086] (9)样品组三重PCR反应体系包括：12· 5 μ L 2XPCR DsMix、0. 8 μ L引物 V. pa-F(10 μΜ)、0· 8 yL 引物 V. pa-R(10 μΜ)、1· 2 yL 引物 N. se-F(10 μΜ)、1· 2 yL 引物 Ν· se-R(10 μΜ)、1· 6 yL 引物 Ρ· da-F 10 μΜ)、1· 6 yL 引物 Ρ· da-R(10 μΜ)、3 yL 步骤（8)得 到的样品DNA模板和2. 3 μ L无菌水；
[0087] (10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12. 5yL 2XPCR DsMix、0. 8yL引物 V. pa-F(10 μΜ)、0· 8 yL 引物 V. pa-R(10 μΜ)、1· 2 yL 引物 N. se-F(10 μΜ)、1· 2 yL 引物 Ν· se-R (10 μ Μ)、I. 6 μ L 引物 Ρ· da-F 10 μ Μ)、I. 6 μ L 引物 Ρ· da-R (10 μ Μ)、3 μ L 阳性对照品 和2. 3 μ L无菌水；
[0088] (11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/ min离心10s，置于PCR仪中，分别94°C预变性5min，（94°C变性30s、55°C退火30s、72°C延 伸lmin) 35个循环，72°C延伸lOmin，进行PCR反应；
[0089] (12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比 孔；所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5 μ L与6 X Loading Bufferl μ L混合，加 入到1 %琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5 μ L 与6XLoading Buffer IyL混合，加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5yL DL2000DNA Marker加入到I %琼脂糖凝胶点样孔中；以140V电压分别对所述样品孔、所述 阳性对照孔和所述参比孔进行电泳约20min后，于凝胶成像系统下观察结果；若样品电泳 条带出现与阳性对照相同大小的条带（副溶血弧菌464bp、蛳诺卡氏菌690bp、美人鱼发光 杆菌954bp)，则说明待测样品含有相对应的细菌。
[0090] 2、检测结果：
[0091] 检测结果如图2所示，图2中泳道M为Marker DL2000 ;泳道1为三种病原菌三重 PCR阴性对照；泳道2为三种病原菌三重PCR阳性对照；泳道3为含有三种病原菌养殖水体 样品的三重PCR扩增结果；泳道4为不含有三种病原菌养殖水体样品的三重PCR扩增结果； 从图2可以看出含有三种病原菌养殖水体样品检测出相应的3条条带，并且与阳性对照条 带大小相同，不含有三种病原菌养殖水体样品并未检测出条带，即说明本发明的副溶血弧 菌、蛳诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌检测用引物组可以准确、特异性地检测出养殖水体中是 否含有副溶血弧菌、蛳诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌。
[0092] 上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明 进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或 者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范 围当中。
【主权项】
1. 一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的检测引物组，其特征在于，包括引 物对V.pa、引物对N.se和引物对P.da;其中，所述引物对V.pa包括核苷酸序列如SEQID NO. 1所示的V.pa-F和核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示的V.pa-R;所述引物对N.se包括核 苷酸序列如SEQIDNO. 3所示的N.se-F和核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示的N.se-R;所述 引物对P.da包括核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示的P.da-F和核苷酸序列如SEQIDNO. 6 所示的P.da-F。2. -种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的检测试剂盒，其特征在于，包括权 利要求1所述检测引物组。3. 根据权利要求2所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的检测试剂盒，其 特征在于，还包括蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70 % 的乙醇、TE缓冲液、CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCRDsMix;所述酚-氯仿-异戊醇 混合溶液中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1 ;所述CTAB的NaCl溶液为将CTAB溶于 0. 5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为1:20 ;所述阳性对照品包 括副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的DNA模板。4. 根据权利要求3所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的检测试剂盒，其 特征在于，所述检测引物组中的引物浓度均为10yM。5. 根据权利要求3所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的检测试剂盒，其 特征在于，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL，所述SDS溶液的质量浓度为10%。6. 根据权利要求3所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和蛳诺卡氏菌的检测试剂盒，其 特征在于，所述PCRDsMix为2XPCRDsMix。7. 采用权利要求2~6任一所述检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括如下步 骤： 1) 取待检测样品50~IOOmg并加入500~550yL的TE缓冲液，用玻璃匀浆器充分匀 楽后，于 12000r/min离心IOmin; 2) 步骤1)离心后去除沉淀，取上清备用； 3) 向步骤2)上清溶液中加入30yL质量浓度为10%的SDS溶液和15yL20mg/mL的 蛋白酶K，并于37°C温育Ih; 4) 向步骤3)温育后的溶液中加入100yL5mol/L的NaCl溶液，充分混匀后再加入 80yLCTAB的NaCl溶液，65°C温育 20min; 5) 向步骤4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶 液混勾，12000g/min离心4~5min; 6) 将步骤5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0. 6~0. 8倍体积的异丙醇， 12000g/min离心 4 ~5min; 7) 步骤6)离心后去上清，沉淀用ImL的体积浓度为70%的乙醇洗涤后，12000g/min离 心4~5min; 8) 步骤7)离心后去上清，沉淀常温干燥5~10min，重溶于30~50yLTE缓冲液，即 为样品DNA模板； 9) 样品组三重PCR反应体系包括：12. 5yL2XPCRDsMix、0. 8yL引物V.pa-F、0. 8yL 引物V.pa-R、L2yL引物N.se-F、L2yL引物N.se-R、L6yL引物P.da-F、L6yL引物 P. da-R、3 y L步骤8)得到的样品DNA模板和2. 3 y L无菌水； 10) 阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5yL 2XPCR DsMix、0.8yL引物V.pa-F、 〇? 8 y L 引物 V. pa-R、I. 2 y L 引物 N. se-F、I. 2 y L 引物 N. se-R、I. 6 y L 引物 P. da-F、I. 6 y L 引物P. da-R、3 y L阳性对照品和2. 3 y L无菌水； 11) 将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/min离心l〇s，置于PCR仪中，分别于94°C预变性5min，94°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸 lmin，35个循环，72°C延伸lOmin，进行PCR反应； 12) 对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比孔； 所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5 y L与6XLoading Bufferl y L混合，加入 到1 %琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5 y L 与6XLoading Buffer Iy L混合，加入到1 %琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5 y L DL2000DNA Marker加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中；以140V电压分别对所述样品孔、所述 阳性对照孔和所述参比孔进行电泳20min后，于凝胶成像系统下观察结果；若样品孔电泳 条带出现与阳性对照孔相同大小的条带，则说明待测样品中含有相对应的细菌。
【专利摘要】本发明公开一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法；所述引物组包括引物对V.pa、引物对N.se和引物对P.da，所述引物对的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1～6所示；所述检测试剂盒包括上述检测引物组；所述检测方法运用上述检测试剂盒进行检测，先对样品进行前处理，并提取基因组DNA作为样品组DNA，再采用PCR方法对样品进行检测。本发明建立了一套三重PCR检测方法，可用于对各时期的副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行跟踪检测，避免病原菌传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105176997
【申请号】
【发明人】许海东, 郭志勋, 陈日和, 冯娟, 苏友禄, 郑维谦
【申请人】深圳市富炜城投资有限公司, 中国水产科学研究院南海水产研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年11月2日