专利名称：：来自海洋的粪产碱杆菌的培养方法及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种菌种的培养方法，特别是一种来自海洋的粪产碱杆菌的培养方法；本发明还涉及粪产碱杆菌的用途。
背景技术：
：目前，植物病害主要依赖化学杀菌剂防治，由于过量的使用导致了环境和农产品的污染，同时一些病原菌对农药产生了抗药性。生物防治的方法弥补了化学防治的不足，日益受到重视，已经成为植物病害防治的重要手段。但目前用于生物防治的微生物菌株多数来自于陆地，而多年来对陆地微生物的筛选，导致筛选到产生新型抗病机制的微生物的几率越来越少，因而越来越多的人们把目光投向了海洋，希望从海洋环境中极其具多样性的微生物中开发出新型抗病原菌活性物质，用于植物病害的生物防治。近几年以来，从海洋中寻找微生物新种和具有特殊功能的生理活性物质成为国内外的研究热点，海洋微生物已经成为农用抗生素的新资源。
发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种对9种植物病原真菌有强抗菌作用的粪产碱杆菌KZJ01(^c^i^"es/secah'sWrai"KZJOl)的培养方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种来自海洋的粪产碱杆菌KZJ01(^cah'ge/7es/aecahsstrai/KZJ01)的培养方法，其特点是，其具体分离培养步骤如下(1)富集培养从连云港海域采集海泥，将海泥10g放入盛有10mL的无菌海水的三角瓶中振荡摇匀，取5mL悬浮液加入到50mL富集培养液中，170r/min，25。C条件下摇床培养48h;(2)菌体的分离摇床培养48h后，用移液枪取富集培养48h的富集培养液1.0mL加入到盛有9.OniL无菌海水的试管中，制备成10—'的样品稀释液；然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10—2、10—3、l(T4、10—5、10—fi、10—7的样品稀释液；然后分别取10—5、10—6和10—7的样品稀释液0.2ml放到2216E固体培养基平板上，用涂布棒涂布均匀后，置于25'C的培养箱中培养24h，长出菌落；(3)菌株的纯化分别挑取2216E固体培养基平板上的菌落，用三区划线的方法接种到2216E固体培养基平板上，置于25。C培养箱中培养，反复划线直至得到纯的菌株单菌落，将若干个纯化的菌株分别转接到2216E试管斜面中保存；(4)菌株筛选按下述方法分别对上述若干个纯化的菌株进行抑制植物病原真菌实验；取纯化的菌株分别在2216E固体培养基平板上活化培养24小时，取9种植物病原真菌分别在PDA平板上活化培养3d;然后在PDA平板的中央接种活化3d的直径为5mm的植物病原真菌的菌苔，培养24小时后，在植物病原真菌四周距培养皿边缘15mm处划线接种lcm活化24小时的纯化的菌株，25t:倒置恒温培养，观察病原菌的生长状况，培养5d后测量抑菌带宽度；以不接菌为对照，实验重复3次；选取一株对9种植物病原真菌的抑菌带宽度平均值大于10mm的菌株，记为KZJ01菌株；(5)菌株的鉴定将KZJ01菌株于25。C下培养24h，观察记录菌落和细胞形态，同时进行革兰氏染色、运动性试验、过氧化氢酶试验、生长需要NaCl试验、淀粉水解试验和硝酸盐还原试验，并进行16SrDNA测序分析；结果为KZJ01菌株革兰氏染色阴性，无芽孢，细胞杆状；没有鞭毛，不能运动；在2216E固体培养基平板上菌落乳白半透明，边缘整齐；KZJ01菌株氧化酶反应阳性，好氧，性质初步鉴定为产碱菌属(J/ca/^e"M);16SrDNA的同源性分析表明，KZJ01菌株最接近于J/ca/z'gew"/aecafe，二者的16SrDNA序列相似性为99%，该菌株即为粪产碱杆菌KZJOl(y^cs7j'ge/e51/aecs力'sstrainKZJ01)。本发明技术方案中所述的菌株的鉴定方法中涉及的菌落和细胞形态观察、革兰氏染色、运动性试验、过氧化氢酶试验、生长需要NaCl试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验及16SrDNA测序分析的实验及分析方法均采用现有技术中的常规方法。16SrDNA测序分析得到的16SrDNA已在Genebank公开。本发明中所涉及的生物材料"粪产碱杆菌KZJOl(^cah'ge/7"/aecah'sstrainKZJ01)"菌株已于2008年11月27日在Genebank公开(登录号为:FJ436432)，网址为(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi7db二nuccore&id=215254287)。该菌株为公知公用材料，在该专利申请日期起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。本发明中涉及的培养基(1)富集培养液主要成分蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏5g、NaC15g、陈海水1000mL，pH7.5-8.0。(2)2216E固体培养基平板主要成分为蛋白胨5g、酵母膏lg、琼脂20g、陈海水1000mL，pH7.5-8.0。(3)2216E发酵培养液蛋白胨5g、酵母膏lg、陈海水1000mL，pH7.5-8,0。(4)PDA培养基培养基成分为马铃薯浸汁(20%)100mL，葡萄糖2g，琼脂1.5-2g，自然pH。上述4种培养基均按常规方法制备。本发明所述的粪产碱杆菌KZJOl(j/ca//ge""/aecafcstrainKZJ01)具有抑制植物病原真菌的用途。以下是发明人所做的抑菌实验。1、供试的9种植物病原真菌。玉米,J、珍王病菌(5&o/aWamqyd&)、玉米圆珍王病菌(//e/w/wf/zos/wn'wmcar6o"ww)、d、麦赤雾病菌(尸wsan'wmgramzVe"nm)、t帛花枯菱病菌(Fws"n.wmox评w臓f.sp.vasinfectum)、雪腐镰刀病菌(^Fkra〃'訓"zWe)、斑点落叶病菌(爿/femaWaa/fenw/a)、小麦根腐病菌(5zJ9o/an.ssoraAim.(3wa)、细链格抱病菌"/teman'afern^)、番茄早疫病菌to/""0是由中国农科院所土传病害实验室提供，实验室保存。2、粪产碱杆菌KZJ01(J〗cW^"e/7es/aecah'sstrainKZJ01)对病原真菌生长的抑制作用测定。7采用平板对峙法。按下述方法对粪产碱杆菌KZJ01进行抑制植物病原真菌实验；取粪产碱杆菌KZJ01分别在2216E固体培养基平板上活化培养24小时，取9种植物病原真菌分别在PDA平板上活化培养3d;然后在PDA平板的中央接种活化3d的直径为5mm的植物病原真菌的菌苔，培养24小时后，在植物病原真菌四周距培养皿边缘15mm处划线接种1cm活化24小时的纯化的菌株，25"C倒置恒温培养，观察病原菌的生长状况，培养5d后测量抑菌带宽度；以不接菌为对照，实验重复3次。3、粪产碱杆菌KZJOl无菌发酵液对植物病原真菌生长和孢子萌发的抑制作用测定。3.1无菌发酵液的制备将活化Id的粪产碱杆菌KZJ01菌株斜面用5mL的无菌水冲洗，用移液枪取3mL接种到盛有50mL2216E发酵培养液的三角瓶内，25°C，180r/min振荡培养48h。培养液在4。C、5000r/min离心10min，上清液用直径0.22pm的细菌过滤器过滤，制得无菌发酵液，备用。3.2无菌发酵液对植物病原真菌菌丝生长作用的测定将植物病原真菌菌苔接在PDA平板的中央，在四周对称打孔，每孔加入制备好的无菌发酵液200UL，以2216E发酵培养液为对照，25t:恒温培养。5d后观察菌落生长状况并测量抑菌圈的宽度，重复3次。3.3粪产碱杆菌KZJOl对植物病原真菌菌丝破坏作用的显微观察用解剖针轻轻挑取抑菌带边缘的病原真菌菌丝，在显微镜下观察病原真菌的菌丝生长状态。3.4无菌发酵液对病原真菌孢子萌发的作用测定用无菌水洗下培养5d的小麦根腐病菌和斑点落叶病菌(A"/^r"ato)的菌落，用四层纱布过滤除去菌丝，滤液室温下3500r/min下离心5min，沉淀即为分生孢子，用制备好的粪产碱杆菌KZJ01无菌发酵液配制孢子悬浮液，浓度为106个孢子/mL。取0.1mL孢子悬浮液涂布在无菌玻片上，置于铺有湿润滤纸的培养皿内，25。C下黑暗恒温保湿培养，分别于2h、4h、6h、8h、10h观察孢子萌发情况，计算萌发率。如果10h对照的孢子萌发率低于90%，则继续观察计算12h的孢子萌发率。同时观察芽管的生长状态，测量芽管长度。以2216E发酵培养液为对照。孢子萌发率(％)=孢子萌发数/调查孢子总数。4、结果与分析。4.1粪产碱杆菌KZJOl(^cah>e/7es/seca7AstrainKZJ01)抑菌作用的测定结果。供试的粪产碱杆菌KZJ01对不同的植物病原真菌具有明显的抑制作用，菌株对不同供试病菌的抑菌作用有所不同，结果见表l。表l粪产碱杆菌对植物病原真菌生长的抑制作用(抑菌圈直径)(mm)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>粪产碱杆菌KZJ01对植物病原真菌的抑制作用较强，对供试的9种病原真菌都有明显的抑制作用，抑菌圈直径均达到10mm以上。其中对斑点落叶病菌(Aa/femata)、小麦赤霉病菌(Fgra附z'weanw2)禾口番茄早疫病菌(Aso/am.)的抑制作用最强，抑菌圈直径分别达15.2mm、14mm和13.9mm，其次对玉米圆斑病菌(//.ca^o"wm)、细链格孢病菌(Afe"w&)和棉花枯萎病菌(Fox，/wwmf.sp.vasinfectum)也有较强的抑制作用，抑菌圈直径分别为13.5mm、12mm禾n12.8mm;X寸雪腐镰刀病菌(Fm'va/e)、小麦根腐病菌(及sorahm'a"a)、玉米小斑病菌(及ma_y^fc)的抑制作用较弱，抑菌圈直径为11.5mm、11.3mm、10,0mm。4.2粪产碱杆菌KZJ01无菌发酵液对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用。粪产碱杆菌KZJ01无菌发酵液对植物病原真菌菌丝抑制作用的测定结果见表2。粪产碱杆菌KZJOl无菌发酵液对植物病原真菌菌丝的抑制作用较强，对所有供试植物病原真菌的菌丝均有一定的抑制作用，对斑点落叶病菌(Aa/tenato)、细链格孢病菌".te"M&)和番茄早疫病菌U.菌丝的抑制作用最为明显，抑菌圈直径分别为11.2mm、1.08mm和10.4mm表2粪产碱杆菌KZJ01无菌发酵液对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用(抑菌圈直径)(mm)供试病原菌抑菌圈直径11.27.510.87.510.88.09.0丑.so^ot/打/awa8.3Aso/awZ10.44.3粪产碱杆菌KZJOl"JcaJi《e/7es/aecs7isszLrahKZJ01)对植物病原真菌菌丝的破坏作用。取抑菌带处的菌丝在显微镜下观察，发现植物病原真菌的菌丝生长异常，表现出菌丝扭曲，部分菌丝顶端呈球形膨大，生长受阻；或表现出菌丝细胞壁变薄局部破裂；菌丝细胞原生质收縮，出现空泡；也有部分菌丝断裂，泡囊破裂，原生质外泄。而对照的菌丝则原生质分布均匀，形态正常，粗细均匀，分支多，生长旺盛。4.4粪产碱杆菌KZJ01无菌发酵液对植物病原真菌孢子萌发的抑制作用。粪产碱杆菌KZJ01的无菌发酵液对供试的2种植物病原真菌的分生孢子萌发均具有明显的抑制作用。处理2h后，对照的孢子萌发率分别达到22.3%和9.3%,处理的孢子尚未萌发。随着时间的延长，孢子萌发率逐渐增加，对照的萌发率增长较快，10个小时后萌发率分别达到了96.2%和92.4%,处理的孢子萌发率仅为37.4%和43.6%,10h的抑制率分别为61.2%禾卩63.6%，见表3。表3粪产碱杆菌KZJ01的无菌发酵液对2种病原真菌分生孢子萌发的影响(萌发率)(％)处理病原真菌时间(h)Time(h)抑制率(■>/。)Inhibitoryrates(%)246810(10h)KZ.T01发酵液ck0.022.34.328.617.868.329.189.737.496.261.1KZI01发酵液0.00.87.627.443.663.6ck9.323.753.265.492.4-显微观察结果表明对照的孢子原生质分布均匀，形态正常。发酵液处理的有些分生孢子缢縮，原生质凝集于两端；部分孢子膨大呈球状，细胞壁变11薄，甚至部分崩解。无菌发酵液能抑制芽管生长，使芽管畸形、扭曲，甚至串珠状膨大，有的孢子萌发产生的芽管短粗，其上有小泡囊产生；有的芽管顶端膨大，巻曲，粗短，孢子体异常，细胞壁变薄等多种状态。对照的芽管多分枝、细长，发芽点处不畸形，极少出现泡囊。5、结论与讨论粪产碱杆菌KZJOl"/ca//ge""/aecafoWra/wKZJ01)及其发酵液对供试的植物病原真菌具有较强的抗菌作用；显微观察结果表明其导致病原真菌菌丝扭曲，分生孢子芽管的畸形。无菌发酵液对病原真菌菌丝生长和芽管的破坏作用表明，经粪产碱杆菌KZJ01"/ca"ge"^/aecafcstrainKZJ01)的无菌发酵液处理的病原真菌的孢子和菌丝，芽管或菌丝畸形膨大，进而破裂。本实验结果表明，无菌发酵液处理后分生孢子萌发率明显降低，造成芽管生长异常，说明粪产碱杆菌KZJOl"/c"//gewey/aeca/&strainKZJOl)的无菌发酵液既可通过直接抑制孢子的萌发，也可通过芽管畸形和断裂起到抑制孢子萌发作用，这一结果说明分离得到的粪产碱杆菌KZJOl"/c^'gew^/aecafcstrainKZJOl)能够通过两种途径有效控制病原真菌孢子的萌发和阻止病菌侵入寄主。具体实施例方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例l。一种来自海洋的粪产碱杆菌KZJOl(^ca"'《e/es/aecahsKZJOl)的培养方法，其具体分离培养歩骤如下(1)富集培养从连云港海域采集海泥，将海泥lOg放入盛有lOmL的无菌海水的三角瓶中振荡摇匀，取5mL悬浮液加入到50mL富集培养液中，170r/min，25。C条件下摇床培养48h;(2)菌体的分离摇床培养48h后，用移液枪取富集培养48h的富集培养液1.0mL加入到盛有9.OmL无菌海水的试管中，制备成10—'的样品稀释液；然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10—2、10—3、l(T4、l(T、l(T、10—7的样品稀释液；然后分别取10—5、10—6和10—7的样品稀释液0.2ml放到2216E固体培养基平板上，用涂布棒涂布均匀后，置于25t:的培养箱中培养24h，长出菌落；(3)菌株的纯化分别挑取2216E固体培养基平板上的菌落，用三区划线的方法接种到2216E固体培养基平板上，置于25'C培养箱中培养，反复划线直至得到纯的菌株单菌落，将若干个纯化的菌株分别转接到2216E试管斜面中保存；(4)菌株筛选按下述方法分别对上述若干个纯化的菌株进行抑制植物病原真菌实验；取纯化的菌株分别在2216E固体培养基平板上活化培养24小时，取9种植物病原真菌分别在PDA平板上活化培养3d;然后在PDA平板的中央接种活化3d的直径为5mm的植物病原真菌的菌苔，培养24小时后，在植物病原真菌四周距培养皿边缘15mm处划线接种lcm活化24小时的纯化的菌株，25"C倒置恒温培养，观察病原菌的生长状况，培养5d后测量抑菌带宽度；以不接菌为对照，实验重复3次；选取一株对9种植物病原真菌的抑菌带宽度平均值大于10mm的菌株，记为KZJ01菌株；(5)菌株的鉴定将KZJ01菌株于25。C下培养24h，观察记录菌落和细胞形态，同时进行革兰氏染色、运动性试验、过氧化氢酶试验、生长需要NaCl试验、淀粉水解试验和硝酸盐还原试验，并进行16SrDNA测序分析；结果为KZJ01菌株革兰氏染色阴性,无芽孢，细胞杆状；没有鞭毛，不能运动；在2216E固体培养基平板上菌落乳白半透明，边缘整齐；KZJ01菌株氧化酶反应阳性，好氧，性质初步鉴定为产碱菌属(v4/c^/ge"");16SrDNA的同源性分析表明，KZJ01菌株最接近于力ca"ge"^/aecafe，二者的16SrDNA序列相似性为99%，该菌株即为粪产碱杆菌KZJOl(爿2csJ2'《e/7as1i^ecsJj'61strainKZJOl)。本实施例培养方法所得的粪产碱杆菌KZJOl(^ca7&朋"/secah'sstrainKZJOl)具有抑制9种植物病原真菌菌丝生长的作用，而且对其中2种植物病原真菌的分生孢子的萌发有抑制作用。权利要求1、一种来自海洋的粪产碱杆菌KZJ01(AlcaligenesfaecalisstrainKZJ01)的培养方法，其特征在于，其具体分离培养步骤如下(1)富集培养从连云港海域采集海泥，将海泥10g放入盛有10mL的无菌海水的三角瓶中振荡摇匀，取5mL悬浮液加入到50mL富集培养液中，170r/min，25℃条件下摇床培养48h；(2)菌体的分离摇床培养48h后，用移液枪取富集培养48h的富集培养液1.0mL加入到盛有9.0mL无菌海水的试管中，制备成10-1的样品稀释液；然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的样品稀释液；然后分别取10-5、10-6和10-7的样品稀释液0.2ml放到2216E固体培养基平板上，用涂布棒涂布均匀后，置于25℃的培养箱中培养24h，长出菌落；(3)菌株的纯化分别挑取2216E固体培养基平板上的菌落，用三区划线的方法接种到2216E固体培养基平板上，置于25℃培养箱中培养，反复划线直至得到纯的菌株单菌落，将若干个纯化的菌株分别转接到2216E试管斜面中保存；(4)菌株筛选按下述方法分别对上述若干个纯化的菌株进行抑制植物病原真菌实验；取纯化的菌株分别在2216E固体培养基平板上活化培养24小时，取9种植物病原真菌分别在PDA平板上活化培养3d；然后在PDA平板的中央接种活化3d的直径为5mm的植物病原真菌的菌苔，培养24小时后，在植物病原真菌四周距培养皿边缘15mm处划线接种1cm活化24小时的纯化的菌株，25℃倒置恒温培养，观察病原菌的生长状况，培养5d后测量抑菌带宽度；以不接菌为对照，实验重复3次；选取一株对9种植物病原真菌的抑菌带宽度平均值大于10mm的菌株，记为KZJ01菌株；(5)菌株的鉴定将KZJ01菌株于25℃下培养24h，观察记录菌落和细胞形态，同时进行革兰氏染色、运动性试验、过氧化氢酶试验、生长需要NaCl试验、淀粉水解试验和硝酸盐还原试验，并进行16SrDNA测序分析；结果为KZJ01菌株革兰氏染色阴性，无芽孢，细胞杆状；没有鞭毛，不能运动；在2216E固体培养基平板上菌落乳白半透明，边缘整齐；KZJ01菌株氧化酶反应阳性，好氧，性质初步鉴定为产碱菌属(Alcaligenes)；16SrDNA的同源性分析表明，KZJ01菌株最接近于Alcaligenesfaecalis，二者的16SrDNA序列相似性为99％，该菌株即为粪产碱杆菌KZJ01(AlcaligenesfaecalisstrainKZJ01)。2、权利要求1所述的粪产碱杆菌KZJOl(^cah>e/7"/aecah'sstrainKZJ01)的抑制植物病原真菌的用途。全文摘要本发明是一种来自海洋的粪产碱杆菌KZJ01(AlcaligenesfaecalisstrainKZJ01)的培养方法，其特征在于，它经过富集培养、菌体的分离、菌株的纯化、菌株筛选、菌株的鉴定等步骤得到粪产碱杆菌KZJ01。本发明培养方法所得的粪产碱杆菌KZJ01具有抑制9种植物病原真菌菌丝生长的作用，而且对其中2种植物病原真菌的分生孢子的萌发有抑制作用。文档编号C12N1/20GK101481671SQ20091002890公开日2009年7月15日申请日期2009年1月21日优先权日2009年1月21日发明者刘云鹤,夏振强,暴增海,王伟霞,马桂珍申请人:淮海工学院