专利名称：猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针试剂盒，属于兽用生物制品制造领域。
背景技术：
猪痕(classicalswine fever, CSF)是由猪痕病毒(classical swine fevervirus, CSFV)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，HCL在世界养猪国家有不同程度流行，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病(王琴.猪瘟病毒流行病学、病原致病特性及猪瘟综合防制研究.中国农业科技导报，2006,8(5):13_18)。HCLV 是黄病毒科(Flaviviridae)痕病毒属(Pestivirus)的一个成员。病毒基因组为单股正链RNA，全长12.3kb，包括一个大的0RF，编码由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，此多聚蛋白又进一步被加工成4个成熟的结构蛋白(C、E0、EU E2)和 7 个非结构蛋白(Npro, NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B) (RumenapfT, Meyers G,Stark R, et al.Molecu lar characterization of hog cholera virus.Arch virol Suppl.1991,3:7-18 ；Van Ri jn P A, Van Gennip H G P, Moormann R JM.An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostictest both based on envelope glycoprotein E2 of classicalswine fever (CSFV).Vaccine, 1999，17:433-440)。1955年我国研制出用经人工诱变获得的猪瘟病毒兔化弱毒(HCLV)株(又称C株)制备的猪瘟活疫苗，该疫苗具有高度安全性和优良的免疫原性至今仍在世界范围内被广泛应用(仇华吉，童光志，沈荣显.猪瘟兔化弱毒疫苗-半个世纪的回顾.中国农业科学，2005，38 (8): 1675-1685)，该疫苗对控制猪瘟起到了重要作用，在预防猪瘟方面做出了巨大贡献。因此，疫苗合格与否十分重要，因此疫苗的质量也变得至关重要。检测疫苗质量的关键指标就是疫苗的效价，因此对疫苗的准确完全定量显得极为重要。HCLV可以在PK-15、ST等多种细胞上生长，但是均不产生细胞病变(CPE)。因此，迄今为止对猪瘟弱毒疫苗中的病毒含量还没有一个稳定的重复性好定量方法。在过去60多年中，兔体定型热反应法一直是对其疫苗效价测定的经典方法。但是该方法需要时间太长，并且实验中有很多不可控制的因素影响结果的可靠性和稳定性。特别是兔子对疫苗病毒热反应的个体差异性会显著影响检测结果。。但是至今却不能为该疫苗完全定量，近年来国内外建立了数种检测方法，特别是荧光定量RT-PCR技术应用于检测CSFV的比较多(温国元，万超.应用荧光定量PCR技术快速定量检测猪瘟病毒.武汉大学学报:理学版，2004，50 (6):746-750 ；Hoffmann B,Beer M, Schelp C，et al.Validation of a real-time RT-PCRassay for sensitive and specific detection of classical swine fever.J VirolMethods, 2005, 130(1-2):36-44 ;高博，杨晓农，子掌辉，等.快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立应用.西南民族大学学报:自然科学版，2009，35(1):92-97 ;朱中武，黄萍，鲁杏华，等.实时荧光RT-PCR快速检测猪源性食品中猪瘟病毒的研究.中国预防兽医学报，2009，31(8):627-630)，但这些方法都不是完全定量的方法。目前建立的Taq-Man实时荧光定量RT-PCR方法可以对疫苗中的病毒核酸做定量，并且具有很高的灵敏度。但是该方法不能将疫苗中的有复制能力的活病毒粒子与死亡的病毒粒子区别开来，不能区别具有感染力和不具有感染力的病毒，还是没有实现对疫苗所必须的活病毒的定量。RT-PCR作为一种先进的生物学技术具有很高灵敏度已经被广泛应用于猪瘟病毒病原(罗廷荣，莫扬，吴文德，等.RT-CR技术诊断猪瘟的应用研究.中国预防兽医学报，2003，25(3):219-222)和其他传染源的鉴定和临床诊断，但不能用于定量。而且该方法同样也难以区分疫苗中具有感染力和不具有感染力的病毒。并且还容易出现非特性产物，电泳后在凝胶成像仪下看到的条带不一定就是目的条带，易出现假阳性。同时，在凝胶成像仪下看不到目的条带也不一定就是阴性结果，因为电泳能看到的条带最少也是IOng级别，因此也容易出现假阴性，如同本实验的结果，RT-PCR的产物电泳后虽然除阳性对照外看不到任何条带.但是如果结合斑点杂交，结果却是不同，不仅解决了特异性的问题，也提高了灵敏度。本实验标记的HCLV-E2基因的核酸探针可以检测到RT-PCR产物的I 2pg的水平。
发明内容
本发明建立的定量方法是先将以不同稀释度的疫苗接种于ST细胞后用RT-PCR结合斑点杂交检测每个细胞孔的感染状态，具有准确，灵敏，特异的特点，是一个完全的定量方法。疫苗接种于细胞后可以除去无感染力细胞的干扰，实验中所标记的探针的重复性和稳定性较好。斑点杂交是一种特异性强、灵敏的检测技术，操作简单，结果易于判断。利用斑点杂交对鸡传染性贫血病毒(刘岳龙，崔治中，段玉友.PCR和斑点杂交检测鸡传染性贫血病毒.中国兽医学报，1996，16 (I): 38-41)、犬瘟热病毒(王宏俊，丁少忠.核酸探针检测犬瘟热病毒方法的建立和初步应用.中国兽药杂志.2006, 40 (5): 19-22)等多种病毒成功做了相应的地高辛标记探针。地高辛是一种非放射性物质，对人及环境没有危害。此外,核酸探针检测法操作简便，一次可同时检测多个样品，且在检测时，对仪器的要求不高，特别适宜于基层的掌握和使用，因此，该方法不仅可以用于猪瘟兔化弱毒疫苗的定量，也可以作为一种猪瘟的检测方法和流行病学调查的手段在基层使用。将疫苗接种于ST细胞，可以排除掉疫苗中不具有感染力的死病毒，具有准确的特点；RT-PCR可以扩增HCLV核酸片段，具有增强敏感度的特点；斑点杂交不仅敏感，而且具有很高的特异性，操作简单。上世纪90年代本发明人就用核酸探针检出I型马立克氏病毒(崔治中.用非放射性DNA探针从感染鸡羽毛囊中检出I型马立克氏病病毒.中国兽医科技，1992，22(9): 20-21)，因此，本发明将三者(接种细胞、RT-PCR和斑点杂交)的优势巧妙的结合在一起，组成了一种对HCLV完全的定量方法，该方法的特点就是准确，敏感，特异，完全，应用该方法对某疫苗公司不同批次的疫苗进行了检测，得到了理想的结果。本发明的技术方案
1.本发明所涉及的一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法包括:(1)是以HCLV-E2基因片段质粒为模板，用序列I和序列2所述序列的引物HCLV-F1/HCLV-R1进行扩增，采用地高辛标记技术将扩增产物制备成地高辛标记HCLV-E2DNA 探针；(2)以从24孔培养板上的被不同稀释度猪瘟活疫苗感染的ST细胞提取的RNA为模板用序列3和序列4所述序列的一对引物HCLV-F2/HCLV-R2进行RT-PCR ；(3)通过斑点杂交，根据在硝酸纤维膜点样后的显色，狄高辛标记的特异性核酸探针可检测经猪瘟活疫苗感染的ST细胞中猪瘟兔化弱毒病毒的特异性核酸的RT-PCR产物存在；(4)根据不同稀释度样本在硝酸纤维膜点样后的显色反应，计算疫苗中以TCID5tl/头份为单位的猪痕兔化弱毒病毒的含量。
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2.本发明所述的猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法用于测定的以TCID5tl/头份为单位的猪瘟兔化弱毒病毒定量结果作为猪瘟活疫苗效力检验的质量标准。3.一种实施本发明猪瘟病毒兔化弱毒株病毒含量测定的猪瘟病毒兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒，含有:(I)经狄高辛标记的HCLV-E2DNA探针；(2)未感染的正常ST细胞提取RNA的RT-PCR产物做为阴性对照和猪瘟兔化弱毒病毒感染的ST细胞提取RNA的RT-PCR产物做为阳性对照；(3)用于样品RNA扩增的一对特异性引物，其序列如序列3、序列4所示；(4)硝酸纤维膜、封闭试剂、NCPI溶液、NBT溶液和20XSSC溶液。4.本发明所涉及的猪瘟兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒可用于猪瘟活疫苗成品检验中的效价检验；也可用于猪瘟病毒的检测和流行病学调查。
具体实施例方式1.HCLV-E2DNA探针制备和探针特异性与灵敏度的检测
(I)PCR法制备地高辛标记HCLV-E2DNA探针以HCLV-E2基因片段质粒(由中国人民解放军军事兽医研究所涂长春研究员惠赠)为模板，用表I中的HCLV-F1/HCLV-R1引物扩增，出现预期450bp目的条带(
图1)。PCR产物经测序无误后，回收、纯化及定量，采用地高辛PCR法标记技术，用罗氏公司的试剂盒(PCR DIG Probe Synthesis Kit,Cat.N0.11636090910, Version December2005)进行地高辛标记E2基因片段DNA制备探针，探针标记方法按以上试剂盒操作说明书进行，标记的探针在电泳图谱上明显滞后于普通dNTP扩增产物条带(图2)，说明探针标记成功，同时和DNAMarker条带比较,所标记探针的量大约为30ng/ μ I。表I标记HCLV探针和HCLV株RT-PCR扩增的引物
权利要求
1.一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法，其特征在于: (1)是以HCLV-E2基因片段质粒为模板，用序列I和序列2所述序列的引物HCLV-Fl/HCLV-Rl进行扩增，采用地高辛标记技术将扩增产物制备成地高辛标记HCLV-E2DNA探针； (2)以从24孔培养板上的被不同稀释度猪瘟活疫苗感染的ST细胞提取的RNA为模板用序列3和序列4所述序列的一对引物HCLV-F2/HCLV-R2进行RT-PCR ； (3)通过斑点杂交，根据在硝酸纤维膜点样后的显色，狄高辛标记的特异性核酸探针可检测经猪瘟活疫苗感染的ST细胞中猪瘟兔化弱毒病毒的特异性核酸的RT-PCR产物存在； (4)根据不同稀释度样本在硝酸纤维膜点样后的显色反应，计算疫苗中以TCID5tl/头份为单位的猪痕兔化弱毒病毒的含量。
2.如权利要求1所述一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法的应用，其特征在于用该方法测定的以TCID5tl/头份为单位的猪瘟兔化弱毒病毒定量结果作为猪瘟活疫苗效价检验的质量标准。
3.一种实施权利要求1猪瘟病毒兔化弱毒株病毒含量测定的猪瘟病毒兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒，其特征在于该试剂盒含有: (1)经狄高辛标记的HCLV-E2DNA探针； (2)未感染的正常ST细胞提取RNA的RT-PCR产物做为阴性对照和猪瘟兔化弱毒病毒感染的ST细胞提取RNA的RT-PCR产物做为阳性对照； (3)用于样品RNA扩增的一对特异性引物，其序列如序列3、序列4所示； (4)硝酸纤维膜、封闭试剂、NCPI溶液、NBT溶液和20X SSC溶液。
4.如权利要求3所述一 种猪瘟兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒的应用，其特征在于该试剂盒可用于猪瘟活疫苗成品检验中的效价检验。
5.如权利要求3所述一种猪瘟兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒的应用，其特征在于该试剂盒可用于猪瘟病毒的检测和流行病学调查。
全文摘要
本发明涉及建立一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针试剂盒。本发明采用PCR法制备HCLV特异性地高辛标记的DNA探针，同时将HCLV疫苗梯度稀释后接种于24孔培养板上的ST细胞中，在培养7天后分别从接种各稀释度的不同孔细胞中提取RNA后，用RT-PCR结合斑点杂交的方法检测病毒感染。应用该方法能很好的对疫苗病毒实施以TCID50为单位的准确定量，多次重复实验发现对同一批次疫苗间定量的重复性好，相互结果相差不大(5.3×104TCID50/头份、3.0×104TCID50/头份、3.0×104TCID50/头份)。本发明技术方案的实验结果表明RT-PCR结合斑点杂交定量方法能准确、完全的对疫苗HCLV定量，值得推广应用。
文档编号C12Q1/70GK103146844SQ201310082099
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月14日 优先权日2013年3月14日
发明者崔治中, 马诚太, 赵鹏 申请人:山东农业大学