专利名称：一株哌嗪降解无色杆菌菌mbpq-cg及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境微生物技术领域，具体的，涉及一种哌嗪降解无色杆菌MBPQ-CG及其应用。
背景技术：
胺类化合物可看成是氨分子中的氢原子被烃基取代后所得到的产物。许多胺类化合物在医药、工业、农业等领域都有广泛的应用。有机胺的大量使用，势必会对环境造成污染进而危害人类健康。低级胺有浓重的像氨的难闻气味，如三甲胺则有难闻鱼腥味。低级脂肪胺易溶于水，它们在水中的溶解度和气味则随分子量的增加而减小。芳香胺为液体或固体，有难闻的气味。结构较简单的芳胺微溶于水、较复杂的不溶。芳胺有较大的毒性，吸入蒸气或经皮肤渗入都能导致中毒。联苯胺还有致癌的作用。有机胺进入环境中，一些易被生物降解，另些不易被降解的便对环境产生破坏。哌嗪是一种有机胺类化合物，是重要的医药中间体和精细化工原料，哌嗪与有机酸或无机酸生成的盐广泛用作人和动物的驱虫剂，有机酸盐主要用于人体，而无机盐则多作为兽药。哌嗪主要用途是用作医药中间体，用于生产氟哌酸、吡哌酸、强痛定、利福平等药物。哌嗪衍生物中的N-甲基哌嗪、N-乙基哌嗪、2-甲基哌嗪、氨乙基哌嗪、轻乙基哌嗪等，也在制药、表面活性剂、合成纤维中有广泛应用。此外，哌嗪还可作为橡胶硫化剂、抗氧剂、防腐剂、表面活性剂、合成树脂、合成纤维、合成皮革等的原料，用途极为广泛。近年来，随着我国医药工业和精细化工的迅速发展，对哌嗪及其衍生物的需求量急剧上升，其中以无水哌嗪价值为最高，应用最广。生物降解是自然界中胺类物质去除的主要途径，目前国内尚没有哌嗪高效降解菌的研究报道，因此，从哌嗪污染的环境中分离出高效降解哌嗪的微生物菌株，利用微生物的作用修复环境中的哌嗪污染具有重大的理论意义和潜在的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的哌嗪降解菌固定化技术，使用此降解菌固定化小球可以降解废水中的哌嗪，使哌嗪残留量大大降低，使废水达标排放，同时降低处理成本。本发明提供一种消除哌嗪的降解菌，其菌株MBPQ-CG是一株革兰氏染色反应阴性菌，于2013年I月15日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(简称〇6皿0:，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC N0.7139,经鉴定为无色杆菌属(Achromobacter sp.)。主要生物学特性为革兰氏阴性，杆状，无芽孢，有运动性，接触酶、氧化酶都为阳性。哌嗪降解菌MBPQ-CG在LB培养基中培养两天后的特征是:菌落表明突起，光滑，边缘整齐，乳黄色，不透明。所述的LB培养基的成分是:酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，pH 7.0。
本发明提供了无色杆菌MBPQ-CG在哌嗪降解中的应用。该菌能以哌嗪为唯一碳源和氮源进行生长。在实验室摇瓶培养条件下哌嗪的降解率达100%。本发明还提供了所述无色杆菌MBPQ-CG制备的固定化小球。本发明还提供了一种菌株MBPQ-CG制备成固定化小球的方法，包括下列步骤:
1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于LB液体培养基中于30°C，160r/min条件下振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌液于8000r/min的条件下离心2min,倒掉上清液,加入相同体积的无菌水，摇勻后8000r/min离心2min,如此洗两遍,用相同体积的无菌水悬浮,制成菌体液。3)取0.7ml菌体与20ml的4%海藻酸钠溶液于常温混匀，然后用注射器将混合液滴入常温下的3%CaCl2溶液，于4°C交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，无菌水洗两遍保存于4°C备用。所述步骤I)中的LB培养基组成=NaCl 10.0g/L,蛋白胨10.0g/L,酵母粉5.0g/L, pH7.0。本发明还提供了 上述方法制备的固定化小球在哌嗪降解中的应用。所述固定化小球在哌嗪降解中的应用方法是:在温度为28±2°C、pH值为6.8-7.2的适宜条件下，在哌嗪进水浓度低于400mg/L的情况下,每升哌嗪废水加入5%的固定化微生物小球来处理，同时，水力停留时间为80h，在这种情况下哌嗪的去除率在99%以上，有较好的去除效果。本发明所述的无色杆菌MBPQ-CG，实验室生物降解实验结果表明，对250mg/L哌嗪的降解率达到100%。该发明生产的降解菌MBPQ-CG的固定化小球具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在含有哌嗪的废水处理中推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，降低废水处理成本具有重要的意义。
图1为降解菌MBPQ-CG菌落照片；
图2为降解菌MBPQ-CG菌体结晶紫染色照片；
图3为降解菌固定化小球形态；
图4为不同进水的哌嗪浓度下固定化小球对哌嗪的降解；
图5为不同的停留时间下固定化小球对哌嗪的降解。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1菌株的分离和鉴定
取哌嗪富集菌液，进行梯度稀释。稀释液涂布于含100mg/L哌嗪的无机盐固体培养基上，其配方为:每升含 1.5 g K2HP04、0.5 g ΚΗ2Ρ04、0.2 g MgSO4X7H20、1.0 g NaCl、18g 琼月旨，pH 7.0，30°C培养数天。从中挑取单菌落验证其降解效果，将降解效率较高的一株菌株保存，进行后续实验。其菌落图片见图1，鉴定为无色(杆)菌属(Achromobacter sp.);命名为:MBPQ-CG。其结晶紫染色照片如图2所示，主要生物学特性为革兰氏阴性，杆状，无芽孢，有运动性，接触酶、氧化酶都为阳性。能以哌嗪为唯一碳源和氮源进行生长，并将其彻底矿化。在实验室摇瓶条件下对250mg/L哌嗪的降解率达100%。实施例2菌株MBPQ-CG制备成固定化小球的方法
1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于LB液体培养基中于30°C，160r/min条件下振荡培养至对数期；所述的LB培养基为=NaCl 10.0g/L,蛋白胨10.0g/L,酵母粉
5.0g/L, pH7.0;
2)将上述培养好的菌液于8000r/min的条件下离心2min,倒掉上清液,加入相同体积的无菌水，摇勻后8000r/min离心2min,如此洗两遍,用相同体积的无菌水悬浮,制成菌体液；
3)取0.7ml菌体液与20ml的4%海藻酸钠溶液于常温混匀，然后用注射器将混合液滴入常温下的3%CaCl2溶液，于4°C交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，如图3所示，无菌水洗两遍保存于4°C备用。实施例3固定化小球在哌嗪降解中的应用方法
在温度为28±2°C、pH值为6.8-7.2的适宜条件下，在哌嗪进水浓度低于400mg/L的情况下，每升哌嗪废水加入5%的固定化微生物小球来处理，同时，水力停留时间为80h，在这种情况下哌嗪的去除率在99%以上，有较好的去除效果。具体如图4和图5所示，其中，图4显示了对于不同进水浓度的哌嗪的去除情况，研究表明，哌嗪的去除率随着进水浓度的升高而降低，当进水的哌嗪浓度在低 于400mg/l的范围内时，哌嗪都有较高的去除率，可以达到99%以上；图4显示了在温度为28±2°C、pH值为7.0左右的适宜条件下，在哌嗪进水浓度低于400mg/L的情况下，每升哌嗪废水加入5%的固定化微生物小球来处理，同时，水力停留时间为80h，二乙胺的去除率在99%以上，有较好的去除效果。
权利要求
1.一株哌嗪降解无色杆菌{Achromobacter sp.)菌株MBPQ-CG,其保藏编号为CGMCCN0.7139。
2.权利要求1所述的无色杆菌MBPQ-CG在哌嗪降解中的应用。
3.含有权利要求1所述的无色杆菌MBPQ-CG制备的固定化小球。
4.权利要求1所述的无色杆菌MBPQ-CG制备成固定化小球的方法，包括下列步骤: 1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于LB液体培养基中于30°C，160r/min条件下振荡培养至对数期； 2)将上述培养好的菌液于8000r/min的条件下离心2min,倒掉上清液,加入相同体积的无菌水，摇勻后8000r/min离心2min,如此洗两遍,用相同体积的无菌水悬浮,制成菌体液； 3)取0.7ml菌体与2 0ml的4%海藻酸钠溶液于常温混匀，然后用注射器将混合液滴入常温下的3%CaCl2溶液，于4°C交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，无菌水洗两遍保存于4°C备用。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤I)中的LB培养基组成=NaCl10.0g/L,蛋白胨 10.0g/L，酵母粉 5.0g/L，pH7.0。
6.权利要求4或5所述的固定化小球在哌嗪降解中的应用。
7.根据权利要求6所述的固定化小球在哌嗪降解中的应用，具体为:所述固定化小球在哌嗪降解中的应用方法是■ 在温度为28±2°C、pH值为6.8-7.2的适宜条件下，在哌嗪进水浓度低于400mg/L的情况下，每升哌嗪废水加入5%的固定化微生物小球来处理，同时，水力停留时间为80h。
全文摘要
本发明提供一种消除哌嗪残留的降解菌剂，属于生物高技术领域。所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌MBPQ-CG，经鉴定为无色杆菌属(Achromobactersp.)。主要生物学特性为革兰氏阴性，杆状，无芽孢，有运动性，接触酶、氧化酶都为阳性。该菌能以哌嗪为唯一碳源和氮源进行生长，并将其彻底矿化。在实验室摇瓶条件下该菌株能在30小时之内将250mg/L哌嗪降解到检测不到的水平，解决了废水处理中哌嗪难生物降解的问题。
文档编号C12R1/025GK103114068SQ20131008331
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者张永乐, 顾乔梅, 蔡双梅, 高益民 申请人:江苏南资环保科技有限公司