专利名称：一种无动物源的淋巴细胞无血清培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，特别涉及一种化学成分明确、无动物源的淋巴细胞无血清
培养基。
背景技术：
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传统的手术、放疗、化疗的弊端，已经被认为是二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段。细胞免疫治疗是采集人体免疫细胞(主要为淋巴细胞)，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。体外培养、扩增淋巴细胞使用最大的试剂是培养基，培养基为细胞的生长扩增提供了基本的环境，包括适宜的渗透压，为淋巴细胞的扩增提供生长所必需的营养成分，包括氨基酸、无机盐、微量元素、维生素等，同时也保护淋巴细胞免受代谢过程中产生的毒性物质的损害。传统的淋巴细胞的扩增体系，主要是基础培养基添加一定浓度的胎牛血清(FBS)。尽管欧洲等允许使用FBS，但中国，美国等国家严禁在细胞治疗中使用动物源成分。FBS中含有异种蛋白质，它本身有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险。另外，有研究表明淋巴细胞在培养过程中可以吞噬培养基中的蛋白，内含有牛血清蛋白，可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注细胞治疗后治疗失效。因此FBS在细胞临床大规模培养中的不利因素已经逐渐暴露出来，现已有很多学者研究淋巴细胞的无血清培养基。一些公司也已经开发了淋巴细胞无血清培养基.如LONZA公司开发X-VIVO无血清培养基、奥地利PAA公司开发QUANTUM-007淋巴细胞无血清培养基等。但这些无血清培养基成分不明确,且价格昂贵,这大大的增加了免疫细胞治疗的成本，不利于广泛应用的推广。而且QUANTUM-007淋巴细胞无血清培养基含有动物源成分(说明书)。我们提供了一种淋巴细胞无血清培养基，这种培养基化学成分明确，无动物源，无血清。此类培养基是目前最安全、最为理想的培养基，首先可以保证培养基批次间的一致性，其次是培养基的性质明确，有助于进一步研究淋巴细胞的作用机制。这种培养基的开发能极大推动免疫细胞治疗标准化培养，也节约了生产成本。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种无血清培养基，组成为MDM 17.7 g/L、L-谷氨酰胺1-5 mM、碳酸氢钠3.024 g/L、重组人胰岛素1_10 mg/L、人转铁蛋白5_20 mg/L、人血清白蛋白4-10 g/L、2-巯基乙醇55 uM、N-乙酰-半胱氨酸100-300 mg/ml、脂质
0.1-0.5%、氨基酸1_5%、维生素1-5%、微量兀素0.1-0.5%、氢化可的松Ι-lOng/ml、乙醇胺l-5mg/l、非必需氨基酸1-5%、柠檬酸铁l-10mg/L。
更优选地，本发明所述无血清培养基其必要组成为MDM 17.7 g/L、L_谷氨酰胺5禮、碳酸氢钠3.024 g/L、N-乙酰-半胱氨酸160mg/L、重组人胰岛素10 mg/L、人转铁蛋白10 mg/L、人血清白蛋白5 g/L、2-巯基乙醇55 uM、氢化可的松40ug/L、脂质0.1%、氨基酸2%、维生素1%、微量元素1%、非必需氨基酸1%、柠檬酸铁l-10mg/L。用本发明提供的无动物源、无血清培养基与QUANTUM-007淋巴细胞无血清培养基、X-VIVO无血清培养基培淋巴细胞相比，结果显示，其细胞扩增倍数、细胞活率要好于这两种培养基，细胞表型结果也显示辅助性T细胞和调节性T细胞的比例高于这两种培养基，在一定比例下，本发明的无血清培养基扩增的CIK细胞杀瘤率高于这两种培养基，而且避免了动物成分和批次的不稳定性。本发明提供了一种化学成分明确、无动物源、无血清淋巴细胞培养基，此培养基是目前最安全、最为理想的培养基，首先可以保证培养基批次间的一致性，其次是培养基的性质明确，有助于进一步研究淋巴细胞扩增情况。移植的淋巴细胞通过多种细胞因子与微环境相互作用以达到彼此适应，微环境中基质细胞产生细胞因子对移植后淋巴细胞的趋化、归巢、活化及存活均起着重要的作用，而且培养基无动物源成分，可以避免在细胞培养的过程中引入动物成分，干扰细胞生长。
图1为实施例中A、B、C无血清培养基培养脐血CIK细胞形态图；图2为实施例中A、B、C无血清培养基培养外周血CIK细胞形态图；图3为实施例中A、B、C无血清培养基培养脐血CIK扩增倍数；图4为实施例中A、B、 C无血清培养基培养外周血CIK扩增倍数；图5为实施例中A、B、C无血清培养基培养脐血CIK细胞活力；图6为实施例中A、B、C无血清培养基培养脐血CIK21天后细胞表型；图7为实施例中A、B、C无血清培养基培养外周血CIK21天后细胞表型；图8为实施例中A、B、C无血清培养基培养脐血CIK21天后细胞杀瘤率；
具体实施例方式本发明公开了一种无动物源的淋巴细胞无血清培养基，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的无动物源的淋巴细胞无血清培养基及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1:培养基的配制重组人胰岛素储存液的配制:称取IOOmg重组人胰岛素溶于40mL注射用水中，滴加2M HCl至重组人胰岛素完全溶解，定容至50mL，配制成20mg/mL的储存液，4°C保存。人转铁蛋白储存液的配制:称取IOOmg人转铁蛋白溶于40mL注射用水中，至完全溶解后定容至50mL，配制成20mg/mL的储存液，4°C保存。本发明所述培养基成分如下:
权利要求
1.一种无血清培养基，其必要组成为頂DM 17.7 g/L、L-谷氨酰胺1-5 mM、碳酸氢钠3.024 g/L、重组人胰岛素1-10 mg/L、人转铁蛋白5-20 mg/L、人血清白蛋白1-10 g/L、2-巯基乙醇55 uM、N-乙酰-半胱氨酸100-300 mg/mL、脂质0.1-0.5%、氨基酸1_5%、维生素1_5%、微量兀素0.1-0.5%、氢化可的松Ι-lOng/mL、乙醇胺l_5mg/L、非必需氨基酸1_5%、柠檬酸铁l-10mg/L。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，其必要组成为MDM17.7 g/L、L-谷氨酰胺5 mM、碳酸氢钠3.024 g/L、N_乙酰-半胱氨酸160mg/L、重组人胰岛素10 mg/L、人转铁蛋白10 mg/L、人血清白蛋白5 g/L、2-巯基乙醇55 uM、氢化可的松40ug/L、脂质0.1%、氨基酸2%、维生素1%、微量元素1%、非必需氨基酸1%、柠檬酸铁2mg/L。
3.权利要求1-2任一项所述无血清培养 基培养淋巴细胞。
全文摘要
本发明涉及生物领域，公开了一种无动物源的无血清培养基，其必要组成为IMDM、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人血清白蛋白、2-巯基乙醇、N-乙酰-半胱氨酸、脂质、氨基酸、维生素、微量元素、柠檬酸铁、氢化可的松、乙醇胺、非必需氨基酸。本发明所述无血清培养基化学成分明确、无动物源、无血清，培养细胞安全、理想，避免了掺杂动物成分和批次的不稳定性，培养淋巴细胞结果显示其细胞总数、细胞表型均正常，具有良好的工业应用前景。
文档编号C12N5/078GK103146648SQ20131008216
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月14日 优先权日2013年3月14日
发明者武晓云, 吕岩, 康会彦 申请人:北京京蒙高科干细胞技术有限公司