专利名称：从真养产碱杆菌中提取聚β－羟基烷酸酯的新方法
技术领域：
本发明涉及一种用表面活性剂从微生物体中直接提取聚β-羟基烷酸酯(poly-β-hydroxyalkanoate，简称PHA)的方法。
PHA是微生物在不平衡生长条件下贮存于细胞内的一系列高分子聚合物，其中的聚β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate，简称PHB)、聚β-羟基戊酸酯(PHV)及两者的共聚物(PHBV)不仅具有与化学合成塑料聚丙烯相似的性质，而且还具有化学合成塑料所没有的特殊性能，如生物降解性、生物相容性、光学活性等，并且可利用再生资源进行生物合成。因此近十多年来，随着化学合成塑料造成对环境的“白色污染”的严重性，微生物合成PHA的研究受到人们的广泛重视。英国ICI公司经过15年的努力，率先于1990年采用真养产碱杆菌(A.eutrophus)生产出了商品名为“Biopol”的生物可降解塑料。
用来从真养产碱杆菌这种微生物中提取PHA最常用的方法是有机溶剂法，通常用的有机溶剂包括氯仿(如欧洲专利46,017)、二氯乙烷(欧洲专利58,480)、1，1，2-三氯乙烷(美国专利4,310,684)、乙酸酐(东德专利223,428)、碳酸乙烯酯及碳酸丙烯酯(美国专利4,101,533)等。该方法存在的最大缺点是(1)使用大量的有机溶剂，尽管溶剂可回收再用，但仍造成巨大的原料消耗；(2)即使经过多次反复提取，仍有一定量的PHA存在于菌体中，因而提取率难以达到很高；(3)当溶剂中含有超过5％(w/v)的PHA时，溶液变得很粘，要进行分离操作就十分困难；(4)大量有毒、易爆、挥发溶剂的使用，对环境造成严重污染，给操作带来不便。
提取PHA的另一种方法是次氯酸钠法(见Biotechnology Techniques，1989；3(4)227)，由于所用次氯酸钠有很强的氧化性，因而它对PHA分子有严重的降解作用，使得提取得到的PHA分子量降低了近一半。
人们还知道的提取PHA的方法是氯仿——次氯酸钠法(见Biotechnology andBioengineering，1994；44256)，它实质上是将上述两种方法结合起来的一种方法。由于仍然需要使用大量有机溶剂，而且仍然使用了次氯酸钠，因此它无法克服上述两种方法共同存在的缺点。
用酶法来提取PHA的方法(如美国专利4,910,145)是为了克服上述几种方法的缺点而采用的的一种新的提取方法，但单纯使用酶法所提取得到的PHA的纯度不高，往往要结合其它的方法，例如再用表面活性剂处理(美国专利4,101,533)，才能得到较高纯度的PHA。该方法通常包括细胞的热处理、酶处理和用阴离子表面活性剂处理等步骤，操作十分复杂。尽管它实现了在水相体系中提取PHB，但由于细胞的杂质成分比较复杂，特别是酶作用的条件比较苛刻，而且高纯度的产品需要多步处理操作，因而过程的操作复杂，所以酶法的应用在提取成本、过程放大等方面仍然受到很大限制。
为了克服酶法提取PHA存在的操作步骤多且酶作用条件苛刻的不足，同时为了尽量避免使用有机溶剂而用水相体系提取PHB，人们研究了用表面活性剂——次氯酸钠来提取PHA的方法(Biotechnology Techniques，1990；4(4)221)。该法的不足之处是要使用较大量的表面活性剂(十二烷基硫酸钠或TX-100)，而且次氯酸钠的使用不可避免地造成了PHA的降解，这就必然限制了它的工业应用。
本发明的目的是提供一种对环境污染小、操作简便、费用低、成品纯度高的提取聚β-羟基烷酸酯的方法。
本发明的具体操作步骤如下(1)将冷冻干燥的菌体加入到含有表面活性剂及络合剂的水溶液中，在一定的温度及pH下搅拌；(2)离心或过滤上述混合物；(3)将得到的固体物用去离子水洗涤并离心或过滤分离；(4)再用丙酮洗涤；(5)将离心或过滤得到的固体物在60℃的烘箱中烘干。
本发明所用的表面活性剂是一种十二烷基甜菜碱型两性表面活性剂，其分子内以季铵盐基作为阳离子部分、以羧基作为阴离子，结构式如下
它对疏水性物质具有较强的亲和力，能结合并使磷脂等细胞物质增溶或溶解在水溶液中。
这里，表面活性剂的用量为菌体(即真养产碱杆菌)量的1～80％，最佳用量为12％。
由于真养产碱杆菌是革兰氏阴性菌，外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持。如果加入络合剂EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量脂多糖分子将脱落，外层膜出现洞穴，这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而使得该区域的通透性增加，有利于胞内物质PHA的释放。
按照本发明，EDTA的用量为菌体量的0～50％，要得到高纯度的产品，最佳用量为8％。
菌体在水溶液中的浓度为1～100g/l，最佳用量为20g/l。
为了有利于提取，控制合适的pH并维持适当的温度是很重要的。在这里，含表面活性剂(或EDTA)的水溶液的pH值为5～14，最佳为13；温度为5～120℃，最佳为50℃。
上述用表面活性剂处理菌体的时间为2～120分钟，最佳作用时间是10分钟。
在随后的分离操作中，由于表面活性剂的用量较小，而且含PHA的混合液的温度不是很低，所以混合液的粘度不大；又因为PHA不溶于水，因此可以通过离心或者过滤分离得到粗品PHA。
在上面的过滤操作中，加入适量的硅藻土作为助滤剂，将有利于过滤。
用适量的去离子水洗涤粗品PHA，可以去掉粘在PHA上的水溶性物质和离子。再用丙酮或甲醇洗涤以去掉一些仍然存在的细胞杂质物质，就可以得到更高纯度的PHA；而且由于丙酮或甲醇能与水形成共沸物，其沸点比水的沸点大大降低，因而也有利于干燥。
洗涤后的PHA在60℃的恒温干燥箱中烘干24小时，可得到白色的产品。
PHA的定量分析用气相色谱法(Journal of Chromatography.1988，445285)；分子量的测定用粘度法(Macromolecules.1976，9(5)774)。
本发明不但可以在实验室实施，而且极易在工业生产中运用。用表面活性剂水溶液处理菌体时，所用的设备只需一个最常用的搅拌釜。固液分离时，离心操作只需在8000rpm下离心5分钟或者4000rpm下离心15分钟；若用过滤操作，则可以在常压或减压(1大气压)下进行。所有这些都表明，本发明是很容易实现从实验室到工业生产的放大的。
在下面的所有实施例中，所用的菌体都是在培养结束后，经离心(2500rpm，15min)、去离子水洗涤、再经过冷冻干燥得到的；提取前PHB的粘均分子量为402,000；所用的水都为去离子水；菌体中PHB的含量都为菌体干重的60％；所有的测量数据都是三次测定的平均值，百分比都是以质量计的。
通过以下的实施例能更好地理解本发明，它们叙述了从真氧产碱杆菌中提取PHA的具体操作过程，其中大部分是以提取PHB为例的，但本发明并不仅仅适用于从真氧产碱杆菌中提取PHB。
实施例14克30％的甜菜碱溶液和0.4克EDTA溶于200毫升的去离子水中，用NaOH调pH至14。向其中加入4克菌体，在50℃的温度下搅拌10分钟。混合物在8000rpm下离心5分钟后，分别用100毫升水和40毫升丙酮洗涤，将离心得到的沉淀物在60℃的温度下烘24小时。
结果如下PHB的纯度99.9％提取率56.7％粘均分子量8.9×104显然，高的pH提取虽然可以得到极高纯度的产品，但分子量发生严重降解。
实施例2改变提取时的pH为13，其它操作同例1。所得结果如下PHB的纯度96.3％提取率90.5％粘均分子量3.16×105实施例3改变提取时的温度为85℃，其它操作同例2。所得结果如下
PHB的纯度99.7％提取率97.2％粘均分子量1.62×105显然，高温度提取虽然可以得到极高纯度和很好提取率的产品，但分子量却发生部分降解。
实施例4改变表面活性剂的用量为菌体量的12％，EDTA的用量为菌体量的8％，提取时的pH为13，其它操作同例1。所得结果如下PHB的纯度98.7％提取率93.3％粘均分子量3.16×10权利要求
1.从真养产碱杆菌中提取聚β-羟基烷酸酯的新方法，其特征为(1)将冷冻干燥的菌体加入到含有表面活性剂及络合剂的水溶液中，在一定的温度及pH下搅拌；(2)离心或过滤上述混合物；(3)将得到的固体物用去离子水洗涤并离心或过滤分离；(4)再用丙酮洗涤；(5)将离心或过滤得到的固体物烘干。
2.按权利要求1所述的一种从真养产碱杆菌中提取聚β-羟基烷酸酯的新方法，其特征为所述的表面活性剂是十二烷基甜菜碱型两性表面活性剂。
3.按权利要求1所述的一种从真养产碱杆菌中提取聚β-羟基烷酸酯的新方法，其特征为所述的络合剂是乙二胺四乙酸二钠。
4.按权利要求2的方法，其特征在于表面活性剂的用量为菌体重量的1～80％。
5.按权利要求3的方法，其特征在于络合剂用量为菌体重量的0～50％。
6.按权利要求1的方法，其特征在于提取时的温度为5～120℃。
7.按权利要求1的方法，其特征在于提取时的pH值为5～14。
8.按权利要求1的方法，其特征在于提取时间为2～120分钟。
9.按权利要求8的方法，其特征在于提取的较佳时间为5～30分钟。
10.按权利要求1的方法，其特征在于菌体在水溶液中的浓度为1～100g/l。
全文摘要
本发明公开了一种从真养产碱杆菌中提取聚β－羟基烷酸酯的新方法,其主要特征是用表面活性剂－络合剂水溶液从真氧产碱杆菌中一步提取聚β－羟基烷酸酯(简称PHA)。本发明不但具有环境污染小、操作简便的优点,而且具有产品质量高、试剂费用低、操作费用低的特点,特别还适合于工业化生产。
文档编号C08H99/00GK1171410SQ9710697
公开日1998年1月28日 申请日期1997年5月22日 优先权日1997年5月22日
发明者陈坚, 陈银广, 伦世仪 申请人:无锡轻工大学