一种对克罗诺杆菌o抗原特异的核苷酸及其应用
【专利说明】-种对克罗诺杆菌O抗原特异的核苷酸及其应用
[0001] 本发明申请是【申请号】201410150358. 2,申请日：2014. 04. 16,发明名称：一种对 克罗诺杆菌0抗原特异的核苷酸及其应用的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种对克罗诺杆菌0抗原基因簇特异的核苷酸，尤其涉及一种对克罗 诺杆菌〇抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸。
【背景技术】
[0003] frofloAacier(克罗诺杆菌)是最近新分类的一个属，原称Enterobactersakazakii (阪崎肠杆菌)。2007-2008年由种上升为属，成为肠杆菌科的一个新属目前 "S? 7 Cronobacter sakazakii, C. malonaticus, C. muytjensii, C. dublinensis, C. 和C wfliFersa/is。现有研宄表明，所有克罗诺杆菌不同菌株之 间有着明显的致病性差异，其中和婴幼儿感染相关的菌集中在C malonaticus 热 C dublinensist。
[0004] 克罗诺杆菌是重要的食源性致病菌，分布广泛，在婴幼儿奶粉、奶酪、腌肉、水、蔬 菜、大米、面包、茶叶、草药、调味料以及豆腐等多种食品中被检测到。在对一些新生儿克罗 诺杆菌感染事件的调查中发现婴幼儿奶粉是主要感染渠道。随着一系列与该菌相关的奶粉 召回和重大感染事件的爆发，婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的感染问题受到全世界的普遍 关注，已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，可导致任 何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，严 重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎，死亡率可达40 %~80%。世界卫生组织 (WHO)和美国食品药品监督管理局（FDA)相继在2004年和2006年召开了讨论该菌的会议。
[0005] 目前克罗诺杆菌的分类地位刚刚建立，其0抗原血清型的研宄也逐渐成为热点。 脂多糖是革兰式阴性细菌的主要表面成分，包括类脂A，核心多糖和0抗原。0抗原是革兰 氏阴性细菌脂多糖分子的最外层结构，它是由多个寡糖重复单位组成的多糖链，重复单位 一般由3~6个单糖组成。在大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌中，负责0抗原合成的基因相 邻排列于两个持家基因 galF和gnd之间，在染色体上形成一个基因簇。0抗原基因簇内部 的基因通常分为三类：单糖合成酶基因、糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。单糖合成 酶负责单糖前体的合成，糖基转移酶负责将单糖串联成寡糖重复单位，而寡塘单位处理酶 负责将寡糖单位从内膜内侧转运到内膜外侧，并将寡糖单位进行串联。
[0006] 脂多糖特别是其中的0-抗原的组成和结构的变化决定了革兰氏阴性细菌细胞表 面抗原决定簇的多样性，比如国际上根据脂多糖的结构特性而鉴定过沙门氏菌属的抗原类 型多达2107个。血清分型是一种经典和常用的流行病学调查手段，对于临床研宄及疫苗研 制具有重要意义。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大 量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、 准确性差，不同的〇抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物 学技术的血清鉴定方法成为目前的发展方向。现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将 为现代分子生物学方法取代。
[0007] 近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转 录间隔区（ITS)序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度 多态性（RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于阪崎肠杆菌的快速血清分型筛查，稳定 的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链 式反应（PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、 灵敏、特异性强等优点。
[0008] 不同抗原的糖基转移酶和寡糖单位处理酶的序列同源性很低，具有高度的血清型 特异性，可用作靶基因进行分子生物学鉴定。寡糖单位处理酶基因包括〇抗原转运酶基因 (wzx)和0抗原聚合酶基因（wzy)。利用上述两个基因作为血清型分型检测的特异靶基因 是十分理想的。如大肠杆菌（王威，彭霞，2006年)、变形杆菌和沙门氏菌均有利用该基因做 特异检测的实例。
[0009] 聚合酶链式反应技术（Polymerase chain reaction,简称PCR技术）作为微生物 检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异 性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备 细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中 是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部 门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。不论从国内和国际的角度来 看，快速、准确地鉴定出血清类型，为克罗诺杆菌的防控提供有效技术支持是十分重要的。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目的在于提供了一种对克罗诺杆菌〇抗原基因特异的核苷酸，其特 征在于所述核苷酸为： 1) SEQ ID NO: 1-12所示的核苷酸中的至少一种 2) 与SEQ ID N0:l-12所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。其中所述互补 的核苷酸指的是由SEQ ID NO: 1-12所示的核苷酸按照碱基配对原则（A=T，G = C)得出 的与它们互补的核苷酸，如SEQ ID N01: 5'GAAGCGGCAGATTCATTTA 3'的互补核苷酸为 5 'TAAATGAATCTGCCGCTTC 3'。
[0011] 本发明另一个目的在于提供了一种用于检测克罗诺杆菌的PCR试剂盒，包括PCR 引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物如SEQ ID NO: 1-12所示核苷酸中的至少 一种。如用于检测01的引物SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2,和用于检测 C AzWiflez7lSi1S 02 引物 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4。
[0012] 这种试剂盒，还包括如下试剂：10 mM dNTP 30yL ;10X酶特异性反应缓冲液 50yL ;5 U/yL 耐热 DNA 聚合酶 5yL ;引物 1 (10μΜ) 10μ 1 ;引物 2 (10μΜ) 10μ 1 ;阳 性对照品10 μ L ;阴性对照品10 μ L ;ddH20 5mL。
[0013] 本发明再一个目的在于提供了所述核苷酸在制备用于检测克罗诺杆菌的基因芯 片中的应用。所述的基因芯片为微列阵芯片。包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷 酸探针，其中所述寡核苷酸探针包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸如SEQ ID NO: 1-12所 示的核苷酸中的至少一种。
[0014] 本发明公开的用于快速检测克罗诺杆菌的核苷酸与现有技术相比，本发明具有以 下优点： (1)实用性强 应用本发明所配制的PCR试剂盒等配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强， 易于产业化生产，而检测成本却相对较低。
[0015] (2)准确性高 本发明设计了对克罗诺杆菌0抗原基因特异的引物，以克罗诺杆菌的基因组为模板做 PCR能够得