专利名称：一株耐重金属的多环芳烃降解菌及其在复合污染土壤修复中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境工程和微生物工程技术领域。尤其涉及一株降解多环芳烃的克雷白氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae tzyxl)及其在复合污染土壤修复中的应用。
背景技术：
多环芳烃(PAHs)是一类持久性有机污染物(POPs)。PAHs污染的源主要来自于废旧机器油、电器产品的润滑油和来自废旧金属拆解中的木材、有机高分子化合物、纸张等含碳氢化合物的物质经不完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而生成的。由于多环芳烃及其衍生物具有致癌性、致突变性和致畸性，以及急性毒性和亚致死作用，目前已引起人们的极大关注。
多环芳烃(PAHs)污染土壤修复是当前环境修复中研究的热点。生物降解是对PAHs污染土壤进行修复的重要途径之一。对于多环芳烃污染，国内外进行了大量多环芳烃降解微生物的筛选工作。到目前为止，已分离出多个具有多环芳烃降解能力的菌株，如假单胞菌属、分枝杆菌属、芽孢杆菌属等，但是未见肺炎杆菌用于多环芳烃降解中的报道。调查研究表明，许多污染土壤都呈现出重金属和多环芳烃复合污染的趋势。这两类不同性质的污染物共存时会产生一系列复杂的化学、生化及物理化学过程三方面的交互作用，致使复合条件下的污染物的环境行为与非复合污染环境中的相比更加复杂，而重金属离子对微生物菌群的生物毒性影响也不容忽视，当土壤中的重金属离子含量较高时，会破坏微生物的生理结构，使其彻底丧失分解有机物、修复土壤的功能。因此，现有技术缺乏一种可以耐受重金属环境的多环芳烃降解菌株
发明内容
本发明针对现有技术中多环芳烃降解菌不耐重金属的不足之处，提供一种降解多环芳烃菌株、该菌株在治理多环芳烃和重金属污染土壤中可以应用。为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案得以实现的一种耐重金属的多环芳烃降解菌，其特征在于，该菌株为克雷白氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae) Tzyxl,在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M2012239，具备降解多环芳烃的能力。所述菌株具有以多环芳烃为唯一碳源和能源进行生长的能力。所述菌株的16SrDNA序列如SEQ NO. I所示。所述重金属选自Cu2+、Zn2+、Pb3+中的一种或其混合物。所述耐重金属的多环芳烃降解菌在多环芳烃污染的土壤的生物修复中的应用。所述耐重金属的多环芳烃降解菌在重金属和多环芳烃复合污染土壤生物修复中的应用。利用所述耐重金属的多环芳烃降解菌进行土壤生物修复的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成选取重金属和多环芳烃污染的土壤100g，按质量百分比2. 0%加入克雷白氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae) tzyxl,与土壤混合均勻,加水使土壤含水率保持在15%，放入恒温振荡器中，控制培养温度在25°C的恒温条件下，振荡培养修复15d，即能实现对复合污染土壤的生物修复。本发明提供的克雷白氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae),命名为于tzyxl,2012年6月24日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号CCTCC NO M 2012239。tzyxl是从浙江省台州市固体废弃物拆解场某污染土壤中分离，并筛选得到。菌株可在15 35°C，pH值6. O 8. 5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏染色呈阴性，电子显微镜下观察为较粗短的杆菌，单独、成双或短链状，无芽胞和鞭毛，有荚膜和菌毛。菌株LB培养24h菌落特征为圆形，白色，以接种环挑之易拉成丝；菌落表面光滑，边缘整齐。作为优选，本发明所述菌株能以多环芳烃为唯一碳源和能源生长。 上述耐重金属多环芳烃降解菌的筛选方法，可按如下步骤依次实施(I)从固废拆解场采集距地表下5 20cm处表层土壤样品，作为菌源进行自然富集培养；所述富集培养基含有葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、MgSO4 ；(2)取(I)中所述富集培养液接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，所无机盐选择培养基含有柠檬酸钠、(NH4) 2S04、MgS04、K2HPO4, KH2PO4 ;添加多环芳烃和重金属。(多环芳烃萘、菲、突蒽、花、苯并蒽、苯并花的浓度均为150mg/L 250mg/L ;重金属Cu2+、Zn2+、Pb3+ 浓度均为 150mg/L 250mg/L,)；(3)取(2)中所述选择培养物稀释涂布于固体无机盐选择培养基上，进行分离进行分离即得到多环芳烃降解菌Tzyxl。上述多环芳烃降解菌Tzyxl可用于多环芳烃和重金属污染土壤的生物修复。本发明Tzyxl可在15 35 °C，pH值6. O 8. 5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏染色呈阴性，电子显微镜下观察为较粗短的杆菌，单独、成双或短链状，无芽胞和鞭毛，有荚膜和菌毛。菌株LB培养24h菌落特征为圆形，白色，以接种环挑之易拉成丝；菌落表面光滑，边缘整齐。tzyxl在LB (胰蛋白胨I. 0%，酵母提取物O. 5%，氯化钠I. 0%)培养24小时菌落特征为圆形，菌落直径2 3mm，白色，表面光滑，边缘整齐。tzyxl的生理生化特征，见表I。表Itzyxl的生理生化特征
鉴定项目鉴定结果
吲哚产生__:_
_ M. R实验-
~V. P实验 —+
明胶水解__+_
_尿酶实验+
酪素水解__-_
苯丙氨酸脱羧酶 ^-
精氨酸双水解酶 -_
卵磷脂酶___
KCN__+_
KNO3+~
权利要求
1.一种耐重金属的多环芳烃降解菌，其特征在于，该菌株为克雷白氏肺炎杆菌(,Klebsiella pneumoniae ) tzyxI,在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO M2012239，具备降解多环芳烃的能力。
2.根据权利要求I所述耐重金属的多环芳烃降解菌，其特征在于所述菌株具有以多环芳烃为唯一碳源和能源进行生长的能力。
3.根据权利要求I所述耐重金属的多环芳烃降解菌，其特征在于所述菌株的16SrDNA序列如SEQ NO. I所示。
4.根据权利要求I所述耐重金属的多环芳烃降解菌，其特征在于所述重金属选自Cu2+、Zn2+、Pb3+中的一种或其混合物。
5.根据权利要求I所述耐重金属的多环芳烃降解菌在多环芳烃污染的土壤的生物修复中的应用。
6.根据权利要求I所述耐重金属的多环芳烃降解菌在重金属和多环芳烃复合污染土壤生物修复中的应用。
7.利用权利要求I所述耐重金属的多环芳烃降解菌进行土壤生物修复的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成选取重金属和多环芳烃污染的土壤100g，按质量百分比2. 0%加入克雷白氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae ) tzyxl,与土壤混合均勻,加水使土壤含水率保持在15%,放入恒温振荡器中,控制培养温度在25°C的恒温条件下,振荡培养修复15d，即能实现对复合污染土壤的生物修复。
全文摘要
本发明属于环境工程和微生物工程技术领域。尤其涉及一株降解多环芳烃的克雷白氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniaetzyx1)及其在复合污染土壤修复中的应用。该菌株为克雷白氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)Tzyx1，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M2012239，具备降解多环芳烃的能力。该菌株在治理多环芳烃和重金属污染土壤中可以应用。
文档编号C12N1/20GK102943052SQ201210387958
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者奚立民, 张昕欣, 于红艳 申请人:台州职业技术学院