8] 5、本发明应用范围广泛。本发明不仅可以检测南美白对虾养殖水体中的副溶血弧 菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌，也可针对其他环境或患病动物进行快速检测。
[0029] 6、本发明检测试剂盒制备成本低廉，制备工艺简单，容易实现工业化大生产，具有 广阔的市场前景。
【附图说明】
[0030] 图1为实施例2中三重PCR扩增产物及单一 PCR扩增产物检测结果电泳图；
[0031] 图2为实施例5中养殖水体样品检测结果电泳图。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以 本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保 护范围不限于以下的实施例。
[0033] 实施例1细菌基因组DNA的提取
[0034] 分别取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌（南海水产研究所渔业生物病 害研究室自存），采用如下步骤进行DNA提取：
[0035] (1)用500-550 μ L的TE缓冲液重悬细菌；
[0036] (2)向步骤⑴重悬后的溶液中加入30 μ L质量浓度为10%的SDS溶液和15 μ L 的蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀并于37°C温育Ih ;
[0037] (3)向步骤⑵温育后的溶液中加入100 μ L 5mol/L的NaCl溶液，充分混匀后再 加入80 μ L CTAB的NaCl溶液溶液（将CTAB溶于0. 5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述 NaCl溶液的质量体积比为1:20)，于65°C温育20min ;
[0038] (4)向步骤（3)温育后的溶液中加入与步骤（3)温育后的溶液等体积的酚-氯 仿-异戊醇（酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)的混合溶液混匀，12000g/min离心 4_5min ;
[0039] (5)将步骤（4)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0· 6-0. 8倍体积的异丙 醇，12000g/min 离心 4_5min ;
[0040] (6)步骤（5)离心后去上清，沉淀用ImL的体积浓度为70 %乙醇洗涤后，12000g/ min 离心 4_5min ;
[0041] (7)步骤（6)离心后去上清，沉淀常温干燥5-10min，重溶于30-50 μ L TE缓冲液， 备用。
[0042] 实施例2副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌三重PCR检测引物组的设计 和有效性检测
[0043] 1、分别选取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的特异性基因 (GI :6714616、GI: 2988378、GI: 696553489)，采用 Primer Premier 5. 0 软件分析设计出相应 的引物对，各引物对能分别各自专一性鉴别上述细菌的特异性，引物序列如下所示：
[0046] 2、有效性检测：
[0047] (1)合成上述设计的引物组，用引物组的引物分别对实施例1提取的副溶血弧菌、 美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的DNA进行单一 PCR验证，其中单一 PCR反应体系如下：
[0048] CN 105176997 A 说明书 5/8 页
[0049] (2)同时对副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌进行三重PCR验证，采用如 下三重PCR反应体系：
[0052] (3)采用如下PCR反应程序，对上述PCR反应体系进行PCR反应：
[0053] I) 94°C预变性 5min。
[0054] 2) 94 °C 变性 30s。
[0055] 55°C退火 30s。
[0056] 72°C 延伸 lmin。
[0057] 共计35个循环。
[0058] 3) 72cC延伸 IOmin。
[0059] 上述PCR反应结束后，分别取各组PCR反应产物5yL与6XLoading Buffer I yL 混合，分别加入到质量浓度为I %的琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁添加对照组，对 照组琼脂糖凝胶点样孔中加入5 μ L DL2000DNA Marker作对照，以140V电压进行电泳，约 20min后于凝胶成像系统下观察结果。
[0060] 3、检测结果：
[0061] 检测结果如图1所示，图1中泳道M为Marker DL2000 ;泳道1为副溶血弧菌单一 PCR的扩增结果，目的扩增片段长度为464bp ;泳道2为副溶血弧菌单一 PCR的阴性对照；泳 道3为蛳诺卡氏菌单一 PCR的扩增结果，目的扩增片段长度为690bp ;泳道4为蛳诺卡氏菌 单一 PCR的阴性对照；泳道5为美人鱼发光杆菌单一 PCR的扩增结果，目的扩增片段长度为 954bp ;泳道6为美人鱼发光杆菌单一 PCR的阴性对照；泳道7为三种病原菌三重PCR的扩 增结果，从下到上依次为副溶血弧菌、蛳诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌；泳道8为三种病原菌 三重PCR的的阴性对照；从图1可以看出单一 PCR检测相应的单一条带及三重PCR检测相 应的3条单一条带，分别与副溶血弧菌、蛳诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌的扩增片段长度分 别为464、690和954bp相吻合，即说明本发明的副溶血弧菌、蛳诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌 检测用引物组可以准确、特异性地检测出副溶血弧菌、蛳诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌。
[0062] 实施例4检测试剂盒
[0063] 本实施例的检测试剂盒可用于三重PCR快速诊断样品中是否含有副溶血弧菌、蛳 诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌，该检测试剂盒由副溶血弧菌、蛳诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌 的检测用引物组、蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70 % 的乙醇、TE缓冲液、CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCR DsMix组成，其中：
[0064] (1)副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌检测用引物组：1管内装副溶血弧 菌引物V.pa-F及V.pa-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示；2管内装 美人鱼发光杆菌引物N.se-F及N.se-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4 所示；3管内装蛳诺卡氏菌引物P. da-F及P. da-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示；以上引物浓度分别为10 μ M。
[0065] (2)蛋白酶K(20mg/mL)，置于容器，1管；
[0066] (3)质量浓度为10% SDS，置于容器，1管；
[0067] (4)酚-氯仿-异戊醇混合溶液（体积比25:24:1)，置于容器，1管；
[0068] (5)异丙醇，置于容器，1管；
[0069] (6)制备体积浓度为70%乙醇，置于容器，1管；
[0070] ⑵制备 TE 缓冲液（IOmM Tris-HCl, 0· ImM EDTA，pH8· 0)，置于容器，1 管；
[0071] (8)制备CTAB的NaCl溶液（5g CTAB溶于IOOmL 0. 5M NaCl溶液中），置于容器， 1管；
[0072] (9)制备阳性对照品：提取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的基因组 DNA，等体积混合，置于容器，1管；
[0073] (10) 2 X PCR DsMix，置于容器，1 管；
[0074] (11) -块泡沫板，将上述13个小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于盒中即制 备得到本实施例的检测试剂盒。
[0075] 本实施例中各试剂管制备后均经过抽样质检，对其质量进行监控。
[0076] 实施例5利用实施例4制得的试剂盒进行检测的方法
[0077] 1、本实施例采用实施例4制备所得试剂盒，采用三重PCR对凡纳滨对虾养殖水 体样品是否含有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌进行快速检测，其具体步骤如 下：
[0078] (1)取待检测水体样品50ml于12000r/min离心10min ;
[0079] (2)步骤1)离心后去上清，加入500-550 μ L的TE缓冲液重悬沉淀，备用；
[0080] (3)向步骤⑵重悬后的溶液中加入30 μ L质量浓度为10%的SDS溶液和15 μ L 的蛋白酶K(20mg/mL)，并于37°C温育Ih ;
[0081] (4)向步骤（3)温育后的溶液中加入IOOyL 5mol/L NaCl,充分混匀后再加入 80 μ L CTAB 的 NaCl 溶液，65°C 温育 20min ;
[0082] (5)向步骤（4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇 混合溶液混匀，12000g/min离心4min ;
[0083] (6)将步骤（5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0. 6倍体积的异丙醇， 12000g/min 离心 4min ;
[0084] (7)步骤（6)离心后去上清，沉淀用ImL的体积浓度70%乙醇洗涤后，12000g/min 离心4min ;
[0085] (8)步骤（7)离心后去上清，沉淀常温干燥lOmin，重溶于30-50 μ L TE缓冲液，即 为样品DNA模板；
[0