专利名称：一株木糖氧化无色杆菌及其在降解异喹啉中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于木糖氧化无色杆菌技术领域。具体涉及一株木糖氧化无色杆菌及其在降解异喹啉中的应用。
背景技术：
由于焦化废水毒性较大，难降解的有机物含量较高，导致常规生化处理后出水的 COD浓度和色度均难达到国家再生循环水的标准。经A-A-O工艺处理后，其色度和COD值均未达到再生水的标准，GC-MS仍检出118种有机物。其中，喹啉类有机物的含量最高，占有机物全含量的14.3wt%。即喹啉类有机物是焦化废水处理系统中难降解的有色多环芳烃， 其含量的多少已直接影响着生化处理效果和再生循环水的水质。因此，提高喹啉类有机物的降解率是当前焦化废水再生循环利用的难题。喹啉类属含氮杂环结构难降解的有毒的有机物，生物酶识别率低，对生物的生长有抑制作用，降解效率亟待提高，故国内外对喹啉类物质生物降解的报道较少。异喹啉是一种具有代表性的含氮杂环物质，有一个含氮杂环和一个苯环，分子量的大小和溶解性都增加了生物酶降解它的难度。目前，异喹啉的降解可用活性污泥法，厌氧生物法、厌氧酸化-缺氧-好氧(A-A-O)生物膜法、超临界水分解法、脉冲辅解和激光光解法。而利用生物法中特殊的降解菌株来处理工业废水比物理和化学方法更切实可行又成本低廉有效。目前关于焦化废水的研究取得了较大进展，但焦化废水大规模再生处理现状仍不乐观，优势菌强化再生处理焦化废水技术是近年来研究的热点，对焦化废水再生循环利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高效降解异喹啉的木糖氧化无色杆菌Y-4。本发明所提供的异喹啉降解菌为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)Y-4，其 16SrDNA 的 Genbank 登录号为 JN381516 ；于 2011 年 9 月 6 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M2011308。所述木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans) Y-4经革兰氏染色后为阳性菌，细胞呈椭圆，一般成对出现，在LB固体培养基上培养2 4d形成的菌落达2 3mm， 菌落圆形，表面光滑，润湿，凸起，边缘整齐，平面生长，不透明，呈乳白色。所述木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans) Y-4来源于焦化厂焦化废水处理系统的活性污泥。木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)Y_4对异喹啉有独特的降解效果，对异喹啉的最高耐受浓度可达1000mg/L，在36h内能将浓度 500mg/L以内的异喹啉完全降解，最适降解温度为25 35°C，pH为4_8，木糖氧化无色杆菌 (Achromobacter xylosoxidans)Y-4对萘、吡啶和喹啉有较好的降解效果；木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans) Y-4在生物净化焦化废水中异喹啉的应用，对焦化废水中异喹啉的降解效果非常明显。为微生物降解焦化废水中异喹啉的研究提供了重要基础，在喹啉类工业废水治理实践中发挥重要作用。
图1为木糖氧化无色杆菌(Ach romobacterxylosoxidans)Y_4革兰氏染色后菌体形态照片；图2为木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4在不同温度下对异喹啉的降解效果；图3为木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4在不同pH条件下对异喹啉的降解效果；图4为木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4在添加不同外源氮时对异喹啉的降解效果；图5为木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4对萘、吡啶、苯酚和喹啉的降解效果。
具体实施例方式下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)Y-4的分离、纯化及其鉴定1、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans) Y-4的分离禾口纯化1)样品采集取某焦化厂焦化废水处理系统的活性污泥进行预处理，S卩加入适量的无菌水于恒温磁力搅拌器中搅拌30min，以增加活性污泥中菌种的活性。2)增菌培养和驯化在装有IOOmL的焦化废水的锥形瓶、IOOmL的含50%焦化废水的MSM液体培养基的锥形瓶和IOOmL的MSM液体培养基的250mL的锥形瓶分别依次加入2 5颗玻璃珠、 0. 01%的焦磷酸钠溶液两滴、0. 02g异喹啉和5mL的处理后的活性污泥，在30°C，150r/min 的恒温摇床中培养2 4d，制得三种培养液；然后在三种培养液中分别取5mL转接至新鲜的MSM培养基，在30°C，150r/min的恒温摇床中培养。再将异喹啉的浓度从200mg/L逐渐依次增大至 300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L 和 1500mg/L，以驯化菌株的降解能力，筛选出驯化后对异喹啉具有降解能力的菌株。将菌株经新鲜的MSM液体培养基培养成菌液。3)菌种分离筛选取ImL的菌液用无菌的MSM培养基稀释ICT1到10,倍，各取100 μ L稀释液均勻涂布在含异喹啉300mg/L的MSM固体培养基平板上，于30°C的生化培养箱培养2 4d，挑取长势良好的单菌落接入含异喹啉500mg/L的MSM液体培养基，再取对异喹啉有降解效果的菌株在LB固体培养基上平板稀释和平板划线纯化，得到高效降解异喹啉的纯种菌落。将单一的菌落分别使用含有异喹啉的培养基进行二级培养和富集营养。形状稳定的分离株转接到LB固体斜面，储存在4°C下以待进一步研究。4)降解效果评价
在含异喹啉的MSM液体培养基中，实验组接种纯化后的单一菌落，对照组不接菌。 30°C,150r/min条件下培养1 2d，取样萃取后用Agilent7890气相色谱仪(FID)检测残余异喹啉的浓度。选取降解效果最好的菌株，扩大培养。气相检测条件 分流进样，分流比为30 1，进样口温度为280°C ；FID检测，检测器温度为320°C，色谱柱为30. 0mX320ymX0. 25 μ m的Inventory HP-5型填充柱，N2作载气，升温程序100°C时保持lmin，l(TC /min升至250°C，保持lmin，进样量为1 μ L。所述MSM液体培养基的组分及配比为(无机盐培养基，1L)硝酸铵lg，磷酸氢二钠1. 42g，磷酸二氢钾1. 36g，七水硫酸镁0. 432g，氯化钙0. 006g,微量元素lmL，其余为蒸馏水，PH自然，121. 3°C湿热灭菌20min;其固体培养基是在液体培养基中加入2% (w/v)的琼脂。其中微量元素的组分及配比为(IL)一水硫酸锰1. 69g，六水氯化钴0. 24g，硼酸 1. 16g，二水钼酸钠0. 024g,七水硫酸亚铁2. 78g，七水硫酸锌1. 15g，五水硫酸铜0. 38g。LB液体培养基组分及配比为(IL)酵母浸提物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，其余为蒸馏水，121. 3°C湿热灭菌20min;其固体培养基是在液体培养基中加入2% (w/v)的琼脂。结果得到一株可在高浓度异喹啉环境下生长的菌株，对异喹啉的最高耐受浓度可达1000mg/L，在36h内能将浓度为500mg/L以内的异喹啉完全降解，在固体培养基上培养 2-4d形成的菌落大小为2 3mm，菌落圆形，表面光滑，润湿，凸起，边缘整齐，平面生长，不透明，呈乳白色。2.将上述得到的菌株进行生理生化及16Sr DNA鉴定，其生理生化特征如表1所示，IBSrDNA鉴定结果见序列表，所述序列表为上海生工生物技术有限公司测序结果。表1木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans) Y-4生理生化特征
权利要求
1.一株木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4，该菌株的16SrDNA的 Genbank登录号为JN381516，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年9月6日， 保藏编号为 CCTCC NO :M2011308o
2.一株木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4在降解异喹啉中的应用。
3.一株木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4在生物净化焦化废水中异喹啉的应用。
全文摘要
本发明公开了一株木糖氧化无色杆菌及其在降解异喹啉中的应用，所述木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)命名为Y-4，菌株保藏登记号为CCTCC NOM2011308，该菌株16SrDNA的Genbank登录号为JN381516。本发明的木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)Y-4对异喹啉有独特的降解效果，对异喹啉的最高耐受浓度可达1000mg/L，在36h内能将浓度为500mg/L以内的异喹啉完全降解，最适降解温度为25～35℃，pH为4-8，同时对萘、吡啶和喹啉也有较好的降解效果，对生物净化焦化废水中异喹啉的效果非常明显。本发明为微生物降解焦化废水中异喹啉的研究提供了重要基础，将在喹啉类工业废水治理实践中发挥重要作用。
文档编号C02F101/38GK102417887SQ20111026557
公开日2012年4月18日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者刘奇, 刘文敏, 李文兵, 杨书琴, 王光华, 蒋丽娟, 郭胜 申请人:武汉科技大学