一种明亮发光杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种微生物菌株及其应用，具体的说涉及一种明亮发光杆菌及其应用，旨在解决现有技术中无利用明亮发光杆菌生产褐藻胶裂解酶的报道，以及其它菌株生产褐藻胶裂解酶的产生量偏低、贮藏稳定性差，极大的限制了在工业生产中的应用的不足。该明亮发光杆菌SRU-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2013年12月29日，保藏编号：CCTCC?M2013723。该菌株可用于生产褐藻胶裂解酶，本发明利用明亮发光杆菌生产的褐藻胶裂解酶产生量高，酶液贮藏时稳定性好，极大的扩大了褐藻胶裂解酶在工业生产中的应用范围。
【专利说明】一种明亮发光杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物菌株及其应用，具体的说涉及一种明亮发光杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002]褐藻胶裂解酶(alginate lyase)专一作用于I — 4糖苷键,通过β消去机制将褐藻胶催化降解，产生含有不饱和键的糖醛酸寡糖和不饱和键的糖醛酸单体，由于尚未发现能够作用于褐藻胶的水解酶，因此，褐藻胶裂解酶是目前唯一有效的褐藻胶降解酶类，按其底物特异性将褐藻胶裂解酶分为三类，第一类能降解甘露糖醛酸(PM)，称为PM酶(EC
4.2.2.3);第二类能降解古罗糖醛酸(PG)，称为PG酶(EC 4.2.2.11);第三类为双功能酶，既能降解PM，也能降解PG。
[0003]褐藻胶裂解酶不但作为工具酶用于褐藻寡糖的制备，而且本身具有一定的药用价值。近年来研究表明:褐藻胶裂解酶可降解胞外褐藻多糖生物膜恢复病原菌对抗生素的敏感性，所以有助于抗生素杀死引起囊肿性纤维化病的粘液型铜绿假单胞菌；褐藻胶裂解酶还用于藻类原生质体的制备，对藻类生理生化特征等基础研究具有重要作用。褐藻胶寡糖是褐藻胶的降解产物，是由2~10个单糖分子通过糖苷键连接而成的聚合物，由于其相对分子质量低、溶解性能好、机体吸收利用率高、稳定性好及安全无毒的理化特性，近年来，其生物及物理活性已成为了人们关注的焦点。褐藻寡糖能刺激人内皮细胞的生长，刺激巨噬细胞分泌细胞因子，含有硫酸盐基团的褐藻胶衍生物有抑制肿瘤的活性。由此看来，褐藻胶裂解酶及褐藻寡糖可应用于食品、医药、化工等领域，尤其在新药开发、保健食品等领域展现出巨大的应用价值，因此市场急需不同性质的褐藻胶裂解酶，以便于应用。
[0004]在已知的褐藻胶裂解酶中，来源于海洋细菌的居多，如弧菌属{VibrH替假单胞菌属iPseudoalteromonas)、交替单胞菌属(AltGromoims)、鞘氨醇单胞菌属{Sphingomonas)、假单胞菌属(PsGudomorms)、不动杆菌 iAcinetobacter)、Alginovibrio^Beneckea, Halomonas，Pseudomonad, Agarivorans等；少数陆地微生物也产褐藻胶裂解酶，如肠杆菌属{En terobacter)、固氮菌属C4zo tobacter)、杆菌属(ZfeciIlus)、梭菌属{.Clostridium")^曲霉属(AspergiJJw1S)等。目前国内涉及褐藻胶裂解酶产酶菌株的专利有 AcinetobacterjuniX8 (CCTCC N0.209110), AgarivoransalbusY￥^-3i, Vibrio sp.JG07-007 (CCTCC M207068), Vibrio sp.QY101, Vibriofluvialis (CCTCC M200015),Pseudomonas sp.QDA, Tamlana 属以及一株新的嗜喊菌 N19-2 (CGMCC N0.0464)。综上所述，明亮发光杆菌在国内外均尚未有生产褐藻酸裂解酶的报道。
[0005]褐藻胶存在于海藻的细胞壁和细胞间质，在褐藻中的含量尤为丰富，泡叶藻(Ascophyllum)、公牛藻(Durvillaea)、昆布海藻(Laminaria)、巨藻(Macrocystis)、马尾藻(Sargassum)和喇卩Λ藻(Turbinaria ornata)是褐藻胶主要的商业来源。褐藻胶是最丰富的海洋生物多糖，也是世界上仅次于纤维素的最丰富的生物高分子聚合物。在此背景之下，以褐藻胶裂解酶为代表的一系列海藻多糖降解酶的研发，对于藻类生物质在诸如食品、医药、农业、能源等领域的精深化和多样化利用具有重要的推动作用，对我国海洋经济发展
具有重要意义。
[0006]目前，褐藻胶裂解酶产生量偏低、贮藏稳定性差，极大的限制了在工业生产中的应用。因此探索新型、性质稳定的褐藻胶裂解酶产生菌显得很有必要，具有极大的研究和开发价值。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种经过培养能产生褐藻胶裂解酶的明亮发光杆菌 SRU-2 {Pho tobacterium phosphoreum SRU-2)。
[0008]本发明的另一个目的在于提供一种明亮发光杆菌SRU-2 (.Pho tobac teri umphosphoreum SRU-2)的应用，即利用该明亮发光杆菌 'S^M-1iPhotobacterium phosphoreumSRU-2)生产褐藻胶裂解酶的方法。
[0009]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种明亮发光杆菌SRU-2C/%oioAaci6?ritt? phosphoreum SRU-2),来源于深海鱼体,样品经过摇瓶选择性富集和平板分离筛选后获得本发明的菌株。该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，保藏日期2013年12月29日，保藏编号CCTCC M2013723。
[0010]本发明的明亮发光杆菌 SRU-2 (.Pho tobac teri um phosphoreum SRU-2)菌株特征如下:
(I)菌落形态:经纯培养的菌株在昏暗处发出明亮的蓝绿光，胰蛋白胨酵母膏固体培养基上为2~3 _圆形、光滑湿润的乳白色菌落，边缘整齐，稍隆起，老化后表面淡棕色至红色。液体培养时试管表面不形成菌环，时间久时官底有沉淀。培养温度越低，荧光持续时间越长，但是菌体产量与温度成正比，30°C以上的环境只生长，不发光。
[0011](2)生理生化特征:如表1所示:
表1明亮发光杆菌SRU-2 (,Pho tobac teri um phosphoreum SRU-2 )的形态及生理生化
【权利要求】
1.一种明亮发光杆菌，其特征在于:该明亮发光杆菌O0AoioAacieriiffl? phosphoreum)的保藏名称为明亮发光杆菌SRU-2，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2013年12月29日，保藏编号=CCTCCM 2013723。
2.—种权利要求1所述的明亮发光杆菌的用途，其特征在于:用于生产褐藻胶裂解酶。
3.根据权利要求2所述的明亮发光杆菌的用途，其特征在于:生产褐藻胶裂解酶的具体方法如下: (1)将明亮发光杆菌SRU-2的斜面培养物接种至种子培养基中，于温度27.8^28.5°C、摇床转速18(T220 rpm条件下培养14-16 h至对数生长期，得种子液，所述种子培养基配方如下:每100 ml种子培养基中含胰蛋白胨1.8~2.2g，酵母提取物0.48、.52g，氯化钠2.8^3.2g，甘油 0.8^1.2g，pH 值自然； (2)将步骤(1)获得的种子液以2.0%的接种量转接至发酵培养基中，在温度27.8~28.5°〇、？!1值6.6~8.6、摇床转速180~220 rpm条件下培养22~26h，得发酵液，所述发酵培养基配方如下?每100ml发酵培养基含葡萄糖0.5(T0.85g，牛肉膏或蛋白胨0.18^0.22g，氯化钾或氯化钠0.48、.52g，磷酸氢二钾0.18^0.22 g，七水硫酸亚铁0.04~0.06g,七水硫酸镁 0.008~0.020 g ； (3)发酵液经高速离心获取上清液，此即褐藻胶裂解酶粗酶液。
4.根据权利要求3所述的明亮发光杆菌的用途，其特征在于:生产褐藻胶裂解酶的具体方法如下: (1)将明亮发光杆菌SRU-2的斜面培养物接种至种子培养基中，于温度28°C、摇床转速200 rpm条件下培养14-16 h至对数生长期，得种子液，所述种子培养基配方如下:每100HiL种子培养基中含胰蛋白胨2.0g、酵母提取物0.50g、NaCl 3.0g、甘油1.0g，pH值自然； (2)将步骤(1)获得的种子液以2.0%的接种量转接至发酵培养基中，在温度28°C、pH值8.6、摇床转速200 rpm条件下培养24h，得发酵液，所述发酵培养基配方如下:每IOOmL发酵培养基含葡萄糖0.85g，牛肉膏或蛋白胨0.20g，氯化钾或氯化钠0.50g，磷酸氢二钾0.20 g，七水硫酸亚铁0.05g,七水硫酸镁0.017 g ； (3)发酵液经高速离心获取上清液，即为褐藻胶裂解酶粗酶液。
5.根据权利要求3或4所述的明亮发光杆菌的用途，其特征在于:步骤(2)中，发酵体系按30mL发酵培养基配500 mL摇瓶的比例设置。
6.根据权利要求3或4所述的明亮发光杆菌的用途，其特征在于:步骤(3)中，发酵液高速离心的条件为:离心力8000 g,离心时间5~6 min。
【文档编号】C12N1/20GK103805541SQ201410026480
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】刘彩琴, 陈蔚青, 蔡成岗, 王楠, 陈虹, 金建昌 申请人:浙江树人大学