专利名称：：具有苯胺降解能力的无色杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物降解
技术领域：
，特别地，涉及一种新苯胺降解菌及其应用。
背景技术：
：苯胺作为化学合成的芳香族化合物的典型代表，是重要的化工原料和精细化工中间体，由其制得的化工产品和中间体有300多种，广泛应用于农药、医药、印染、塑料等行业。目前，国内每年生产苯胺80，000t以上，全世界每年排入环境中的苯胺约为30，000t。环境中所含的苯胺类污染物主要来自制药、橡胶及其他许多化工厂的废水中。苯胺是高毒高残留物质，引起中枢神经系统、心血管系统以及其他脏器的损害，能与血红蛋白结合成高铁血红蛋白，使其与氧结合能力下降而导致动物中毒，同时被证实具有致癌性，是一种对人类构成严重危害的物质，已被美国EPA列为优先控制的129种污染物之一，也被列入"中国环境优先污染物黑名单"中，工业排水中要求严格控制。世界各国科学家都十分重视对苯胺类污染物降解的研究，而生物降解具有效率高、成本低、反应条件温和以及无二次污染等优点，是从废水中去除苯胺类污染物的重要途径之一。目前，国内外研究者对苯胺的生物降解已开展了大量研究工作，国内外已分离到一些在好氧或厌氧条件下降解苯胺的细菌，主要有/^ew^/^/7as，等。大量研究表明从环境中分离筛选高效的苯胺降解菌，仍然是消除环境中苯胺污染的重要环节。本发明中的无色杆菌属力c力ro/z7^a"er是活性污泥菌胶团中常见的优势菌之一。经检索专利和其他相关文献，尚未发现利用无色杆菌属JcAro;^&"er降解苯胺的报道。该降解菌的发现对工业废水中苯胺类污染物的高效净化具有重要意义。
发明内容3本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一株高效、耐受能力强的具有苯胺降解能力的无色杆菌及其应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种具有苯胺降解能力的无色杆菌，它的16SrDNA具有SEQIDNo.1的序列。该菌属于无色杆菌属JcArcOTC^actersa，与JcArcffic^acterj^'ecAswo^'j'的同源性最高，申i青人4各其编号为adx-3，菌落呈黄色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，凸状隆起。电镜观察，大小为(0.50.7)iimX(0.91.2)nm，无鞭毛，无芽孢菌；电子显微镜下观察该菌体的形态为稍粗杆菌，革兰氏染色阴性，氧化酶、过氧化氢酶阴性，硝酸盐还原产气。本发明的有益效果是利用本发明的Jc力r，Wscfaradx-3用于污水体系中苯胺的降解，不仅有很高的降解效率和耐受浓度，同时^!c力ro/^^cferadx-3具有很好的自絮凝特性，污水处理中可发挥重要作用，增强系统的耐冲击性。本发明的Jc力romc^a"ersaadx-3取自废水处理单元，是废水处理系统中的优势菌种，能适应复杂的实际条件，因而具有广阔的应用前景。木发明的具有苯胺降解能力的无色杆菌已于2008年10月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为CCTCCNO:M208176。图1为本发明的菌/^力M膨Z73c&r柳adx-3透射电镜照片；图2为本发明的菌Jc/ro历oZac^rsaadx-3的系统发育树图；图3为本发明的菌Jc力ro历c^s"6^adx-3对不同初始浓度的苯胺的降解曲线；图4为不同温度下菌v4c力2YMo/^c"r邵.adx-3对苯胺的降解曲线；图5为不同pH值下菌ZcArazoZ7ac砂.adx-3对苯胺的降解曲线。具体实施例方式本发明所的具有苯胺降解能力的无色杆菌为Jc力2y/^&"ersaadx-3。所述的Zc/ro历oZ7a"er邵.adx-3来源于炼化污水处理厂曝气池中的活性污泥中，经驯化、分离、纯化获得，能以苯胺为唯一碳源和氮源。该菌属于无色杆菌属y4c力rowoZ^cter,与爿c/rcw7c^acter/iecAg〃c//2的同源性最高，申请人将其编号为adx-3，菌落呈黄色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，凸状隆起。电镜观察，大小为(0.50.7)umX(0.91.2)um，无鞭毛，无芽孢菌；电子显微镜下观察该菌体的形态为稍粗杆菌(图1)，革兰氏染色阴性，氧化酵、过氧化氢酶阴性，硝酸盐还原产气；Jc力2^K^s"erw.adx-3的16Sr腿具有SEQIDNo.1的序列；爿c/LTOMAgcfer5^.adx-3的Genebank的登录号为FJ169468;图2为该菌的系统发育树图。所述//c力r咖Ws"er砂.adx-3已于2008年10月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为CCTCCNO:M208176。本发明的t力r，o》a"er柳adx-3可用于工业废水体系中苯胺的降解，具体方法可为将Jc力ro历o^"ersaadx-3悬浮于含苯胺或其衍生物的污水中，在15-45°C，pH值为5-10的条件下培养。所述Jc力7Y^o^s"eradx-3在污水中的培养温度优选为30-35°C，最佳为30。C，pH值条件优选为pH7-pH8，最佳为pH8。以上述adx-3为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围；该菌剂中可根据需要，添加可接受的辅料。本发明的Jc力r湖o&cter5aadx-3，当投菌量为0.01g/L(按干重生物量计算)时，在30°C，180r/min，PH为7.2的条件下，对初始浓度为50-4000mg/L的苯胺均可完全降解，其最高耐受浓度达4500mg/L。下面根据实施例详细描述本发明，木发明的目的和效果将变得更加明显。实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1.^c力r咖Macfersp.adx-3的分离、纯化及其鉴定1.爿c力r0历0Z7ac力er5;.adx—3白勺分离及纟屯ik/(c/ro膨^3c^r柳adx-3是从浙江镇海炼化污水处理厂曝气池的活性污泥中取样，经驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下取浙江镇海炼化污水处理厂曝气池的活性污泥。在500mL锥形瓶中加入50mL污泥与50mL驯化培养液(0.024g/LKH2P04，0.024g/LNa異，0.0696g/LMgS047H20，0.022g/LCaCl22H20，0.005g/LFeCl"0.00003g/LCuS04H20，0.00013g/LMnS04H20，0.00023g/LZnCl2，0.00042g/LCoCl6H20，0.00015g/LNaMo042H20，0.00005g/LA1C136H20)，以及0.049mL苯胺(500mg/L)。每5d置换50mL培养液，加入O.049mL苯胺，并调pH为7.5左右，驯化30d。取5mL污泥与20mLMM培养液(O.24g/LKH2P04，0.24g/LNa2HP04，0.0696g/L5MgS04*7H20，0.022g/LCaCl22H20，0.005g/LFeCl3，0.00003g/LCuS04H20，0.00013g/LMnS04H20，0.00023g/LZnCl2，0.00042g/LCoCl6H20，0.00015g/LNaMo042肌0.00005g/LA1C136H20，121°C，20min灭菌)到250mL锥形瓶中，加入若干玻璃珠，摇床3(TC，180rpm/min振荡lh，取振荡后上清液，用灭菌去离子水稀释10—10—7倍，各取0.lmL稀释液于含苯胺200mg/L的丽固体培养基(上述麗培养基中加入1.5-2%琼脂制得)平板上稀释涂布，3CTC培养。4d后取长势良好的单菌落接入含苯胺200mg/L的MM液体培养基，取对苯胺有降解效果的菌株在平板上划线分离，如此分离纯化几次，得到高效降解苯胺的纯菌JcArajWoZ^cz^r5^.adx_3。JcAra历oZscter5/.adx—3的透身才电lt照片如图l所示。」c力ro/z7o&jcter邵.adx-3菌株的生理生化特性如表1所示。表1.^c力ro^^s^er邵.adx-3菌株的生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.JcAra^^s"er卬.adx-3的16SrDNA鉴定通过16SrRNA序列分析和Biolog微生物鉴定系统鉴定，确定adx-3菌属于无色杆菌属JcAro迈oZa"ar。具体步骤如下以采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司的)提取和纯化DNA。PCR扩增，选用细菌的通用引物BSF8/20和BSR1541/20，引物序列分别为BSF8/20:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'BSR1541/20:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，PCR反应程序设定为先94。C预变性4min;然后94。C变性1min，59。C退火lmin，72'C延伸1.5min，循环35个周期；然后72°C延伸10min;最后4°C保持10min。将PCR产物进行测序(华大基因)，测序得到SEQIDNo.1的序列。将爿c力ro膨力scter印.adx-3的16SrDNA测序结果导入GenBank中进行同源性比对，结果表明它与^c力iTMo6a"erA-ec力aw/z'j'(ABO10841)和Jc/^o范o&"er印a//ws(AY170848)同源性最高，图2为该菌的系统发育树图。通过Biolog微生物鉴定系统的分析，确定A^ro/z/o6sc/:er5^.adx-3属于Jc/r譜。yfecter柳。将该菌命名为y4c力ro膨Zs"eradx-3。实施例2.Jc力r，o力s"eradx-3对苯胺降解性能检测1.在以苯胺为唯一碳、氮源的条件下，考察adx-3对不同苯胺初始浓度的降解能力。发现当苯胺初始浓度不超过4000mg/L时，adx-3对苯胺有较好的去除效果，当苯胺浓度达4500mg/L时，菌株生长受抑制，120h内苯胺降解率为25%左右。同时，随着苯胺初始浓度的增加，降解抑制期变长，降解期的苯胺降解速率变快。具体歩骤如下1)从固体培养基上接菌adx-3到含苯胺500mg/L的MM培养液中，3(TC，180rpm/min摇床培养24h，使其0D6。。=1.2±0.05。2)在14个装有50mLMM培养液的250mL锥形瓶中分别加入苯胺，其终浓度分别为50，100，200，300，500，700，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500mg/L。然后分别将步骤1)培养得到的菌悬液以干菌体接种量为0.01g/L(干重法测定)接种于上述锥形瓶中，30°C，180rpm/min摇床中振荡培养。3)在步骤2)所述的培养过程中，定期取样测定苯胺浓度和菌液浓度。苯胺浓度测定采用AgilentTechnologies1200SeriesHPLC分析。检测条件EclipseXDB-C18反相柱(5iim，4.6X150mm);检测波长230nm;流动相为0.2mL/L磷酸溶液/甲醇=75/25;流速0.8mL/min;进样量5uL;柱温30。C。菌浓度测定JH722S可见分光光度计，在吸收波长600nm处检测菌液吸光度。苯胺浓度变化曲线如图3中的a、b，苯胺初始浓度为504000mg/L的培养8液中，^c力roM^ac^r印.adx-3菌可较好降解苯胺，但各苯胺初始浓度条件下，抑制期的长短和降解速率不同。随着苯胺初始浓度的升高，抑制期时间变长，说明苯胺初始浓度越高，细菌适应越慢。但一旦进入降解期，苯胺初始浓度高的培养液中微生物降解速率快，这是因为菌株完全适应了生长环境，高浓度的苯胺给菌株提供更充足的营养基质从事生命活动并大量繁殖，而细菌数量增大后，所需的碳、氮源多，苯胺的降解速率相应提高，二者相互促进。菌浓度变化曲线如图3中的c、d所示，可以看出，菌浓度随着苯胺的降解逐渐升高。随着苯胺初始浓度的升高，培养液中的碳、氮源的量变大，最大菌浓度递增。但是这种增长并不成正比，这说明，A^ro/ffoybacters/.adx-3的生长的限制因素不仅有苯胺的浓度，还有其它的因素。2.爿c/2YM7o/acferadx-3菌在不同纟显度下的降解f寺性在不同温度下实施降解实验，发现adx-3菌在3035'C具有较高的苯胺去除率，从实际应用的角度看，选择3(TC较为适宜。具体步骤如下分取50mL應培养液至6个250mL锥形瓶中，加入500mg/L苯胺后，将步骤1中的步骤1)制备得到的Jdro/^fe"erack-3菌悬液以干菌体接种量为0.01g/L接种于该培养液中，分别置于15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C的摇床中培养。取0h和15h的样品，计算去除率。结果如图4所示，结果表明，15。C时15h内苯胺去除率最低，约30%，20°C、25。C时去除率稍高，65%左右，30°C、35"C时的去除率最高，在95%左右，达4(TC时去除率下降，约70%。这说明细菌最适生长、降解温度处于3035°C之间，考虑到污水处理工艺的实际情况，adx-3菌的培养温度选择3(TC较为合理。3.爿cAra历o/acz^r57.adx-3菌在不同pH值下的降解特性由不同起始pH值条件的降解实验，发现adx-3菌的最适降解pH值为8。具体步骤如下在6个250mL锥形瓶中装如50mLMM培养液，分别调节pH至5、6、7、8、9、10，将步骤l中的步骤l)制备得到的A7力r^o&"enAadx-3菌悬液以干菌体接种量为0.01g/L接种于培养液中，并分别加入苯胺500mg/L，30°C，180rap/min摇床中振荡培养。取0h和15h的样品，计算去除率。结果如图5所示，pH值为5时，苯胺去除率最低，只有15%左右，随pH值升高至8，去除率提高到95%，当pH值为9时，去除率略有下降，约为80%，当pH值为10时，去除率仅为40%左右。具有苯胺降解能力的无色杆菌的16SrDNA基因序列SEQIDNo.1表SEQUENCELISTING<110>浙江工业大学〈120>具有苯胺降解能力的无色杆菌及其应用〈160〉1〈170>Patentlnversion3.1〈210〉1<211>1445<212>DNA<213>Achromobactersp<400>1ccttacacatgc3agtcg犯cggcagcacggacttcggtxtggtggcgagtggcgaacgg60gtgagtaatgt3tCgg6L6lCgtgcccagtagcgggggataactacgcgaaagcgtagctaa120taccgcatacgccctacggggg認gcaggggatcg固gaccttgcactattggagcgg180ccgatatcggattagctagttggtggggt3acggctcacc卿gcgacgatccgtagctg240gtttg卿ggacgaccagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggc300观cagtggggaattttggacaatgggggaaacccLgatccagccatcccgcgtgtgcgat360gsaggccttcgggttgta肌gcacttttggacgtcatgggttaatacccc420gtgaaactgacggtacctgcagaateagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggta480atacgtagggtgcaagcgttactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggttcg540cagagcttaactttggaactgcatttttaactaccgggct600卿gtgtgtc卿gg鹏gtggaattccgcgtgtagcagtg朋atgcgtagatatgcgga660gg肌cetccgatggc,ggcagcctcctgggataacactgacgctcatgcacgaaagcgt720gggg3gcaaacsggattagataccctggtagtccacgccctaaacgstgtcaactagctg780ttggggtcttcggaccttggtsgcgcagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtac840ggtcgca卿ttaaaactca.Cgggg3CCCgcacaagcggtggatgatgtg900gattaattcgatgcaacgcgcctacccttgacatgtctggaattccgaag960已gatttgga已gtgctcgceiag卿accggaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctc1020gtgtcgtgsgatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcattagttgctac1080ga朋gggcactctaatgagactgccggtgacaaaccggeigg肪ggtggggatgacgtcaa1140gtcctcatggcccttatgggtagggcttcacacgtcatacaatggtcggg織gagggtc1200gcc犯cccgcg郷ggg鄉caatcccagaaacccgatcgtagtccggatcgcagtctgc1260aactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagteatcgcggatcagcatgtcgcggtgaata1320cgttcccgggtcttgtacaca.ccgcccgtc3C3CC3tgggagtgggttttaccagaagta1380gttagcctaaccgtaaggggggcgattaccacggtaggattcatgactggggtgaagtcg1440aacaa144权利要求1.一种具有苯胺降解能力的无色杆菌，其特征在于，它的16SrDNA具有SEQIDNo.1的序列。保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM208176。2.权利要求1所述具有苯胺降解能力的无色杆菌在降解苯胺类污染物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的降解苯胺类污染物为降解污水中苯胺类物质及其衍生物，具体方法为将无色杆菌悬浮于含苯胺类物质及其衍生物的污水中，在温度为15-4(TC，pH值为5-10的条件下培养。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述无色杆菌在污水中的培养温度优选为28-35°C，pH值条件为7-8。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述无色杆菌在污水中最佳培养温度为30°C，最佳pH值条件为8。6.—种以权利要求1所述具有苯胺降解能力的无色杆菌为活性成分的生物菌剂。全文摘要本发明公开了一种具有苯胺降解能力的无色杆菌，它的16SrDNA具有SEQIDNo.1的序列。菌落呈黄色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，凸状隆起。电镜观察，无鞭毛，无芽孢菌；电子显微镜下观察该菌体的形态为稍粗杆菌，革兰氏染色阴性，氧化酶、过氧化氢酶阴性，硝酸盐还原产气。本发明可在好氧条件下实现对苯胺类污染物的高效降解，且对苯胺的最高耐受浓度可达4500mg/l，对浓度≤4000mg/l的苯胺可实现完全去除，将在苯胺类工业废水治理实践中发挥重要作用。文档编号C02F101/38GK101514330SQ20081016316公开日2009年8月26日申请日期2008年12月18日优先权日2008年12月18日发明者向正心,姜理英,张丽丽,陈建孟申请人:浙江工业大学