一种维氏硝化杆菌xy-01及其培养方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是一种维氏硝化杆菌（Nitrobacter Winogradskyi) XY-Ol及其培养方法与应用。
【背景技术】
[0002] 亚硝酸盐即亚硝酸的盐类，含有亚硝酸根离子NCV，有毒，有致癌性，除硝酸银外， 一般都易溶于水。碱金属盐较稳定，其他盐加热时都分解。既有氧化性又有还原性。大量 用于化学合成、食品行业以及作为实验室必备的化学试剂。
[0003] 在水产养殖中，鱼虾残饵及其排泄物在水中分解产生了大量的氨和有毒物质，再 经过亚硝化菌和光合细菌的作用很快转化为亚硝酸，亚硝酸与水体中的金属离子结合会产 生亚硝酸盐，除此之外，长时间不清除池底淤泥，养殖密度过大会导致水底缺氧，在微生物 作用下，含氮有机物分解，也会以亚硝酸盐的形态存在于水体中导致亚硝酸盐积累。水生动 物吸收过量亚硝酸盐，会影响血液中携氧细胞的运作，抑制了血液的载氧能力，严重可导致 鱼虫下大量死亡。
[0004] 可见，亚硝酸盐积累是引起高密度水产养殖中鱼虾等水生动物中毒死亡的主要原 因之一，寻求有效的亚硝酸盐降解方法，控制养殖后期池体中亚硝酸盐浓度是提高养殖成 功率，增加亩产量的必经之路。
[0005] 传统的氧化法或还原法虽然能安全有效的降低亚硝酸盐浓度，但是存在着维持时 间短，水体亚硝酸盐容易反弹等缺点；物理吸附法虽然具有作用时间短、成本低等优点，但 需要吸附剂的用量巨大；通过换水等间接方法处理显然也存在治标不治本的缺点。
[0006] 因此，普通的物理化学法虽然能有一定的效果，但是存在着药剂需要量大、维持时 间短、易反弹等诸多问题，因此，筛选能够高效降解亚硝酸盐的菌株并探索其高密度培养方 法，成为水产养殖领域亟待解决的难题之一。
[0007] 本发明公开的维氏硝化杆菌能在好氧条件下高效地降解水体中的亚硝酸盐，降低 亚硝酸盐氮浓度，因此必将为水产养殖中微污染生态环境生物处理技术的发展做出积极的 贝献。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种维氏硝化杆菌XY-01，可有效降解水体 中的亚硝酸盐。
[0009] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供用于上述维氏硝化杆菌XY-Ol的培养 方法。
[0010] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供用于制备含上述维氏硝化杆菌XY-Ol 的菌剂的方法及其由该方法制备的菌剂。
[0011] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述维氏硝化杆菌XY-Ol或含上述维 氏硝化杆菌XY-Ol的菌剂的应用。
[0012] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0013] 本发明提供一种维氏硝化杆菌（Nitrobacter winogradskyi) XY-Ol，其保藏号为 CGMCC 10171(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号、保藏日期：2014年12月15日，保藏编号：CGMCC 10171)。
[0014] 优选的，上述维氏硝化杆菌XY-01，由污水处理厂活性污泥中筛选出来，其菌落在 培养平板上呈透明圆形细小颗粒状，革兰氏染色呈阴性，通过16SrDNA测序鉴定为维氏硝 化杆菌，16SrDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0015] 优选的，上述维氏硝化杆菌XY-01，具有较强的亚硝酸盐降解能力。
[0016] 优选的，上述维氏硝化杆菌XY-01，可降解亚硝酸盐氮的浓度范围为兰615mg/L， 优选的，=400mg/L，更优选的，f 300mg/L，最优选的，f 200mg/L。
[0017] 更优选的，所述维氏硝化杆菌XY-Ol在其培养液中的亚硝酸盐氮降解速率可达到 60mg_N/(L · h)以上。优选可达 73mg_N/(L · h)
[0018] 本发明还提供一种用于上述维氏硝化杆菌XY-Ol的培养基，组分如下：每IL水中，
[0019] Na2I IPO4 1.7-3.2- Ki I2PO4 0.18-0.36 - NaNO2 (?.3-3g MgSO1 · Ti I2O 0.01-0.03 g CaCL2 0.001-0.003 g 离子溶液 l-20mL pH 7.3-9 固态加1.5%的琼脂。
[0020] 其中，离子溶液组分：每IL水含FeSO4 · 7H20 lg，EDTA lg。
[0021] 优选的，所述培养基组分为：
[0022] 每IL水中，
[0023] Na2i IPO4 2.0-3.Og, KII2PO4 0.23-0.32g NaNO2 1.0-2.Og MgSO4 TiI2O 0.015-0.025g CaCL2 ().()015-0.0025g 离子溶液 5-15mL· pH 7.8-8.4 固态加1.5%的琼脂。
[0024] 其中，离子溶液组分：每IL水含FeSO4 · 7H20 lg，EDTA lg。
[0025] 更优选的，所述培养基组分为：
[0026] 每IL水中，
[0027] Na2I IPO4 2.55g KiI2PO4 0.27g NaNO2 1.5g MgSO4 · TiI2O 0.02g CaCL2 ().()019g 离子溶液 IOmL pi I 7.8-8.4 固态加1.5%的琼脂。
[0028] 其中，离子溶液组分：每IL水含FeSO4 · 7H20 lg，EDTA lg。
[0029] 优选的，上述培养基，是由下述方法制备得到的：上述各组分按组方称量好后用水 溶解制成备用培养基，于121°C，0. IlMpa下灭菌20-30min。
[0030] 本发明还提供一种硝化杆菌XY-Ol的培养方法，用上述培养基进行培养。
[0031] 优选的，上述维氏硝化杆菌XY-Ol采用分批补料方式进行培养。更优选的，具体 操作方法为：采用分光光度法测定培养液中的亚硝酸盐氮浓度，当亚硝酸盐氮浓度低于 30mg/L时，补充40%的亚硝酸钠溶液至培养液中亚硝酸盐氮浓度为200-400mg/L左右，培 养至OD 6tltl达到0· 3以上时结束培养。
[0032] 本发明还提供一种上述硝化杆菌XY-Ol在制备水体处理菌剂中的用途。
[0033] 本发明还提供一种菌剂，其中，该菌剂包括上述分离的硝化杆菌XY-Ol菌株。优选 的，该菌剂还包括稳定剂和保护剂。
[0034] 本发明还提供一种菌剂的制备方法，其中，该菌剂由上述硝化杆菌XY-Ol制备而 得。优选的，该制备方法包括（1)硝化杆菌XY-Ol发酵液的浓缩；（2)加入稳定剂和保护剂。
[0035] 优选的，发酵液的浓缩方法为将培养结束时得到的发酵液采用管式离心机浓缩至 原体积的1/10,使其亚硝酸盐氮降解能力达到600mg-N/(L · h)以上，优选可达730mg-N/ (L · h)。
[0036] 优选的，稳定剂是终浓度为0.3%。的亚硝酸钠。保护剂优选为甘油、山梨醇、二甲基 亚砜、海藻糖中的任一种或多种。
[0037] 本发明还提供一种上述硝化杆菌XY-Ol菌株或者所述菌剂在水体处理中的应用。
[0038] 本发明还提供一种水体处理方法，包括在水体中投放上述XY-Ol菌株或者上述菌 齐U。优选的，在好氧条件下，实现其降解亚硝酸盐的作用。
[0039] 优选的，所述水体是养殖水体，更优选的，该养殖水体是富含亚硝酸盐的养殖水 体。优选的，水体中亚硝酸盐氮的浓度范围为=615mg/L，优选的，=400mg/L，更优选的， 兰300mg/L，最优选的，兰200mg/L。
[0040] 优选的，所述菌株或者菌剂的接种量为每立方米水体6-2500mL(接种比例为 0. 006%。-2. 5%。），优选的接种量为每立方米水体10_2500mL (接种比例为0. 01%。-2. 5%〇)， 更优选的接种量为每立方米水体100_2500mL (接种比例为0. 1%。-2. 5%。），其中菌株或者菌 剂的OD6c?至少3,优选大于3,其亚硝酸盐氮降解能力达到600mg-NAL ·1ι)以上，优选可达 730mg-N/(L · h)。
[0041] 本发明的有益效果是：
[0042] 本发明提供了一种维氏硝化杆菌XY-Ol (保藏号为CGMCC 10171)，并能够实现其 高密度培养，培养产物经浓缩后可用于养殖水体中亚硝酸盐的降解，降解的亚硝酸盐浓度 高，降解速率快，去除率接近100%。与物理、化学方法相比具有效果持久、不引入其它污染 物等优点，在水产养殖领域有广泛的应用前景。
[0043] 保藏信息
[0044] 分类名词：维氏硝化杆菌（Nitrobacter winogradskyi)
[0045] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)
[0046] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0047] 保藏日期：2014年12月15日
[0048] 保藏号：CGMCC 10171
【附图说明】
[0049] 图1为维氏硝化杆菌XY-Ol培养液亚硝酸盐氮降解曲线
[0050] 图2为维氏硝化杆菌XY-Ol接种比2. 5%。条件下亚硝酸盐氮降解曲线
[0051] 图3为维氏硝化杆菌XY-Ol接种比0. 01 %。条件下亚硝酸盐氮降解曲线
【具体实施方式】
[0052] 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0053] 在下面的实施例中所用的菌种均为维氏硝化杆菌XY-01，实施例中不同的培养基 及溶液配方如下：
[0054] L 富集培养基：NaNO2O. 5g，NaCl 0· 3g，MgSO4O. 14g，KH2PO4O. 136g，NaHCO3L 6g， FeSO4O. 03g，蒸馏水 lOOOmL，pH 8. 4
[0055] 2.发酵培养基 I :Na2HP04l. 7g，KH2PO4O. 18g，NaNO2O. 3g，MgSO4 · 7H20 0· Olg， CaCL2O. 001g，离子溶液 lmL，pH 7. 3，
[0056] 离子溶液组分：FeS04 · 7H20 lg，EDTA lg，水 1L。
[0057] 3.发酵培养基 2 :Na2HP042. 55g，KH2PO4O. 27g，NaNO2L 2g，MgSO4 · 7H20 0· 02g， CaCL2O. 0019g，离子溶液 10mL，pH 8. 4，
[0058] 离子溶液组分：FeS04 · 7H20 lg，EDTA lg，水 1L。
[0059] 4.发酵培养基 3 :Na2HP043. 2g