小依次为:Mn2+ > Cd2+ > Zn2+ > Ni2+。从K值分析可知Cd2+和Mn2+抑制菌株生长，而Zn2+表现为低浓度促进作用，Ni2+在5水平下的K值相近。方差分析(表2)表明:Cd2+、Zn2+和Mn2+显著影响BJKD4的生长，Ni2+没有显著作用。此外，浓度为 2.2Smmol/T, Cd2+, 1 Smmol/I, Zn2+,0-2.4mmo1 /T-Ni2+ 和 80mmol/L Mn2+等复合重金属对BJKD4生长的抑制作用小于其他组合，表明BJKD4菌株可耐多种重金属复合污染。
[0029]表1正交试验BJKD4的直径及直观分析
[0030]
【权利要求】
1.一株耐重金属镉的青霉菌,其特征在于,该菌株属于青霉菌属Penicillium sp.,命名为BJKD4 ;该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号 CGMCC N0.6620。
2.如权利要求书I所述的耐重金属镉的青霉菌BJKD4，其形态和生理生化特征: a、BJKD4菌落为毡状，表面有渗出液，有规则的放射状褶裂，中心有脐状突起并有几道同心纹，在液体培养基中有菌丝也有菌丝球，培养液较透明。 b、菌丝有隔膜，从气生菌丝生出诞生的分生孢子梗，分生孢子梗有横隔膜，顶端生排列成帚状的间枝，分支I次或多次，分生孢子串成不分支的链状，分生孢子呈球形。
3.如权利要求书I所述的耐重金属镉的青霉菌BJKD4，其特征在于，所述菌株的18SrDNA序列如SEQID N0.1所示。
4.如权利要求书1-3所述的耐重金属镉的青霉菌BJKD4，能用于煤矸石山复垦和土壤重金属污染的生态 修复。
【文档编号】A62D101/43GK103923839SQ201310015361
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月16日 优先权日:2013年1月16日
【发明者】张玉秀, 柴团耀, 李霞 申请人:中国矿业大学(北京)