专利名称：一株章鱼肠道内产蛋白酶菌株及其蛋白酶的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一株章鱼肠道内产蛋白酶菌株及其蛋白酶的应用。
背景技术：
我国水域辽阔，鱼类资源十分丰富，水产品加工的过程中，必然会产生大量的下脚料，这些废弃物中含有丰富的蛋白质、磷脂质、软骨素、维生素等。如果不进行有效的处理，不仅会造成环境的污染，而且浪费了宝贵的蛋白质资源。目前，这些废弃物的利用仅限于加工成鱼粉、饲料等低值制品，未能充分利用蛋白质资源。随着现代生物工程技术的高速发展，酶工程技术在食品工业中的应用也越来越广泛。国内外常用的蛋白酶主要是植物来源的蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等)，动物来源的蛋白酶(胃蛋白酶、胰·蛋白酶、糜蛋白酶等)和微生物产生的碱性蛋白酶。但是应用于下脚料的酶解中的研究报道甚少。国内有酶法水解烤鳗和罗非鱼下脚料中的报道[1_2]。国外也已经有报道对小沙丁鱼和乌贼等下脚料的酶解报道，并指出酶解产物的生物活性，如抗氧化火性、抗菌活性、乳化作用等[3_5]。本发明以章鱼为供试材料进行肠道产蛋白酶菌株的分离，其属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、八腕目(Octopoda)、章鱼科(Octopodidae)、章鱼属(Octopus) [6]。广泛分布于我国南、北沿岸海域。我国常见的种类有饭蛸(短蛸，0.0cellatus),长腕蛾(长蛾,0.variabilis)和真蛾(0.vulgaris)等。章鱼对温度的适应范围广泛，属于喜盐动物，其食性广泛，以肉食为主，尤其喜食蟹类、海蛞蝓和贝类，不同种之间存在着一定差异[7]。鱼类肠道菌群是机体生长发育等生命活动的影响因素之一[8_9]。研究表明，肠道菌群是在与宿主共同进化过程中形成的正常组成部分，并且与消化、营养以及急慢性感染等有关[1°-12]。近年来，国内外学者对鱼类病原细菌分离鉴定研究较多，而对于鱼类肠道细菌报道不太多，特别是章鱼肠道细菌的分离鉴定研究，目前尚未见文献报道。而且肠道细菌的研究主要是分离鉴定和产酶能力方面，针对下脚料上的应用未见报道。国内对鱼类肠道中产蛋白酶细菌的研究报道主要是菌株的分离。许提森从健康鲈鱼肠道中共筛选出18株产蛋白酶的益生菌，其中4株的产酶活力特别强[13]。王富强等从牙鲆鱼肠道内分离25株产蛋白酶菌株，其中Y2-2菌株对牙鲆幼鱼生长有促进作用[14_15]。冯新忠等从额尔齐斯河野生丁(鐡)中分离40株产蛋白酶的菌株，其中8株蛋白水解圈较大[16]。另外国内还有军曹鱼、九孔鲍、牡蛎、黄鳝、草鱼、银鲫鱼等肠道中也分离了产蛋白酶菌株[17」1]。国外对内脏蛋白酶的研究比较多，但专门研究内生菌产的蛋白酶的研究并不多。Sudeepa从海产内脏中分离得到了蛋白酶产生菌[22], Bhaskar进一步利用这种菌发酵产生碱性蛋白酶[23] ;IzVek0Va也研究了淡水鳕肠道中的共生微生物会产生蛋白酶，并可以帮助寄主消化[24]。Esakkiraj等鲻鱼肠道中分离了产蛋白酶活性的蜡状芽孢杆菌，该菌产生的蛋白酶的最佳pH为7.0，最佳温度为60°C，为下脚料的精加工及去污剂工业上的应用可能性提供了科学依据[25]。Izvekova等从梭子鱼中分离蛋白酶活性的5株菌株[26]。参考文献[I]黄志勇，赖海涛，许伟雄，等.酶法提取烤鳗下脚料中水解动物蛋白的研究.食品科学，2002, 23 (10): 76-78.
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发明内容
本发明以章鱼为供试材料，从其肠道中进行产蛋白酶菌株的分离。通过酪蛋白培养基对菌株进行培养，观察其产生的透明圈(图1)，筛选出具产酶能力菌株L-2。提取的该菌株基因组DNA经1%和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增后，经检测产物均在1500bp左右，条带清晰，无杂带，可用于菌株16S rDNA序列的测定(图2)。测序结果在NCBI基因序列数据库上通过Blast进行序列比对,为交替假单胞菌(Pseudoalteromonasokeanokoites)。章鱼肠道内产蛋白酶菌株，交替假单胞菌菌株L-2，保藏编号CGMCCN0.6638。所述的章鱼肠道内产蛋白酶菌株发酵蛋白酶在洗涤剂中的应用。蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，可以在机体内自然产生，主要存在于动物内脏、植物茎叶、果实、微生物细胞等。蛋白酶种类繁多，商品蛋白酶不下100种。不同来源的蛋白酶在工业上有不同的用途。蛋白酶已广泛使用在皮革、毛纺、丝绸、日化、食品、酿造、医药等许多行业中。在食品工业中利用蛋白酶制剂，可以避免酸水解、碱水解对氨基酸的破坏作用及变旋，保证蛋白质的营养价值不受影响。
图1为L-2菌的酪蛋白透明圈；图2为16S rRNA基因PCR扩增产物； 图3为蛋白酶的SDS-PAGE电泳；
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。I)微生物本身以章鱼为供试材料，从其肠道中进行产蛋白酶菌株的分离。通过酪蛋白培养基对菌株进行培养，观察其产生的透明圈(图1)，筛选出具产酶能力菌株L-2。提取的该菌株基因组DNA经1%和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增后，经检测产物均在1500bp左右，条带清晰，无杂带，可用于菌株16S rDNA序列的测定(图2)。测序结果在NCBI基因序列数据库上通过Blast进行序列比对，为交替假单胞菌(Pseudoalteromonas okeanokoites)。交替假单胞菌(Pseudoalteromonasokeanokoites)菌株 L-2 已经于 2012 年 9月28日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC N0.6638，分类命名为Pseudoalteromonasokeanokoites)。2)微生物的培养方法或繁殖方法本发明通过平板划线分离法从章鱼胃肠道中筛选获得一株高产酶活力菌株交替假单胞菌(Pseudoalteromonas okeanokoites)菌株L-2。并通过单因素实验对该菌株进行摇瓶发酵条件的优化，确定了适于该菌最佳产酶条件的培养基配方及培养条件。(I)培养基的组成与配制:蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%，磷酸高铁0.01%，淀粉0.5%，ρΗ7.6 7.8，海水配制。(2)发酵步骤:取3-4环菌种，接于发酵培养液中，发酵24h，制备种子液，以4%的接种量，发酵温度为19°C，pH7.0，转速180r/min，发酵时间84h，酶活力最高达1250U/mL。3.发酵产物如图3所示，该菌株产的蛋白酶在SDS-PAGE电泳上显示有4条亮带，条带较宽，说明至少有4种蛋白酶，分子量范围30.1 144.9kDa。4.微生物发酵产物的用途洗涤剂中的应用试验在洗涤剂中加入蛋白酶能使衣服等上的血迹、汗迹、奶迹等含蛋白质等之类的污垢分解成可溶性氨基酸等小分子物质，使不溶物变为可溶。常用的酶制剂是碱性蛋白酶。本实验为P.0keanokoites L2蛋白酶在洗漆剂中的应用提供理论依据。4.1、抗氧化性
取300 μ I的发酵产物样品与300 μ I浓度为1%、5%、10%、15%的H2O2在40°C下分别处理15min、45min、75min取样测活性。结果如表I。当浓度为5%的H2O2处理15min后，P.0keanokoites L2蛋白酶的活性保持86.01%,处理75min后保持57.16%,甚至15%的H2O2处理15min后还能保持45.58%的活性。P.0keanokoites L2蛋白酶对常用漂白剂H2O2的稳定性特点说明此酶应用在蛋白酶工程的可能性。表I H2O2浓度对P.0keanokoites L2蛋白酶活性影响
权利要求
1.章鱼肠道内产蛋白酶菌株，交替假单胞菌菌株L-2，保藏编号CGMCCN0.6638。
2.根据权利要 求1所述的章鱼肠道内产蛋白酶菌株发酵蛋白酶在洗涤剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株章鱼肠道内产蛋白酶菌株及其蛋白酶的应用，保藏编号CGMCC No.6638。蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，可以在机体内自然产生，主要存在于动物内脏、植物茎叶、果实、微生物细胞等。蛋白酶种类繁多，商品蛋白酶不下100种。不同来源的蛋白酶在工业上有不同的用途。蛋白酶已广泛使用在皮革、毛纺、丝绸、日化、食品、酿造、医药等许多行业中。在食品工业中利用蛋白酶制剂，可以避免酸水解、碱水解对氨基酸的破坏作用及变旋，保证蛋白质的营养价值不受影响。
文档编号C12R1/38GK103146612SQ20131008079
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者金玉兰, 朴美子, 曲田丽, 王玉荣 申请人:青岛农业大学