一类二硫桥二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用图
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及用一株青霉Penicilliumsp.HDN13-309(保藏单位：中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所，100101保藏编号：CGMCC9429保藏日期：2014年7月9日）生产含二硫桥二酮 哌嗪类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在抗肿瘤方面的用途。
【背景技术】：
[0002] 本发明人从菌株青霉Penicilliumsp.HDN13-309(保藏编号是：CGMCC9429)液 体发酵产物中分离出一类含二硫桥二酮哌嗪类化合物。研究发现所示化合物具有抗肿瘤活 性，目前尚未见该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有 与此有关的药物。
【发明内容】
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[0003] 本发明旨在提供一种结构新颖的具有高抗肿瘤活性的新化合物。其结构式是
[0004]
[0005] 本发明的式I和II化合物可通过微生物发酵培养来获取含有该类化合物的发酵 物，然后从发酵物中采用S印hadexLH20凝胶柱层析，中压MPLC，半制备HPLC等方法分离 纯化得到。本发明的下述实施例中列举了利用青霉Penicilliumsp.HDN13-309(保藏编号 是：CGMCC9429)制备本发明式I和II化合物的实例。
【具体实施方式】：
[0006] 在如下的实施例中所指的化合物I和II的化学结构（结构式中的阿拉伯数字是 化学结构中碳原子的标位）是：
[0007]
[0008]
[0009] 实施例1化合物I和II的发酵生产及分离精制
[0010] 1发酵生产
[0011] 生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取菌株青霉Penicillium sp.HDN13-309 (保藏编号是：CGMCC9426)适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28摄氏 度培养箱中培养5天。
[0012] 取斜面培养5天的菌株青霉Penicilliumsp.HDN13-309适量，接种到装有300mL 培养基[培养基组成（克/升）：麦芽糖20. 0,葡萄糖10. 0,甘露醇20. 0,味精10. 0,酵母 膏3.0，玉米浆1.0，腿2?040 . 5，]\%504.71120 0.3，口11调节至6.5]的 10001^锥型瓶中，在28 摄氏度条件下静置培养30天，获得发酵产物。
[0013] 2浸膏的获得
[0014] 用纱布将发酵液和菌丝体分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓缩至无丙酮，所 得水相用等量乙酸乙酯萃取三次。发酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相， 减压浓缩，得粗浸膏，共8克。
[0015] 3化合物的分离精制
[0016] 浸膏（8克）用甲醇溶解后，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行正相硅胶分离，分为 6个组分，然后组分4以甲醇为溶剂进行LH20柱层析，分为5个流份。组分5先以C-180DS 中压柱层析，以甲醇-水为溶剂进行梯度洗脱，最后经反相半制备高效液相色谱（甲醇：水 =55 : 45)得化合物I(10mg)和II(4mg)。
[0017]化合物I白色固体，分子式C19H16N205S2,HR-ESI-MSm/z:417. 0582[M+H]+，计算值 417. 0573。IR(KBr)vnax 3512,1661，1625,1606,1426,1384,1098,1030, 709,670,652cmi。4 和13C-NMR数据见表1。
[0018]化合物II白色固体，分子式C19H16N206S2,HR-ESI-MSm/z:433. 0535 [M+H]+，计算值 433. 0523。IR(KBr)vnax 3520,1667,1630,1601，1438,1383,1095,1035, 709,677,655cmmi。 虫和13C-NMR数据见表1
[0019]表 1 化合物I(inCD30D)和II(ind6-DMS0)的1H和13CNMR数据（500 和 125MHz) a
[0020]
[0021] a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用 DEPT方法确定并分别用s(单重峰）、d(二重峰）、t(三重峰）和q(四重峰）表示。
[0022] 实施例2化合物的抗肿瘤活性测试
[0023] 1实验样品及实验方法
[0024] 被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物I和II纯品。 精密称取适量样品，用DMS0配制成所需浓度的溶液，供测活性。
[0025] SRB法：取对数生长期的Hela、HCT116、H0-8910和MGC803细胞用新鲜的 RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2X105个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于 96孔板中，每孔加入2yL不同浓度的样品或空白溶液，37°C下培养72小时。取药物作用下 培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期 抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征。每孔细胞中加入80 %三氯醋酸50yL，置于4°C 固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0. 4%SRB的醋酸溶液50yL并在室温静 置30分钟。用1 %醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150yLTris 缓冲液（10mm〇l/L，pH10. 5)溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRAMAXPlus型酶 标仪测定每孔在520nm处的光密度（0D)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三 孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔（如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零）。 各孔0D值先做相应无细胞调零，再取三孔平均0D值按IR% = (0D空自对-0D样) /0D空白对 X100%式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率（IR% )，并采用bliss法计算出半数抑制 率IC50。
[0026] MTT法：取对数生长期的HL-60和K562肿瘤细胞，将细胞密度调至每毫升2X105 个细胞，按每孔200yL加到96孔细胞培养板中，于37°C通入5% 0)2的培养箱中培养4h。 样品分别设定5个浓度梯度，每个浓度设3个平行样，同时设阳性、阴性对照，每孔加样品液 或空白液各2yL，培养72h，然后每孔加MTT液10yL，继续培养4小时，37°C、2000转/分 钟离心8分钟，吸去上清。每孔加入DMSO各100yL，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶 完全溶解后，酶标仪测定每孔570nm处的吸光值（0D值）。取三孔平均0D值按IR% = (0D 空白对照-0D样品）/0D空白对照X100%式计算样品对细胞增殖的抑制率（IR% )，并采用bliss法 计算出半数抑制率IC5。。
[0027] 2实验结果
[0028] 表2化合物I和II对多种肿瘤细胞的体外细胞毒活性
[0029]
[0030] 3 结论
[0031] 化合物I和II具有较好的抗肿瘤活性，对多种肿瘤细胞模型均有抑制活性，这为 开发新型抗癌药提供了化合物基础。
【主权项】
1. 化合物结构如下式所示化合物IR=H化合物IIR=OH2. 权利要求1所述化合物的制备方法，其特征是发酵培养青霉Penici11ium sp.HDN13-309(保藏编号是：CGMCC9429)获取含有上述化合物的发酵物，然后从发酵物中 分离纯化出该类化合物。3. 权利要求2所述的制备方法，其中将所述发酵物经SephadexLH20凝胶柱层析，甲醇 为溶剂，再经反相中压MPLC及反相半制备HPLC分离纯化得该类化合物。4. 权利要求1所述化合物在抗肿瘤方面的用途。
【专利摘要】本发明涉及一类二硫桥二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途。本发明从菌株青霉Penicillium？sp.HDN13-309中生产出一类新的二硫桥二酮哌嗪类化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。CGMCC No.942920140709
【IPC分类】A61P35/00, C12R1/80, C07D513/20, C12P17/18
【公开号】CN105037396
【申请号】CN201510063693
【发明人】李德海, 朱美林, 顾谦群, 朱天骄, 李静, 车茜
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年2月5日