专利名称：用于促进油菜生长的促生菌及其微生物有机肥料的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于促进油菜生长的促生菌株及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术领域。
背景技术：
油菜是我国重要的油料作物，在国民经济建设中占有重要的地位。促进油菜生长，提高油菜产量始终是农业经济中的重要话题。在油菜种植过程中，由于长期大量的化肥投入，破坏了油菜生长的土壤环境，土壤生物活性严重下降，土壤有益微生物种类减少、数量逐减，导致油菜产量连年下降。因此，开发促进油菜生长的新型肥料，对于油料作物的生产
至关重要。我国作物秸杆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥产品的原料；大量的养分资源流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如何将从土壤中因作物收获而带走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。如果将这些固体有机废弃物高温发酵制备成腐熟堆肥，再将其用作制备生物(含特定有益微生物)有机肥料的载体将会有很好的应用前景。生物有机肥是指特定功能微生物与主要以动植物残体(如农作物秸杆、畜禽粪便等)为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。其本质特征是含有特定功能的、表现出一定肥料效应的有益微生物，这些特定有益微生物的生命活动是生物有机肥优于其它肥料的关键因素。大量研究表明:农业生产中生物有机肥在增强作物抗逆性、提供作物养分、增加肥效、改善作物对养分的吸收、调节土壤酸碱度等方面发挥着积极的作用。本研究拟从油菜长期生长的田块中生长健康的油菜植株根系 及根际土壤(冬季，土壤温度在零度左右)中筛选促生菌株，再与腐熟堆肥和其他合适载体采用合适的工艺生产促进油菜生长微生物有机肥料，为油菜规模化生产提供技术产品。
发明内容
1.技术问题本发明的目的在于提供用于促进油菜生长的促生菌及其微生物有机肥料，促生功能明显，能确保集约化农业的顺利发展。2.技术方案用于促进油菜生长的促生菌NJZJSB3，均属解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens), 2012年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，NJZJB3的菌种保藏号为CGMCC N0.6966。NJZJSB3菌株的主要生物学特性为菌体革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，端生芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、氧化酶阴性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，发酵葡萄糖、果糖、纤维二糖、蔗糖、糊精、半乳糖、甘露醇、木糖产酸产气，不发酵山梨醇，可以利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性。用上述促进油菜生长的促生菌所生产的微生物有机肥料，该微生物有机肥料中含有lX108cfu/g以上的NJZJSB3、全氮含量质量比为4 5%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6 10%、有机质含量质量比不低于45%。所述微生物有机肥料的生产方法，其特征为:(I)将权利要求1所述的促生菌NJZJSB3，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:培养液为NA培养基，pH6.0 7.0，发酵温度范围30 35°C，搅拌速度为180 300转/分钟，发酵时间为48hr.，发酵液的含菌或芽孢量> lX1010cfu/ml ;所用NA培养液配制方法为(以配制IL培养基为例):葡萄糖IOg,蛋白胨5g,牛肉膏3g,酵母粉0.5g,定容至1000ml, pH 值调至 7.2-7.4，115°C灭菌 30min。(2)将腐熟的猪粪堆肥和菜柏的微生物酶解混合物按质量比6: 4的比例混合均匀。再将上述NJZJSB3发酵液按50L/吨的量接种到腐熟的猪粪和菜柏微生物酶解混合物的6: 4的混合物中进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆I次，温度不超过50°C，发酵7天，发酵结束后促生菌NJZJSB3含量达到I X 108cfu/g以上，获得促生菌NJZJSB3的猪粪堆肥和菜柏微生物酶解混合物的固体混合菌剂。最后在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为能促进油菜植株生长的微生物有机肥。其中，所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 45%，有机氮质量比含量为1.2-2.0%，含水量质量比25-30% ；菜柏的微生物酶解混合物制备方法为，将保藏号为CGMCC N0.1543的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1发酵液加入到菜柏原料中，调节含水量55-65%和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65%和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物PH调整为5.0，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜柏的微生物酶解混合物；所用腐熟后的鸡粪堆肥其发芽指数为98%以上，有机质质量比含量彡45%，有机氮质量比含量为2-3%，含水量为25-30%。3.有益效果本发明与目前市场上的有机肥料产品相比具有如下优点:I)该肥料产品中含有促进油菜生长的专一性高效菌株NJZJSB3，其促生效果非常显著。试验结果表明，油菜生长促生率达到114.7 % 154.6 %，如果连年这样施用，可以有效提高油菜的产量。2)该肥料为有机肥，含有丰富的有机质(30 35%)，有机氮含量为4%，而且大部分为氨基酸和小分子多肽。本产品总磷含量为4.0%，而且生物有效性特别高，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。3)由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学肥料的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于农产品的出口。同时，该微生物肥料还有增产功能，可为农民增加收入。
4)该微生物有机肥可以在营养钵使用，也可以在大田使用，不仅具有有机肥的功能，而且其中所含的促生菌通过多种促生机制起作用，从而达到促进油菜生长的效果。
四
图1复筛NJZJSB3对油菜苗生长的影响(注:CK:单施化肥；0F 为B3中的有机肥-猪粪堆肥与菜柏堆肥按一定比例混合的混合物；B3:为含有NJZJSB3的生物有机肥)图2含促生菌NJZJSB3的生物有机肥对油菜幼苗生长的影响(注:CK:单施化肥；0F 为B3中的有机肥-猪粪堆肥与菜柏堆肥按一定比例混合的混合物；B3:为含有NJZJSB3的生物有机肥)图3促生菌株NJZJSB3的形态特征生物保藏菌株NJZJSB3,为解淀粉芽抱杆菌属(Bacillus amyloliquefaciens), 2012 年 12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中国科学院微生物研究所，NJZJB3的菌种保藏号为=CGMCC N0.6966。
五具体实施例方式(一 )促生菌株的分离促生菌株的初筛:采集紫金山森林土壤十字花科植物根际土壤，80°C水浴30min，采用稀释涂布技术初筛芽孢杆菌， 初筛共获得5株促生菌株，将菌种冻干_20°C保存，用于进一步筛选。促生菌株的复筛:取初筛后的促生菌，在NA液体培养液中培养48h后，8000rpm/min离心，等量无菌水重悬，获得彡I X 1010cfu/ml菌悬液，一半菌悬液121°C灭活20min。将长势相当的油菜做如下处理:处理1:苗根系部分在清水中浸泡IOmin ;处理2:苗根系部分在121°C灭活20min菌悬液中浸泡IOmin ;处理3:苗根系部分在正常菌悬液中浸泡lOmin。将经过处理的油菜苗分别种到装有300g灭菌土壤的营养钵中，观察测试促生菌对油菜幼苗生长情况的影响。最终筛选得到菌株NJZJSB3，NJZJSB3菌株的促生效果图1。( 二)促生菌株的鉴定促生菌株NJZJSB3鉴定为解淀粉芽孢杆菌属(Bacillus amyloliquefaciens)。NJZJSB3菌株的主要生物学特性为菌体革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，端生芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，发酵葡萄糖、果糖、纤维二糖、蔗糖、糊精、半乳糖、甘露醇、木糖产酸产气，不发酵山梨醇，可以利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性。(三)茵剂生产(I)将促生菌株NJZJSB3，接种到NA培养液中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:pH6.0 7.0，发酵温度范围30 35°C，搅拌速度为180 300转/分钟，发酵时间为48hr.，发酵液的含菌或芽孢量彡lX1010cfu/mL.
(2)将NJZJSB3发酵液按50L/吨的量接种到腐熟的猪粪堆肥和菜柏的微生物分解混合物按质量比6: 4混合物中进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆I次，温度不超过500C，发酵7天，发酵结束后促生菌NJZJSB3含量均达到I X 108cfu/g以上，获得含促生菌株NJZJSB3的猪粪堆肥和经微生物分解过的菜柏堆肥混合物的固体菌剂。最后在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为能促进油菜生长的微生物有机肥。所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质含量> 45%，有机氮含量为 1.2-2.0 %，含水量 25-30 %。该微生物有机肥料(促进油菜生长的专用微生物有机肥)中含有I X IO8个/g以上的NJZJSB3、全氮含量质量比为4 5%，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6 10%、有机质含量质量比不低于45%。其中经微生物分解过的菜柏堆肥的制备方法为(公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品)，菌株37_1发酵液加入到菜柏原料中，调节含水量55-65%和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C (共5天)，固体发酵开始后，堆物的PH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65 %和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物pH调整为5.0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜柏的微生物分解混合物(含氨基酸的混合材料)一菜柏堆肥。(四)盆栽促生试验试验设3个处理:CK:化肥对照，未施用有机肥或微生物有机肥；0F:为B3中的有机肥-猪粪堆肥与菜柏堆肥按一定比例混合的混合物；B3:施用含促生菌NJZJSB3的微生物有机肥。微生物有机肥料用量:油菜育苗时按土重的2%施用(育苗时所用的土壤均为健康土壤)，待油菜长至第2片真叶时将其移栽到油菜连作土壤中，油菜苗移栽前，连作土壤中微生物有机肥料用量也按土重I %的用量施入。所有处理的氮磷钾用量一致，常规管理。20天之后观察其生长情 况，确认促生菌株是否有促进油菜生长的效果。经观察发现，随着油菜生长时间的延长，施用含促生菌NJZJSB3的微生物有机肥处理(B3)，其长势远好于施用化肥(CK)和有机肥(OF)的油菜苗(表1、图1、图2、)。与CK比较，施用含有NJZJSB3促生菌的微生物有机肥后，油菜地上部、地下部及整株鲜重分别重17.64g/株、2.42g/株和20.06g/株，地上部、地下部及单株的促生率分别为154.6%、114.7%和148.4%。与OF比较，施用含有NJZJSB3促生菌的微生物有机肥后，油菜地上部、地下部和整株鲜重分别重12.65g/株1.95g/株和14.60g/株，地上部、地下部和整株的促生率分别为77.1%、75.6%和76.9%。表I施用含NJZJSB3促生菌株的微生物有机肥对油菜地上部生长的影响
处理地上部鲜重(g/株)地下部鲜重(g/株)总鲜重(g/株)
CK 11.41+1.59 b 2.11+0.62 b 13.52+2.16 b OF 16.40+2.37 b 2.58+0.92 ab 18.98+3.32 b B3_29.05+2.12 a_4.53+0.65 a_33.58+2.06a注:CK:单施化肥；0F:为B3中的有机肥-猪粪堆肥与菜柏堆肥按一定比例混合的混合物；B3:为含有NJZJSB3的生物有机肥)
本发明专利从促进油菜幼苗生长这一关键问题着手(表1、图1、图2)，研制出一种能显著促进油菜生长的微生物有机肥料产品，与单施化肥(CK)比较，促生率分别达154.6% (地上部)、114.7% (地下部)和148.4% (单株)。本肥料产品的作用机制在于本肥料产品中的有效碳和有效氮源给产品中的功能菌微生物区系的培育提供了很好的条件，使之迅速建立外源有益功能菌微生物的生态及其食物链；另一方面，本肥料产品中含有较高含量的有机氮和有机磷，这些营养物质对油菜的生长十分有利，大大提高了油菜作物的立苗率和抗逆能力。
权利要求
1.用于促进油菜生长的促生菌，该菌株NJZJSB3，为解淀粉芽孢杆菌属(Bacillusamyloliquefaciens), 2012年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，NJZJB3的菌种保藏号为:CGMCC N0.6966。
NJZJSB3菌株的主要生物学特性为菌体革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，端生芽孢，兼性厌氧生长，接触酶阳性、V.P.反应阳性，甲基红试验阴性，发酵葡萄糖、果糖、纤维二糖、蔗糖、糊精、半乳糖、甘露醇、木糖产酸产气，不发酵山梨醇，可以利用柠檬酸盐，硝酸还原酶阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，分解酪蛋白阳性。
2.用权利要求1所述用于促进油菜生长的促生菌所生产的微生物有机肥料，该微生物有机肥料中含有lX108cfu/g以上的NJZJSB3、全氮含量质量比为4 5%，全氮中质量比90%以上为有机氮,总氮磷钾养分质量比为6 10%、有机质含量质量比不低于45%。
3.权利要求2所述微生物有机肥料的生产方法，其特征为: (1)将权利要求1所述的拮抗菌NJZJSB3，分别接种到NA培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:pH6.0 7.0，发酵温度范围30 35 °C，搅拌速度为180 300转/分钟，发酵时间为48hr.，发酵液的含菌或芽孢量> lX1010cfu/ml ;所用NA培养液配制方法为，葡萄糖10g，蛋白 胨5g，牛肉膏3g，酵母粉0.5g，定容至1000ml, pH值调至7.2-7.4，115°C灭菌 30min ； (2)将腐熟的猪粪堆肥和菜柏的微生物酶解混合物按质量比6: 4的比例混合均勻。再将上述NJZJSB3发酵液按50L/吨的量接种到腐熟的猪粪和菜柏微生物酶解混合物的6: 4的混合物中进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆I次，温度不超过50°C，发酵7天，发酵结束后促生菌NJZJSB3含量达到I X 108cfu/g以上，获得促生菌NJZJSB3的猪粪堆肥和菜柏微生物酶解混合物的固体混合菌剂。最后在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为能促进油菜植株生长的微生物有机肥；其中 所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 45%，有机氮质量比含量为1.2-2.0%，含水量质量比25-30% ； 菜柏的微生物酶解混合物制备方法为，将保藏号为CGMCC N0.1543的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1发酵液加入到菜柏原料中，调节含水量55-65%和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65%和6.0-7.0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物PH调整为5.0,再进行低温干燥或自然凉干，即为菜柏的微生物酶解混合物；所用腐熟后的鸡粪堆肥其发芽指数为98%以上，有机质质量比含量^ 45%，有机氮质量比含量为2-3%，含水量为25-30%。
4.权利要求2或3所述微生物有机肥料的应用。
全文摘要
本发明涉及用于油菜生长的促生菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了一株拮抗菌NJZJSB3，接种到腐熟的猪粪堆肥和菜粕的微生物分解混合物中进行固体发酵制成微生物有机肥料，肥料中含有1×108cfu/g以上的促生菌、全氮含量为4～5％(90％以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6～10％、有机质含量不低于45％。试验结果表明，油菜的地上部、地下部和整株鲜重增重分别达到154.6％、114.7％和148.4％，如果连年这样施用，可以有效地促进油菜生长。
文档编号C12R1/07GK103173387SQ20131008109
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月14日 优先权日2013年3月14日
发明者沈其荣, 黄启为, 吴云成, 凌宁 申请人:南京农业大学