专利名称：一种哈工大碱杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物。
背景技术：
极端环境微生物具有独特的基因类型，可以在极端环境中生存、繁衍。嗜 盐微生物是能在高盐环境下生长、繁衍的一类极端微生物，因其特殊的生理机 制和代谢产物(如视紫红质、相似性溶质、酶、多聚物、脂质体等)，具有 巨大的研究价值和实际应用价值。嗜盐微生物在能源、食品、生物电子、制盐、 医药、培育转基因植物以及环境整治等方面正显示出巨大的开发潜力。
高含盐有机废水属于极难处理的废水之一。目前，对此类废水一般采用电 解法、膜分离法、焚烧法和深井灌注法等技术处理，但由于这些方法存在成本 高、二次污染等缺点，所以难以在实际中应用。传统生物法中采用的微生物在 处理低盐度废水时具有很大的优势，但当盐浓度超过3.5%，则会造成生物代 谢的中度抑制和毒害，使微生物失去其降解能力，从而大幅影响高盐有机废水 的处理效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种嗜盐菌菌株，并应用于高盐有机废水的生物强化 处理，解决目前高含盐有机废水生物处理中污染物去除效果差，物理化学方法 成本高、易造成二次污染的缺陷。
本发明哈工大碱杆菌(^/^//to"7/w JSA1经鉴定属于碱杆菌属 "/A^/Z^"'//""新种，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心(CGMCC)，保藏地址是北京市海淀区中关村北一条13号，保藏日期为2007 年4月6日，保藏号为CGMCC No.l994;哈工大碱杆菌JSA1为革兰氏阳性 好氧杆菌，中度嗜盐，在NaCl质量浓度为0~25%、 pH值为4.5 9.5的环境中 生长；哈工大碱杆菌JSA1菌体长短多变，宽为0.4^im 0.6pm，长为 0.7^im 3.8pm，无鞭毛；哈工大碱杆菌JSA1在固体培养基上生长菌落为白色， 表面光滑，边缘整齐。不能以D-葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、乳糖、肌醇、蔗
糖、木糖醇、木糖、乙酸钠、柠檬酸钠、麦芽糖、甘露醇或山梨醇作为唯一碳
源；不能以精氨酸、胱氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸、组氨酸、 色氨酸、甘氨酸或脲作为唯一氮源。
本发明哈工大碱杆菌"/^^^"7/ws W) JSA1接触酶阳性、氧化酶阴性、
淀粉水解阴性、明胶液化阴性，硝酸盐还原反应阴性、酪素水解试验为阴性、 酪氨酸水解试验为阴性。哈工大碱杆菌(^&//6wz7/WlS JSA1的主要脂肪
酸种类[异构脂肪酸(iso)，反异构脂肪酸(anteiso)，不饱和脂肪酸(w7c alcohol)]
和含量为C15:0iso 34.06%、 C15:0anteiso 29.00%、 C16:0iso 3.44%、 C16:1 w7calcohol 4.04%、
C17:0is。4.10%、 C17:0anteis。 12.49%;占总脂肪酸含量的87.13%。
本发明哈工大碱杆菌(J汰a/Aa"7/w/nY) JSA1通过16SrDNA基因序列比 对分析与其最相近的种属是碱杆菌属嗜盐碱杆菌"/&//tec///w sp.YIM012)， 相似性为99%，结合细菌形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果及脂肪酸分 析结果，确定哈工大碱杆菌JSA1为碱杆菌属的一个新菌种，命名为哈工大碱 杆菌/z" sp.nov.)，哈工大碱杆菌JSA1 (屋a/Zte赢s to JSA1) 为哈工大碱杆菌模式菌株。
本发明哈工大碱杆菌"汰a/z'^"7/w具有处理强化高盐有机废水的功 能，强化高盐有机废水中污染物去除率高于90%，费用低，不造成二次污染。 本发明哈工大碱杆菌(^&//6m///m为生物处理强化高盐有机废水及极端 微生物的研究奠定了物质基础。
J/b/A""7/ws/nY属于碱杆菌属"仪a船a"7/w),保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市海淀区中关村北 一条13号，保藏日期为2007年4月6日，保藏号为CGMCCNo.1994。
图1是哈工大碱杆菌JSA1的菌落照片，图2是哈工大碱杆菌JSA1的原 子力显微镜观察图，图3是哈工大碱杆菌JSA1的原子力显微镜观察图，图4 是哈工大碱杆菌JSA1的原子力显微镜观察图，图5是哈工大碱杆菌JSA1的 原子力显微镜观察图，图6是哈工大碱杆菌JSA1菌株的脂肪酸含量分析色谱 图，图7是哈工大碱杆菌JSA1和相近菌株的16S rDNA基因序列构建的NJ 系统发育树图。 -具体实施方式
.
具体实施方式
一本实施方式哈工大碱杆菌"汰"/Aa"7/ws/hY) JSA1经鉴 定属于碱杆菌属(^汰"//^"7/^)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏日期为2007年4月6日，保藏号为CGMCCNo.l994;哈工 大碱杆菌JSAl为革兰氏阳性好氧杆菌，中度嗜盐，在NaCl质量浓度为0 25M、 pH值为4.5~9.5的环境中生长；哈工大碱杆菌JSA1菌体长短多变，宽为 0.4tim 0.6^im，长为0.7Mm 3.8|im，无鞭毛(如图2 图5所示)；哈工大碱杆 菌JSA1在固体培养基上生长，菌落为白色，表面光滑，边缘整齐(如图l所 示)。
本实施方式哈工大碱杆菌(^/^//Z^a'//^JSA1为适中温菌，不运动， 在以D-葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、乳糖、肌醇、蔗糖、木糖醇、木糖、乙酸 钠、拧檬酸钠、麦芽糖、甘露醇或山梨醇为唯一碳源的培养基上均不生长；在 以精氨酸、胱氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸、组氨酸、色氨酸、 甘氨酸或脲为唯一氮源的培养基上均不生长。
参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对哈工大 碱杆菌(^/^//^"7/ws /nY) JSA1进行生理生化鉴定哈工大碱杆菌 "/^/^c///^ /hY) JSA1接触酶阳性、氧化酶阴性、淀粉水解阴性、明胶液 化阴性，硝酸盐还原反应阴性、酪素水解试验为阴性、酪氨酸水解试验为阴性。
采用美国MIDI全细胞脂肪酸分析系统鉴定哈工大碱杆菌"/^幼acz7/^ to) JSA1，哈工大碱杆菌"汰a/Z^^7/wJSA1的主要脂肪酸种类和含量 为C15:0is。 34.06%、 C15:0anteiso 29.00%、 C16:0iso 3.44%、 C16:1
w7c alcohol
4濕、C17:0
is。 4.10%、 C17:q她is。 12.49%;占总脂肪酸含量的87.13%，哈工大碱杆菌 "/fe^'^c///^JSAl菌株的脂肪酸含量分析色谱图，如图6所示。
本实施方式哈工大碱杆菌(v4/^a//Z^c///"1sJSAl最适宜在NaCl质量浓 度为3%~15%、 pH值为6.5 9.0的环境中生长。
具体实施方式
二本实施方式哈工大碱杆菌(^&//&c///m/hY) JSAl是从 山东省威海市金泓化工有限公司高盐废水中筛选得到的。筛选按以下步骤进 行取山东省威海市金泓化工有限公司高盐废水10mL置于lOOmL液体培养 基中，在33 35。C、 120r/min的环境中摇床富集培养3 5天；然后接菌于NaCl
质量浓度为盐度为15%的斜面培养基上，在33 37'C条件下培养2 4天；之后
挑选单菌落反复多次划线纯化培养，即可得到嗜盐菌菌株。
本实施方式中每升液体培养基由5g酸水解酪素、12g酵母膏、6g胰蛋白 胨、3g柠檬酸三钠、3gKCl、 18gMgS04'7H20、 0.001 gFeS04、 150gNaCl和 余量的去离子水组成，并调节pH值7.0 8.0。本实施方式中每升固体斜面培养 基由5g酸水解酪素、12g酵母膏、6g胰蛋白胨、3g柠檬酸三钠、3gKCl、 18g MgS04*7H20、 0.001 gFeS04、 150gNaCl、 18~20g琼脂和余量的海水组成，并 调节pH值7.0-8.0。
参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对筛选得 到的嗜盐菌菌株进行生理生化鉴定，并采用美国MIDI全细胞脂肪酸分析系统 鉴定筛选得到的嗜盐菌菌株。
通过16S rDNA的扩增、测序及同源性比较鉴定筛选得到的嗜盐菌菌株 用细菌基因DNA小量快速提取试剂盒(购自于北京博大泰克生物基因技术有 限公司)提取筛选得到的嗜盐菌菌株的总DNA，并用通用引物进行PCR扩增， 16S rDNA序列的上游引物Eu-bac27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCACG-3'、 下游引物1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(引物购自于大连宝生物 工程有限公司)。PCR反应体系(20pL)为筛选得到的嗜盐菌菌株DNA40ng、 rragDNA聚合酶终浓度为0.3U，4种dNTP各O.3mmol/L，上游引物Eu-bac27F 0.1pmol/L、下游引物1492R0.1nmol/L和余量的去离子水。PCR反应程序为 94。C预热5min， 94"C变性30s， 58'C退火45s， 72。C延伸90s，循环30次，最 后72"C延伸10min。 PCR扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳，再用胶回收试剂盒 (宝泰克)切胶回收，然后与pGEM-T载体(购自于美国Promega公司)连 接，再转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞(购自于北京天为时代科技有限公 司)中。蓝白斑筛选在加入氨苄青霉素Amp (5pg/mL)和X-gal的LB固体 培养基上进行筛选。检测白色质粒基因序列提取白色质粒基因，再用pGEM-T 载体引物T7和SP6扩增，并测序；本实施方式筛选得到的哈工大碱杆菌 U/^3/^ad//^ M) JSA1的16S rDNA序列如SEQ ID NO.l所示。测出的基 因序列用BioEdit v 5.06进行多序列比对，发现与本实施方式筛选得到的哈工 大碱杆菌JSA1最相近的种属是碱杆菌属嗜盐碱杆菌U/^幼a"7to sp.YIM
012， DQ359731),相似性为99%，结合细菌形态特征、生长条件、生理生化 鉴定结果及脂肪酸分析结果，发现两者间存在明显区别，与本属其它菌种的区 别更为明显，确定哈工大碱杆菌JSA1属于一个新菌种，命名为哈工大碱杆菌 "/^//6""7/^/^)。根据哈工大碱杆菌JSA1和相近菌株的16SrDNA基因序 列，采用MEGA3.1软件邻接法(neighbor-joining, NJ)构建的NJ系统发育树如 图7所示。
本实施方式中质粒基因提取使用上海华舜生物有限公司出品的DNA小量 细菌提取试剂盒，基因测序工作由生物工程公司完成。
用本实施方式哈工大碱杆菌JSA1处理强化高盐有机废水。按50mL/L将 哈工大碱杆菌JSA1接种于序列间歇反应器(Sequencing Batch Reactor),再向 SBR反应器中注入含盐量为10%， CODcr为2570mg/L的高盐模拟有机废水； 处理72h，高盐模拟有机废水的CODo去除率为79%，处理108h，高盐模拟 有机废水的CODcr去除率为92%。实验证明哈工大碱杆菌JSA1具有处理强化 高盐有机废水的功能，可以明显去除强化高盐有机废水中的污染物，而且无须 添加其它化学制剂，大幅降低了高盐有机废水的处理成本，避免了二次污染。
COD (化学耗氧量)，采用重铬酸钾(K2Cr207)作为氧化剂测定出的化学耗 氧量表示为COD&。 序列表
<110>哈尔滨工业大学
<120> —种哈工大碱杆菌
<160> 3
<210> 1 <211> 1484 -212>DNA
<213>哈工大碱杆菌禾中(J/to/沾fld〃w/z" sp.nov.) <220>
<223>哈工大碱杆菌JSA1 16S rDNA基因序列
<400> 1
gagacgctggcggcgtgcctagtcgagcgcgggaagcgagctgaagccct 60
tcggggtggatgctcgtggaacgagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctacc 120
tgtgagacggggataactccggga肪ccggggctaataccggatascgcatcgaaccgca 180
tggttcgatgatcaaagatggcttcttgctatcactc3cagatgggcccgcggcgcatta 240
gttagttggtggggt幼cggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtga 300
tcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatc 360
atccgcaatggacgcaagtctgacggtgcaacgccgcgtgagcgatgaaggtcttcggat 420
cgtaaagctctgttgtg鄉gaagaacaagtgccgttcgaatagggcggcaccttgacgg 480
tacctcaccagaaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgt鄉gggc 540
aagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggttccttaagtctgatgt 600
g助3ggCC3Cagctcaactgtggagggccattggaaactggggaacttgaggacagaaga 660
gg卿gCgg3attccacgtgtagcggtgaa8tgcgtagatatgtggaggaacaccagtgg 720
cgaaggcggctctctggtctgtaactgscgctgaggcgcgsaagcatgggtagcgaacag 780
gattagataccctggtagtccatgccgtaaacgttgagtgctaggtgttagggggtccaa 840
cccttagtgctgcagttaacgcaataagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctg 900
gaattgacgggggcctgcacaagcggtggagcatgtggUtaattcgacg 960
caacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttcggacagcccaagagattgggtcttc1020
ccttcggggaccg犯tgac3ggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgtt1080
gggttaagtcccgt犯cgagcgcaacccctgatcttagttgccagcattcagttgggcac1140
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cccttatgacctgggctacacacgtgctac幼tggatggteicgiaagggaagccei肌ccgc1260
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catgaagccggaatcgctsgtaatcgcggstcagaatgccgcggtg幼tacgttcccagg1380
ccttgtacacaccgcccgtcacaccacgag3gttggCMCacccgaagtcggtgggg他1440
ccttcacggagccagccgccg,gtggggccaatgattggggg 1484
<210>2 <211>21 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>通用16SrDNA序列上游引物Eu-bac27F <400> 2
agagtttgat cctggctcac g 21
<210>3 <211> 19 <212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<223>通用16SrDNA序列下游引物1492R <400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
权利要求
1、一种哈工大碱杆菌，其特征在于哈工大碱杆菌(Alkalibacillus hit)JSA1经鉴定属于碱杆菌属(Alkalibacillus)新种，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年4月6日，保藏号为CGMCCNo.1994；哈工大碱杆菌JSA1为革兰氏阳性好氧杆菌，中度嗜盐，在NaCl质量浓度为0～25％、pH值为4.5～9.5的环境中生长；哈工大碱杆菌JSA1菌体长短多变，宽为0.4μm～0.6μm，长为0.7μm～3.8μm，无鞭毛；哈工大碱杆菌JSA1在固体培养基上生长菌落为白色，表面光滑，边缘整齐。不能以D-葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、乳糖、肌醇、蔗糖、木糖醇、木糖、乙酸钠、柠檬酸钠、麦芽糖、甘露醇或山梨醇作为唯一碳源；不能以精氨酸、胱氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸、组氨酸、色氨酸、甘氨酸或脲作为唯一氮源。
2、 根据权利要求1所述的一种哈工大碱杆菌，其特征在于哈工大碱杆菌 "/^/^ac/〃^ /hY)JSA1的主要脂肪酸种类和含量为C15:0 is。 34.06%、C15:o咖&。29.00%、 C16:0iso3.44%、 C16:lw7calcohol4,04%、 C17:0iso4.10%、 C17:0anteiso 12.49%; 占总脂肪酸含量的87.13%。
3、 根据权利要求1所述的一种哈工大碱杆菌，其特征在于哈工大碱杆菌 "/^/^"7/w M) JSA1接触酶阳性、氧化酶阴性、淀粉水解阴性、明胶液化阴性，硝酸盐还原反应阴性、酪素水解试验为阴性、酪氨酸水解试验为阴性。
全文摘要
一种哈工大碱杆菌，它涉及一种微生物。它提供一种嗜盐性菌株，并可应用于高盐有机废水的生物强化处理，解决目前高含盐有机废水生物处理污染物去除效果差的缺陷。哈工大碱杆菌经鉴定属于碱杆菌属新种，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年4月6日，保藏号为CGMCC No.1994；哈工大碱杆菌为革兰氏阳性好氧杆菌，中度嗜盐，在NaCl质量浓度为0～25％、pH值为4.5～9.5的环境中生长；哈工大碱杆菌菌体长短多变，宽为0.4μm～0.6μm，长为0.7μm～3.8μm，无鞭毛。本发明哈工大碱杆菌具有处理强化高盐有机废水的功能，强化高盐有机废水中污染物去除率高于90％，不造成二次污染。
文档编号C12N1/20GK101173234SQ20071007273
公开日2008年5月7日 申请日期2007年9月3日 优先权日2007年9月3日
发明者李维国, 苏俊峰, 放 马, 利 魏 申请人:哈尔滨工业大学