一株枯草芽孢杆菌的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌的应用，涉及微生物去 除重金属，降解有机磷及重金属Pb 2+-乙酰甲胺磷农药复合物的微生物修复应用。
【背景技术】
[0002] 目前，由于铅的广泛应用价值，造成铅污染来源的多样性。水、土壤、大气、甚至食 物、生活用品等等都成了铅污染的来源，严重影响人们的健康。铅作为一种毒性物质，会造 成人体机体紊乱，运动失调，并且对人体而言，铅本身是一种潜在性泌尿系统致癌物质。特 别的，对于儿童，血铅含量超标会严重影响其机体生长发育，造成严重后果。
[0003] 另一方面，乙酰甲胺磷作为国内目前最常用农药之一，对于咀嚼式与刺吸式口器 害虫、害螨作用效果明显，广泛应用于蔬菜、茶叶、烟草、果树、棉花、水稻、小麦、油菜等作 物。目前，有机磷农药残在环境中的滥用现象严重，使得有机磷的使用效率极低，很大一部 分农药残留在农作物与土壤中。乙酰甲胺磷这类有机磷农药的残留，能严重影响土壤理化 性质与土壤质量。这些农残可通过雨水冲刷造成更广泛的水污染与土壤污染，并且可通过 食物链进入人畜机体，造成神经中毒，造成诸多不利环境影响。
[0004] 然而，实际上我们土壤所面对的环境污染往往不只一种。含重金属水源的灌溉，农 药化肥的滥用，汽车尾气的排放等人为现象，都会造成环境中复合污染问题的产生。例如茶 山，除了大量乙酰甲胺磷的农残污染问题，还常被检测出铅含量严重超标。而这样两种不同 类型污染物的复合污染，对环境的深度影响引起了人们的关注。并且乙酰甲胺磷-铅复合 污染扩散后，其治理难度更是人们所担心的问题。
[0005] 目前，已有许多人进行了利用微生物去除铅离子以及利用微生物降解有机磷的报 道。Huang和liu等人（2013)发现假单胞菌sp. LKS06在最佳条件下，对铅 的吸附量为79. 9mg/g。Guo等人（2010)报道了枯草芽孢杆菌L14在铅初始浓度为10mg/L 时，具有良好去除铅效果，证明了微生物在低浓度重金属污染修复的优势。Mingqiang Tang (2011)在福建建瓯有机磷污染地分离出一株新型降解三唑磷芽孢杆菌，该菌株在三唑磷浓 度为100mg/L的培养基中，对三唑磷降解率达98. 5%。Wu等人（2005)证明了 sp. S-2含有降解甲胺磷及乙酰甲胺磷的酶。
[0006] 然而目前，国内关于不同类型复合污染物的治理研究还存在一定空白关于微生物 对于重金属-有机磷复合污染的生物修复鲜有报道。Zang SY (2014)等人进行了利用微生 物去除废水中乙酰甲胺磷-Hg2+混合物的研究。肖根林等人（2011)进行了利用光合细菌修 复铅镉及呋喃丹复合污染污土壤的研究。但是，关于乙酰甲胺磷-Pb 2+混合污染物的修复研 究尚未有关报道出现。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌的应用，具有同时有效去除乙酰甲胺磷与铅 离子的特性。
[0008] 本发明利用的微生物鉴定为芽孢杆菌FZUL-33 (你 ciWM办.FZUL-33)。该菌株已 保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址：中国北京，保藏日 期为2014年8月15日，保藏号为：CGMCC No. 9523。
[0009] 本发明所用菌株是从福建某长期有机磷农药用地的土壤中分离得到，该菌株为革 兰氏阳性细菌，边缘有褶皱不平，表面为乳白色，菌体无荚膜，周生鞭毛能够运动。该芽孢杆 菌可在pH为7. 2±0. 2的LB培养基中良好生长。将该菌株活化、发酵得到发酵培养液，通 过喷雾干燥改良工艺制备菌剂，应用于环境中的Pb2+去除，乙酰甲胺磷的降解以及Pb 2+_乙 酰甲胺磷复合物的生物修复。
[0010] 所述芽孢杆菌FZUL-33,在pH=5. 5±0. 5,温度25~30°C条件下，对Pb2+具有良好 的去除特性。
[0011] 该菌株在pH=5. 5±0. 5,温度25~30°C条件下，对乙酰甲胺磷具有良好生物降解的 特性。
[0012] 该菌株在pH=5. 5±0. 5,温度25~30°C条件下，具有同时去除乙酰甲胺磷-Pb2+混 合物的特性。
[0013] 芽孢杆菌FZUL-33对Pb2+的去除过程在2h内即可完成，反应迅速。
[0014] 芽孢杆菌FZUL-33对Pb2+具有生物矿化的作用，矿化产物为Pb5 (P04) 30H。
[0015] 乙酰甲胺磷加入体系中促进了芽孢杆菌FZUL-33对Pb2+的去除效果。
[0016] Pb2+加入体系对芽孢杆菌FZUL-33降解乙酰甲胺磷没有特别影响。
[0017] 具体步骤如下： 1、菌种复苏：芽孢杆菌FZUL-33 UsciWys办.FZUL-33)种子菌接种到LB固体培养基 上，32°C，培养48h，备用。
[0018] 2、菌种发酵：将液体发酵种子培养液按3%的接种量接种入发酵罐，32_35°C培养 36_48h，得到芽孢杆菌发酵液。
[0019] 3、将发酵液分装为100ml，发酵液通过8000rpm离心5min，弃上清留菌泥。将菌泥 用去离子水重悬，8000rpm离心5min，弃上清留菌泥。如此重复3次，得到菌泥，备用。
[0020] 4、将所述菌泥接种于100ml Pb2+铅溶度为100mg/L的水溶液中，水溶液pH调至 5. 5,在180rpm，25°C条件下反应2h。
[0021] 5、将3中所述菌泥接种于100ml 400mg/L乙酰甲胺磷水溶液中，水溶液pH调至 5. 5,180rpm，25°C反应 Id。
[0022] 6、将3中所述菌泥接种于Pb2+_乙酰甲胺磷的混合溶液中。其中，Pb 2+浓度为 100mg/L，乙酰甲胺磷浓度为400mg/L，水溶液pH调节至5. 5。以180rpm，25°C反应Id。
[0023] 7、将2中发酵液通过喷雾干燥改良工艺制成菌剂，在发酵液中按5%-10%的质 量比通过无菌操作添加碳酸钙、碳酸氢钠作为喷雾干燥保护剂，振荡使悬浮均匀，制得菌 体悬浮液，备用。将所得菌体悬浮液进行喷雾干燥得到干燥菌剂，喷雾干燥条件为：进风 温度为ll〇°C _150°C，出风温度为60°C -90°C，进样速度为5-10ml/min。碳酸钙含量为 5wt. %_12wt. %，碳酸氢钠含量为 5wt. %-10wt· %。
[0024] 我们通过含乙酰甲胺磷及含Pb2+的培养基筛选出了耐乙酰甲胺磷及耐铅的芽孢 杆菌FZUL-33,通过实验发现该芽孢杆菌具有良好降解乙酰甲胺磷及去除Pb 2+的效果。并且 本发明的特点与优势在于在能够利用芽孢杆菌FZUL-33同时高效去除乙酰甲胺磷与Pb2+。 并且利用芽孢杆菌本身耐高温、耐干燥的特点，利用喷雾干燥改良工艺制备菌剂，用于实际 应用。本发明乙酰甲胺磷含量采用高效液相色谱法测定，Pb2+含量采用分光光度法测定。反 应产物通过XR