专利名称：新的融合标签进行水稻转基因快速筛选的方法
技术领域：
本发明属于植物育种领域，具体而言，本发明涉及带有融合标签的植物转基因转化载体及使用其的植物转基因的筛选方法等。
背景技术：
植物(尤其是水稻)转基因技术中最为繁琐的步骤是后期转化子(株)的筛选。目前主要借助标记基因筛选转化子，其中，标记基因主要分为2类:选择基因和报告基因。选择基因主要包括抗生素抗性基因(如HPT基因，Gent基因等)和抗除草剂基因。然而，使用选择基因作为标记基因的筛选方法会有部分假阳性植株，还需要进一步提取植物基因组，借助PCR等方法检测。常用的报告基因是β -葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase gene, gus)、gfp等。这些基因能够进行可视化筛选，但是主要问题是它们较大，导致T-DNA转化载体变大，转化效率降低，而为了提高转化效率不得不设计在不同启动子和/或终止子控制下的开放阅读框(ORF)。更加困难的是，转基因植物往往背景复杂，有可能导入过多次外源基因，由于植物转基因常用启动子和终止子类型有限而且同源性较高，加之目的基因的同源性也较高，如果重复使用相同的启动子和终止子，可能会导致转化时发生遗传重组，尤其是保留了标签而失去了目的基因的同源重组，给后期高成本筛选带来了更大的难度，而要设计不同启动子和/或终止子控制，则更加 难以在实践中操作。为此，本发明人经过长期而艰苦的研究，凭借一些运气，发明了新的融合标签，兼有选择基因和报告基因的功能，既能对潮霉素具有抗性，又有可视化特性，在水稻遗传转化过程的愈伤筛选和转基因植株生长阶段都可以观察，大幅提高筛选正确性；而且，该标签较小，且仅需要一个启动子和一个终止子控制，无需设计多个启动子和/或终止子。尤其是，本发明人还在启动子和终止子的选择及序列作了新的优化，不同于现有技术的，配合本发明的融合标签使用，构建成的转化载体不容易发生同源重组，不容易发生仅保留标签的同源重组，从而使得筛选本身稳定，更能够快速有效的筛选和鉴定转基因阳性植株，尤其是水稻植株。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的带有融合标签的植物转基因转化载体，其标签较小，从而便于在一个启动子和一个终止子下就能控制较大的目的基因的转化，而且采用了可视化标签，更便于筛选，配合启动子和终止子，更能够快速有效的筛选和鉴定转基因阳性植株。另外，本发明还提供了新的植物转基因的筛选方法和植物转基因的方法等。具体而言，在第一方面，本发明提供了带有融合标签的植物转基因转化载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该载体是环形载体，即首尾的核苷酸是相连的，连接成环形。
该载体的多克隆位点有Sac1、KpnI, SmaI, XmaI, Acc65I和BamHI等，足够满足作为植物转化载体之用。这些多克隆载体涵盖了常用且成本低的内切酶，与常用的克隆载体的酶切位点对应，为向植物转化目的基因提供了便利。在第二方面，本发明提供了鉴定细菌体中带有在本发明第一方面所述的载体的方法，其使用聚合酶链反应(PCR)直接扩增细菌体，其中PCR引物对如下所示:tttccttcctcttttctacagt,和gtaatgcagaagaagaccatggo本发明第一方面所述的载体在菌体中克隆的过程中，尤其是成线形化的状态时，会有自连的情况发生，为此需要进行鉴定；但是，成为环形后就不会有自连情况发生。除了测序等高成本的方法，采用本发明第二方面的方法进行鉴定，是成本低且方便、快捷的手段。当然，优选本发明第二方面的方法，其还进一步包括对PCR直接扩增细菌体呈阳性的菌体中载体进行测序的过程。在第三方面，本发明提供了植物转基因的筛选方法，其包括，(I)将需要转入植物的基因克隆入本发明第一方面所述的载体；(2)转化入农杆菌；
(3)对植物愈伤组织进行转化；(4)在含潮霉素的培养基中培养植物愈伤组织；和(5)检测植物愈伤组织发出的荧光。相应地，在第四方面，本发明还提供了植物转基因的方法，其包括，(I)将需要转入植物的基因克隆入本发明第一方面所述的载体；(2)转化入农杆菌；( 3)对植物愈伤组织进行转化；(4)在含潮霉素的培养基中培养植物愈伤组织；和( 5 )检测植物愈伤组织发出的荧光，保留检测阳性的愈伤组织。优选本发明第三或第四方面所述的方法，其还进一步包括检测植物愈伤组织发育成的植物苗发出的荧光。这样能够进一步植物培育阶段的初期，在时间、人力、场地和试剂成本都较大的阶段到来前，尽可能使得保证转化的正确率(本发明人根据本发明的方法，还未发现假阳性的结果产生)，从而防止在成本较大的阶段做无用功，造成更大的损失。优选本发明第三或第四方面所述的方法中，植物是水稻。优选本发明第三或第四方面所述的方法中，荧光是红色荧光。这样，在本发明第三方面所述的方法中，筛选阳性的植物愈伤组织是发出红色荧光的愈伤组织；相应地，在本发明第四方面所述的方法中，保留发出红色荧光的愈伤组织。更优选本发明第三方面所述的方法，其还进一步包括检测植物愈伤组织发育成的植物苗发出的荧光，筛选阳性的植物苗是根部发出红色荧光的植物苗。相应地，也更优选本发明第四方面所述的方法，其还进一步包括检测植物愈伤组织发育成的植物苗发出的荧光，保留根部发出红色荧光的植物苗。在第五方面，本发明提供了引物对，其核苷酸序列如下所示:tttccttcctcttttctacagt,和
gtaatgcagaagaagaccatggo该引物对可以用于鉴定细菌体中是否带有在本发明第一方面所述的载体。本发明的有益效果在于:保留对潮霉素具有抗性，又能可视化便于检测观察；在植物遗传转化过程的愈伤筛选和转基因植株生长阶段都可以观察，而且大幅提高筛选正确率；而且，该标签较小，仅需要一个启动子和一个终止子就能完全控制，无需设计多个启动子和/或终止子的0RF，相应地，可以将更大的目的基因转入植物，而不降低转化率；构建成的转化载体不容易发生同源重组，更不容易发生仅保留标签的同源重组，使得筛选本身稳定，从而更能够快速有效的筛选和鉴定转基因阳性植株，尤其是水稻植株。为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
图1为转基因水稻的鉴定结果图，其中(a)为选择培养20天的转基因愈伤组织；(b)选择培养30天的转基因的愈伤组织；(c)发芽7天的T1代转基因植株；(d)转基因水稻T1代苗的根，其中每组左边为自然光下拍摄，右边为荧光照射筛选的照片。
具体实施例方式以下通过具 体的实施例进行说明，其中未特别详细说明的过程、材料、试剂均为本领域技术人员所熟知的，可以从商业渠道购买或委托加工，也可以参见分子克隆和植物组培的书籍或实验手册，如其中植物培养基可以参考潘素君等.核农学报.2006，20 (4): 263-268，筛选和转化的细节可以参考Hiei Y, Ohta S，KomariT,Kumashiro T, 1994.Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.PlantJournal6，271。实施例1改造pCAMBIA1300-UR载体用于T-DNA转化载体构建我们在现有载体pCAMBIA1300的基础上，设计了新的融合标签，并配合以新设计的启动子和终止子序列，改造了新的PCAMBIA1300-UR载体(简称为1300-UR，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该核苷酸为环形序列)。该改造过程委托宁波农科院，参照《分子克隆实验指南》的PCR和点突变技术来进行，然后转化大肠杆菌DH5a。为了挑选阳性转化子，提高测序命中效率，尤其是排除载体自连的情况，在转化子进行测序前，首先需进行菌液PCR，其中需合成如下两条特异性检测引物:Check_Ftttccttcctcttttctacagt CheckmmR gtaatgcagaagaagaccatgg
PCR检测体系和条件如下:
权利要求
1.带有融合标签的植物转基因转化载体，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.权利要求1所述的载体，其为环形载体。
3.权利要求1所述的载体，其多克隆位点有Sac1、Kpn1、Sma1、Xma1、Acc65I和BamHI。
4.鉴定细菌体中带有权利要求1-3之任一所述的载体的方法，其使用聚合酶链反应(PCR)直接扩增细菌体，其中PCR引物对如下所示: tttccttcctcttttctacagt,和 gtaatgcagaagaagaccatgg。
5.植物转基因的 筛选方法，其包括， (1)将需要转入植物的基因克隆入权利要求1-3之任一所述的载体； (2)转化入农杆菌； (3)对植物愈伤组织进行转化； (4)在含潮霉素的培养基中培养植物愈伤组织；和 (5)检测植物愈伤组织发出的荧光。
6.植物转基因的方法，其包括， (1)将需要转入植物的基因克隆入权利要求1-3之任一所述的载体； (2)转化入农杆菌； (3)对植物愈伤组织进行转化； (4)在含潮霉素的培养基中培养植物愈伤组织；和 (5)检测植物愈伤组织发出的荧光，保留检测阳性的愈伤组织。
7.权利要求5或6所述的方法，其还进一步包括检测植物愈伤组织发育成的植物苗发出的荧光。
8.权利要求5或6所述的方法，其中植物是水稻。
9.权利要求5或6所述的方法,其中突光是红色突光。
10.引物对，其核苷酸序列如下所示: tttccttcctcttttctacagt,和 gtaatgcagaagaagaccatggo
全文摘要
本发明公开了新的带有融合标签的植物转基因转化载体，其能够快速有效的筛选和鉴定转基因阳性植株；另外，本发明还提供了新的植物转基因的筛选方法和植物转基因的方法等。
文档编号C12N15/84GK103173488SQ201310082668
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月14日 优先权日2013年3月14日
发明者周洁, 严成其, 杨勇, 王栩鸣, 余初浪, 程晔, 陈剑平 申请人:浙江省农业科学院