一株克罗诺杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，特别是一株可增强农作物中残留毒死蜱降解的克罗诺杆 菌（CrawoAacter6·/λ)及其应用。
【背景技术】
[0002] 毒死蜱（chlorpyrifos)是美国陶氏益农化学公司于1965年研发出来的一种高 效、低毒、广谱、低残留及低抗药性的有机磷杀虫杀螨剂。有效成分的化学名称为〇, 〇-二乙 基-0-(3,5,6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯（0,0-(1丨61:1171-0-(3,5,6-1：1'；[(311101'0-2-pyridyl，phosphorothioate)。毒死蜱在室温及酸性介质中稳定，在碱性介质中则易分解， 难容于水，易溶于大多数有机溶剂。由于高毒有机磷农药被禁用，毒死蜱作为有效的取代产 品，在用量和使用范围上越来越大，在我国广泛应用于水稻防治稻飞虱、水稻螟虫，韭菜等 防治根蛆以及叶菜类蔬菜防治蚜虫、螨类等害虫，如目前田间通常使用48%毒死蜱乳油500 -800倍稀释液灌根防治韭菜根蛆；但是与其他有机磷农药相同，毒死蜱也存在残留和对生 态环境的潜在威胁性，在我国由于大量以及不合理的使用，使得毒死蜱在稻米及蔬菜中的 农残超标，成为发达国家设置绿色贸易壁皇的重要手段，对我国对人民健康产及农产品出 口造成重大的影响。
[0003] 由于毒死蜱在土壤、水源、大气及农作物的残留对人类及环境存在的潜在危险性， 为了减少最终农药的摄入量，保障人们的身体健康与生态环境，对毒死蜱的消解去除方式 的研究进展也在不断发展。目前已报道的消解方法大致分类可分为非生物降解和生物降 解，非生物降解包括物理方式、水解、光解，生化降解，这些方法只能清洗或去除农产品表面 的农药残留，同时还有可能造成农产品外观及品质方面的损害；而生物降解则有植物修复 降解和微生物降解，与其他方法相比，微生物降解农药残留被公认为是一种有效、安全、廉 价和无二次污染的方法，生物修复技术由于具有纯生态过程的显著优越性，在环境污染尤 其是土壤污染的治理中具有广阔的应用前景，是目前农药降解研究的重点方向。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明一株由菊科植物小飞蓬中分离得到的，可增强农作物中残 留毒死蜱降解的克罗诺杆菌株，在不影响作物生长及农产品安全的前提下，可提升韭菜对 毒死蜱的降解能力，从源头上降低毒死蜱的在农产品中的残留，本发明是这样实现的： 一株克罗诺杆菌耶.），其保藏编号为CGMCCNo. 11032 ;该克罗诺杆菌 菌株为革兰氏阴性，菌体呈杆状。
[0005] 所述保藏编号为CGMCCNo. 11032的克罗诺杆菌在增强农作物残留毒死蜱降解中 的应用。
[0006] 进一步，本发明所述应用中，是利用XFP-gy菌剂对农作物进行灌根或浸泡处理， 以接种克罗诺杆菌XFP-gy，用以增强农作物中残留毒死蜱的降解； 所述XFP-gy菌剂是这样获得的： A) 将保藏编号为CGMCCNo. 11032的克罗诺杆菌接种至LB培养基，30°C划线、挑单菌 落培养两次后，挑取单菌落于菌种活化培养基中，30°C，150-200rpm摇床振荡培养12-24h， 获得活化菌种； B) 向装有种子培养基的发酵罐接种活化菌种，接种量为种子培养基体积的1%， 25-38°C，通空气培养16-24h，得到液体种子； C) 向装有种子培养基的发酵罐接种液体种子，接种量为种子培养基体积的1%， 30-35°C，150rpm下避光培养至对数生长期，得到活菌体培养物； D) 取活菌体培养物50ml于4 °C、5000rpm下离心15min，取沉淀菌体用无菌生理盐 水冲洗3次，再用无菌生理盐水调节至菌含量为lOlfu/mL，即获得XFP-gy菌剂； LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，加水至1L，121°C灭菌20 min； 菌种活化培养基：胰蛋白胨l〇g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1L，121°C灭菌20min; 种子培养基：K2HP04 4. 8g，KH2P04 3.5g，（NH4)2S04 2g，MgCl2 0.16g，CaCl2 0.02g， Na2Mo04.2H20 0.0024g，FeCl3 0.0018g，MnCl2.2H20 0.0015g，pH=7.0,加水至lL，12rC灭菌 20min〇
[0007] 进一步，本发明所述应用，是将发芽的种子或农作物根系浸没于XFP-gy菌剂稀释 液中，浸泡24h后再进行田间移栽； 所述XFP-gy菌剂稀释液是由无菌生理盐水将XFP-gy菌剂稀释至含菌量为103-104cfu/mL后获得。
[0008] 相对于现有降解作物中农药毒死稗残留的技术，本发明获得的克罗诺杆菌可效降 解环境中毒死蜱残留，并长期定植于农作物根部，可增强农作物降解残留毒死蜱的活性，在 不影响农作物品质的前提下，高效降解农药残留，绿色无污染；该菌株对毒死蜱的降解能力 极强，培养方法简单，生长速度快，不易变异，既可以直接用于土壤和农药生产废水中毒死 蜱的降解，也可以接种水稻等作物作为内生菌用于毒死蜱的农残控制，适宜广泛推广使用。
【附图说明】
[0009] 图1为克罗诺杆菌XFP-gy菌落形貌图片； 其中，（a)为加富培养基培养，（b)为MSM培养基； 图2为克罗诺杆菌XFP-gy的16SrDNA系统发育示意图。
【具体实施方式】
[0010] 以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于更好地理解本发明的技术 方案，但不作为对本发明实施范围的限定。
[0011] 实施例中所涉及的培养基： LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠，去离子水1000mL;121°C灭菌20 min〇
[0012] 无机盐培养基（MSM) :0· 4gMgS047H20,0. 2gFeS047H20,0. 2gΚ2ΗΡ04,0· 2g (NH4)2S04,0 . 08gCaS04,去离子水 1000mL，pH7.0-7.2。，121°(：灭菌 20min; 加富培养基（固体，1L): 0.4gMgS047H20,0.2gFeS047H20,0.2gΚ2ΗΡ04,0·2g (NH4)2S04,0 . 08gCaS04，1000mg蛋白胨，1000mg牛肉膏，琼脂 20g，去离子水 1000mL，pH7. 0-7. 2,121°C灭菌20min，用于菌株的斜面保存和平板培养。
[0013] 菌种保藏培养基（固体，1L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，加水 至 1L，pH7. 0-7. 5 ;121Γ灭菌 20min。
[0014] 菌种活化培养基(液体，1L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1L，pH 7· 0-7. 5 ;121Γ灭菌 20min。
[0015] 种子培养基（液体，1L) :K2HP04 4. 8g，ΚΗ2Ρ04 3. 5g，（NH4) 2S04 2g，MgCl2 0· 16g， CaCl2 0.02g，Na2Mo04.2H20 0.0024g，FeCl3 0.0018g，MnCl2.2H20 0.0015g，pH=7.0;121°C* 菌 20min〇
[0016] 实施例1筛选菌株 1、菌株的获得 (1) 样品米集： 2013年6月，在江苏省农业科学院内废液池旁生长的菊科植物小飞蓬新鲜植株样本， 用自来水将植株表面附带灰尘泥土冲洗干净，自然风干，进行表面消毒：75%酒精浸泡3-5 min，然后用无菌水冲洗3-4次，用2. 5%似(：102漂洗2-5min，无菌水清洗5次； (2) 菌株分离筛选：分别取小飞蓬根茎叶进行组织研磨，吸取汁液均匀涂布于加富培 养基平板上，于30°C条件下避光培养2-7天。
[0017] (3)菌株富集培养：待长出菌落后，挑取单菌落进一步划线于含毒死蜱的无机盐 培养基（MSM)(毒死蜱含量50mg/L，该培养基是以毒死蜱为单一碳源)，于30°C条件下避光 培养2-7天，选取能连续5次在只含毒死蜱（50mg/L)作为唯一碳源的MSM上生长的菌株； (4)毒死蜱降解菌纯化：采用平板划线分离法纯化，挑取在最高浓度下(毒死蜱100mg/L)生长的菌落在富集培养基上划线，直到分离获得纯培养物。
[0018] 经上述方法筛选获得1株高效毒死蜱降解菌，申请人将其自命名为菌株XFP-gy， 其生理生化特征见表1 : 表1菌株XFP-gy的生理生化特性
*+代表反应呈阳性，-代表反应呈阴性。
[0019] 经检测该菌株为革兰氏阴性，杆状菌，在以毒死蜱为唯一碳源的MSM培养基上 (含毒死蜱50mg/L)，生长缓慢，48h后才可见菌落(如图1B所示)，且菌落细小稀薄，白色 半透明，透明水解带清晰可见；在加富培养基(含毒死蜱100mg/L)上生长较快，24h即可 见菌落(如图1A所示)，白色半透明，随培养时间延长，菌落渐变为黄色，部分地方呈放射状， 质地光滑粘稠。
[0020] 菌株XFP-gy的16SrDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库，登记号为：： KJ871339,其 16SrDNA系统发育如图 2 所示，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 网站上 用blast程序与已登录细菌菌株的16SrDNA基因序列进行比较，结果表明其与克罗诺杆菌 (CrtwoAacter6·/λ)相似性最高，可以达到99%以上，因此确定其为克罗诺杆菌。
[0021] 申请人于2015年7月2日将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微