一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖动物病原菌检测领域，具体涉及一种副溶血弧菌、美人鱼发 光杆菌和蛳诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus)、美人鱼发光杆菌（Photobacterium damsel)和蛳诺卡氏菌（Nocardia seriolae)是三种常见的水产病原菌，其中副溶血弧菌 和美人鱼发光杆菌属于革兰氏阴性菌，而蛳诺卡氏菌属于革兰氏阳性菌，这三种菌在海洋 环境及水产养殖环境中广泛分布，可引起多种水产养殖动物大量死亡，造成严重的经济损 失。
[0003] 副溶血弧菌具有嗜盐性，可经粪-口途径传播。食用生鲜或未加工的海产食品，尤 其是牡蛎，非常容易患由副溶血弧菌引起的急性肠胃炎。副溶血弧菌的爆发往往集中在沿 海地区的夏季和初秋，因为这个时间段水温较高进而细菌含量更高。我们最常食用的海鲜 包括乌贼、鲭鱼、金枪鱼、沙丁鱼、蟹、虾、牡蛎和蛤蚌等都容易携带副溶血弧菌。美人鱼发光 杆菌具有嗜盐性，其重要致病因子是胞外蛋白酶类、胞外溶血素和细胞溶素等，现已从多种 鱼类、爬行动物、软体动物和甲壳动物中分离到美人鱼发光杆菌，此菌严重威胁水产养殖重 要经济品种。诺卡氏菌为属兼性细胞内病原，广泛分布在土壤、活性污泥、水、动植物和人的 组织中，以腐生为主，可引发人、牛、猫、犬等哺乳动物及多种水产养殖动物疾病，已经成为 一种引人注目的人-兽-鱼共患病病原。
[0004] 凡纳滨对虾以其肉味鲜美，适应性强、生长迅速和抗病力强等优点，成为当今世界 养殖产量最高的对虾养殖品种之一。2013年我国海水养殖虾类产量约为108万吨，其中南 美白对虾产量约为81万吨，占总产量75%。然而随着养殖密度的增加及养殖环境的恶化， 对虾病害日益严重。2014年对虾肝胰腺坏死症（AHPNS)席卷全球对虾产区，根据实验表明， 每一尾病虾会吸引57尾健康虾的蚕食，疾病1传57,致死率可达100%。研究发现AHPNS 并不是单一某种细菌造成的，而是由综合细菌引起的，并且与副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌 和诺卡氏菌有着密切的关联。目前养殖户采用混养模式来预防AHPNS病害，通过凡纳滨对 虾与不同鱼类混养的方式，利用它们在食物链中的不同作用，及时清理病虾和死虾，降低病 原传播、减少病害发生，提高养殖成功率及产量。然而这种方法并没有能从本质上去判断对 虾是否患有AHPNS疾病，采用这种方法降低病原传播的概率并不高，仍可能遗漏一些患病 的对虾在水域中而未被鱼类所清理，进而仍存在对其他健康对虾的传染性隐患，而且该方 法存在对虾和鱼交叉感染的概率，因此存在着一些不足。
[0005] PCR技术是一种通过体外酶促反应放大扩增特定的基因的技术，该技术能将微量 的DNA大幅增加，具有检测灵敏度高的特点，而多重PCR方法是PCR技术的重要分支，可检 测多种特异性基因片段。三重PCR在普通PCR的基础上，在同一反应体系中加入三对引物， 进而同时特异性扩增出三种目的基因片段，这样操作节省时间和成本。如何建立三重PCR 方法用于快速检测副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌具有重要的实际意义和应用 价值。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种副 溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的检测引物组，使其可用于三重PCR检测方法中， 用以检测样品是否感染有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌。
[0007] 本发明所要解决的技术问题还有：如何提供一种检测试剂盒和检测方法，用以直 接检测样品是否感染有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌，且具有精确度高、检测 方便的特点。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种副溶血弧菌、美人鱼发光 杆菌和蛳诺卡氏菌的检测引物组，包括引物对V.pa、引物对N. se和引物对P. da;其中，所述 引物对V. pa包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的V. pa-F和核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示的V. pa-R ;所述引物对N. se包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的N. se-F和核苷酸 序列如SEQ ID NO. 4所示的N.se-R;所述引物对P. da包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所 示的P. da-F和核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的P. da-F。
[0009] 一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的检测试剂盒，包括上述检测引 物组。
[0010] 采用上述检测试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：
[0011] 1)取待检测样品50~IOOmg并加入500~550 μ L的TE缓冲液，用玻璃匀浆器充 分勾楽后，于12000r/min离心10min ;
[0012] 2)步骤1)离心后去除沉淀，取上清备用；
[0013] 3)向步骤2)上清溶液中加入30 μ L质量浓度为10%的SDS溶液和15 μ L 20mg/ mL的蛋白酶K，并于37°C温育lh;
[0014] 4)向步骤3)温育后的溶液中加入100 μ L 5mol/L的NaCl溶液，充分混匀后再加 入 80 μ LCTAB 的 NaCl 溶液，65°C 温育 20min ;
[0015] 5)向步骤4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混 合溶液混勾，12000g/min离心4~5min ;
[0016] 6)将步骤5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0. 6~0. 8倍体积的异丙 醇，12000g/min 离心 4 ~5min ;
[0017] 7)步骤6)离心后去上清，沉淀用ImL的体积浓度为70%的乙醇洗涤后，12000g/ min离心4~5min ;
[0018] 8)步骤7)离心后去上清，沉淀常温干燥5~10min，重溶于30~50 μ L TE缓冲 液，即为样品DNA模板；
[0019] 9)样品组三重？0?反应体系包括：12.5 41^2\卩0?〇8]\^、0.8 41^引物￥.?&4、 〇· 8 μ L 引物 V. pa-R、1. 2 μ L 引物 N. se-F、1. 2 μ L 引物 N. se-R、1. 6 μ L 引物 P. da-F、1. 6 μ L 引物P. da-R、3 μ L步骤8)得到的样品DNA模板和2. 3 μ L无菌水；
[0020] 10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5yL 2XPCR DsMix、0.8yL引物 V. pa-F、0. 8 yL 引物 V. pa-R、l. 2 yL引物 Ν· se-F、l. 2 yL 引物 Ν· se-R、l. 6 yL引物 Ρ· da-F、 I. 6 μ L引物P. da-R、3 μ L阳性对照品和2. 3 μ L无菌水；
[0021] 11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/ min离心10s，置于PCR仪中，分别于94°C预变性5min，94°C变性30s、55°C退火30s、72°C延 伸lmin，35个循环，72°C延伸lOmin，进行PCR反应；
[0022] 12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比 孔；所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5 μ L与6 X Loading Bufferl μ L混合，加 入到1 %琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5 μ L 与6XLoading Buffer IyL混合，加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5yL DL2000DNA Marker加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中；以140V电压分别对所述样品孔、所述 阳性对照孔和所述参比孔进行电泳20min后，于凝胶成像系统下观察结果；若样品孔电泳 条带出现与阳性对照孔相同大小的条带，则说明待测样品中含有相对应的细菌。
[0023] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0024] 1、本发明引物组具有高特异性，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与 否，从而能够确定样品是否含有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌或蛳诺卡氏菌，能够实现对副 溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌进行检测。
[0025] 2、采用本发明检测试剂盒可以同时对三种病原菌进行检测，即进行一次实验就可 以得到三种病原菌的检测结果，并且在5个小时左右完成检测。相比传统检测方法，不仅节 约了成本和时间，也减少了劳动力的支出。
[0026] 3、本发明的副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌三重PCR检测方法，不但 使得南美白对虾养殖水体病原检测更加快速，而且可用于南美白对虾混养过程中各时期跟 踪检测中，可以对病害的爆发进行及时预警，避免病原菌传播流行，减少对虾和鱼交叉感染 的概率，降低对虾及其混养鱼类疾病爆发的风险，提高科学管理效率，具有很高的实用价 值，有利于增加养殖效益。
[0027] 4、本发明的检测操作简单，不需要使用复杂仪器，也不需要特殊试剂，只需常规 PCR仪即可，对检测人员的技术素质要求较低，只需进行简单培训即可。
[002