专利名称：一种用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法
技术领域：
本发明属于兽用生物制品技术领域，尤其是涉及一种用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法。
背景技术：
猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)是一种危害严重的动物病毒，它引起的猪瘟每年给养猪业造成巨大的经济损失。目前世界上主要采用弱毒活疫苗免疫来防治猪瘟，以控制猪瘟的流行。在异源原代细胞中增殖的猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)是目前我国主要的弱毒疫苗。C株是我国五十年代经兔体传代选育出的一株具有良好免疫保护力的疫苗株。由于该疫苗株性能稳定、安全、保护性好，是国际上公认最好也是应用最为广泛的疫苗株。由于应用的需要，我国猪瘟病毒的疫苗生产也由兔脾淋疫苗、全乳兔疫苗逐步过渡到用组织培养生产的细胞疫苗。为避免猪体可能带有的病原体(包括病毒)对疫苗质量的影响，目前生产上使用牛睾丸或羊肾细胞增殖猪瘟兔化弱毒疫苗。由于我国牛群中病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染率很高，几乎是100%，因此用牛睾丸细胞生产猪瘟疫苗，易造成细胞外源病毒污染，且病毒滴度不高，生产工艺不稳定，疫苗批次之间的差异大，严重影响了疫苗的质量；同样，使用羊肾细胞生产猪瘟疫苗，由于羊群中可能存在边界病毒(BDV)，也存在同样的隐患。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、羊边界病毒 (BDV)与猪瘟病毒(HCV)同属于黄病毒科瘟病毒属，三种病毒之间有较密切的抗原性与血清学关系，能互相诱导一定程度的同源病毒抗体，使用污染了 BVDV或BDV的猪瘟细胞疫苗给猪只免疫接种后，BVDV或BDV会对猪瘟疫苗的免疫产生干扰作用，能抑制猪瘟抗体的产生，引起严重的后果。国内一些研究单位和动物疫苗生产厂家尝试使用细胞系生产猪瘟疫苗，从一定程序上可以避免外源病毒污染，提高免疫效果，但是传代细胞存在致瘤的可能性，用于猪瘟疫苗的生产有潜在的食品安全上的危险。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足之处，提供一种用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法。该方法生产工艺简单、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗质量。利用本发明生产的猪瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟强毒攻击能产生完全的免疫保护作用。本发明的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其步骤包括制苗用细胞的选择、制苗用细胞的制备、细胞毒种的繁殖、制苗毒液的繁殖、配苗，分装及冻干，其具体步骤如下1、制苗用细胞的选择为健康乳兔或成年兔的肾脏或睾丸；2、制苗用细胞的制备(1)兔肾(或兔睾丸)的采集和处理先以常水泡湿兔毛，取出后浙干，再放入新洁尔灭液中浸泡30秒钟，经体表消毒后，移入无菌室，以无菌手术采取兔肾(或兔睾丸)，
4迅速放入含400IU/ml青霉素和400 μ g/ml链霉素的汉克氏液中，浸泡30分钟，再用无菌操作除去被膜、肾盂、肾盏、附睾，组织称重后，将其剪成1 2mm小块，用汉克氏液反复冲洗， 至上清液清亮为止；(2)消化将组织块移入消化瓶中，兔肾加入5 6倍(兔睾丸加入6 8倍)组织质量体积比的0. 25%胰酶溶液，塞紧瓶口，置37°C水浴消化60分钟。消化过程中，每隔 10分钟轻摇消化瓶一次，直到组织块周围出现棉絮状时，轻取消化瓶，弃上清，再沿瓶壁缓缓注入汉克氏液(含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml链霉素)，轻洗2次，以除去残存胰酶；(3)细胞分散加入生长液，以玻璃珠振摇法分散细胞。轻摇消化瓶十五次，静止， 待组织沉淀后，将上清细胞悬液经过管道流入已加生长液的内装有四层纱布袋的收集瓶中。如此反复分散3 4次。(4)细胞分装和培养将收集瓶中的细胞悬液充分摇勻后，分装于培养瓶中，补加生长液至瓶容积的1/10，塞紧瓶口，继续培养，形成良好单层时，用于接种病毒(兔肾细胞) 或继续传代(兔睾丸细胞)。(5)细胞传代兔睾丸原代细胞长成单层后，用EDTA-胰酶细胞分散液消化，以 (1 3) (1 5)制成次代细胞悬液，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于接种病毒。(6)细胞检验细胞用于接毒前，按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版) 附录40 44、49页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体、外源病毒生长。3、细胞毒种的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成病毒悬液接种生长良好的上述细胞单层，继续培养；每隔4 5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；细胞毒种的鉴定细胞毒种鉴定须完全符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪完全无副作用，每Iml细胞毒种含病毒 ^ 500, 000个家兔感染量；4、制苗毒液的繁殖取已形成良好单层细胞的上述细胞培养瓶，弃去细胞生长液， 接种含猪瘟兔化弱毒的维持液，继续培养；接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置_15°C以下保存；制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)附录42 44,49页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪完全无副作用，各收次病毒培养液分别用家兔测定，每Iml含病毒> 500，000个家兔感染量；5、配苗、分装及冻干将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器中，加入稳定剂， 同时加入抗生素，充分摇勻，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0. 015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。成品检验按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)进行检验，应符合 “猪瘟活疫苗(细胞源)”的规定，对猪完全无副作用，每头份疫苗含病毒> 7500个家兔感染量。本发明是用猪瘟兔化弱毒株接种兔源细胞，收获细胞培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成的猪瘟活疫苗。上述技术方案中，步骤2、3、4中所述的细胞培养温度是36 37. 5°C。
上述技术方案中，步骤2中所用生长液的配方是90% 92%乳汉液、8% 10% 犊牛血清、加适宜抗生素，pH值调整为7. 0 7. 2。上述技术方案中，步骤3、4中所用维持液的配方是90% 98%乳汉液、2% 4% 犊牛血清或8 10%马血清、加适宜抗生素，pH值调整为7. 2 7. 4。上述技术方案中，步骤3中所述的接种量为含0. 3% 0. 5%脾毒种的维持液。上述技术方案中，4中所述的接种量为含3% 5%生产用细胞毒种或0. 2% 0.3%脾毒种的维持液。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)用兔源易感细胞替代牛睾丸细胞或羊肾细胞制造猪瘟活疫苗，可解决牛、羊源外源病毒污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性；(2)用兔源易感细胞替代传代细胞系制造猪瘟活疫苗，可避免传代细胞系可能致瘤的隐患，疫苗的安全性更高；(3)采用本发明培养的猪瘟细胞毒液病毒含量高，可比现有疫苗的抗原滴度高出 10倍以上。用高滴度的抗原制造的猪瘟活疫苗可以大大提高疫苗的免疫效力，经免疫攻毒试验结果显示，对猪瘟强毒攻击可产生100%保护。
图1是本发明的制备流程图。 具体实施例以下结合说明书附图及具体实施例对本发明作进一步的描述。实施例11、制苗用细胞的选择为健康乳兔或成年兔的肾脏；2、制苗用细胞的制备(1)兔肾的采集和处理先以常水泡湿兔毛，取出后浙干，再放入新洁尔灭液中浸泡30秒钟，经体表消毒后，移入无菌室，以无菌手术采取兔肾，迅速放入含400IU/ml青霉素和400 μ g/ml链霉素的汉克氏液中，浸泡30分钟，再用无菌操作除去被膜、肾盂、肾盖， 组织称重后，将其剪成1 2mm小块，用汉克氏液反复冲洗，至上清液清亮为止；(2)消化将组织块移入消化瓶中，加入5 6倍兔肾质量体积比的0. 25%胰酶溶液，塞紧瓶口，置37°C水浴消化60分钟。消化过程中，每隔10分钟轻摇消化瓶一次，直到组织块周围出现棉絮状时，轻取消化瓶，弃上清，再沿瓶壁缓缓注入汉克氏液(含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml链霉素)，轻洗2次，以除去残存胰酶；(3)细胞分散加入生长液，以玻璃珠振摇法分散细胞。轻摇消化瓶十五次，静止， 待组织沉淀后，将上清细胞悬液经过管道流入已加生长液的内装有四层纱布袋的收集瓶中。如此反复分散3 4次。(4)细胞分装和培养将收集瓶中的细胞悬液充分摇勻后，分装于培养瓶中，补加生长液至瓶容积的1/10，塞紧瓶口，置37. 5°C继续培养，形成良好单层时，用于接种病毒。 一般情况下，每5 7克兔肾组织可制备IOOOml原代细胞悬液。
(5)细胞检验按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)附录40 44、 49页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体、外源病毒生长。3、细胞毒种的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.3%的病毒悬液，接种生长良好的兔肾细胞单层，置37. 5°C继续培养；每隔4 5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；细胞毒种的鉴定细胞毒种鉴定须完全符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪完全无副作用，每Iml细胞毒种含病毒 ^ 500, 000个家兔感染量；4、制苗毒液的繁殖取已形成良好单层细胞的上述细胞培养瓶，弃去生长液，接种含3%生产用细胞毒种或0. 2%脾毒种的维持液，置37. 5°C继续培养；接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置_15°C以下保存；制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)附录42 44,49页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪完全无副作用，各收次病毒培养液分别用家兔测定，每Iml含病毒> 500，000个家兔感染量；5、配苗、分装及冻干将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器中，加入稳定剂， 同时加入抗生素，充分摇勻，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0. 015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。成品检验按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)进行检验，应符合 “猪瘟活疫苗(细胞源)”的规定，对猪完全无副作用，每头份疫苗含病毒> 7500个家兔感染量。上述所用生长液的配方是92%乳汉液、8%犊牛血清、加适宜抗生素，pH值调整为 7. 2。上述所用维持液的配方是98%乳汉液、2%犊牛血清、加适宜抗生素，pH值调整为 7.4。实施例21、制苗用细胞的选择为健康乳兔或成年兔的睾丸；2、制苗用细胞的制备(1)兔睾丸的采集和处理先以常水泡湿兔毛，取出后浙干，再放入新洁尔灭液中浸泡30秒钟，经体表消毒后，移入无菌室，以无菌手术采取兔睾丸，迅速放入含400IU/ ml青霉素和400μ g/ml链霉素的汉克氏液中，浸泡30分钟，再用无菌操作除去被膜、附睾， 组织称重后，将其剪成1 2mm小块，用汉克氏液反复冲洗，至上清液清亮为止；(2)消化将组织块移入消化瓶中，加入6 8倍兔睾丸组织质量体积比的0. 25% 胰酶溶液，塞紧瓶口，置37°C水浴消化60分钟。消化过程中，每隔10分钟轻摇消化瓶一次，直到组织块周围出现棉絮状时，轻取消化瓶，弃上清，再沿瓶壁缓缓注入汉克氏液(含 200IU/ml青霉素和200 μ g/ml链霉素)，轻洗2次，以除去残存胰酶；(3)细胞分散加入生长液，以玻璃珠振摇法分散细胞。轻摇消化瓶十五次，静止， 待组织沉淀后，将上清细胞悬液经过管道流入已加生长液的内装有四层纱布袋的收集瓶中。如此反复分散3 4次。(4)细胞分装和培养将收集瓶中的细胞悬液充分摇勻后，分装于培养瓶中，补加生长液至瓶容积的1/10，塞紧瓶口，36 °C继续培养，形成良好单层时用于传代。一般情况下， 每2克组织可制备IOOOml原代细胞悬液。(5)细胞传代兔睾丸原代细胞长成单层后，用EDTA-胰酶细胞分散液消化，以 (1 3) (1 5)制成次代细胞悬液，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于接种病毒。(6)细胞检验细胞用于接毒前，按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版) 附录40 44、49页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体、外源病毒生长。3、细胞毒种的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0. 4%的病毒悬液，接种生长良好的上述细胞单层，置36°C继续培养；每隔4 5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；细胞毒种的鉴定细胞毒种鉴定须完全符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪完全无副作用，每Iml细胞毒种含病毒 ^ 500, 000个家兔感染量；4、制苗毒液的繁殖取已形成良好单层细胞的上述细胞培养瓶，弃去细胞生长液， 接种含4%生产用细胞毒或0.3%脾毒种的维持液，置36°C继续培养；接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置_15°C以下保存；制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)附录42 44,49页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪完全无副作用，各收次病毒培养液分别用家兔测定，每Iml含病毒> 500，000个家兔感染量；5、配苗、分装及冻干将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器中，加入稳定剂， 同时加入抗生素，充分摇勻，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0. 015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。成品检验按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)进行检验，应符合 “猪瘟活疫苗(细胞源)”的规定，对猪完全无副作用，每头份疫苗含病毒> 7500个家兔感染量。上述所用生长液的配方是90%乳汉液、10%犊牛血清、加适宜抗生素，pH值调整为 7. 0。上述所用维持液的配方是92%乳汉液、8%马血清、加适宜抗生素，pH值调整为 7. 2。为了验证本发明制备得到的猪瘟活疫苗病毒含量高，可以大大提高疫苗的免疫效力，特进行以下实验。一、猪瘟活疫苗(兔肾或兔睾丸细胞源)与猪瘟活疫苗(牛睾丸细胞源)的比较研究报告1、材料1.1试验疫苗本发明的猪瘟活疫苗(兔肾或兔睾丸细胞源)，批号试 201001 (兔肾细胞源)、试201002 (兔肾细胞源)、试201003 (兔睾丸细胞源)。1.2对照疫苗猪瘟活疫苗(牛睾丸细胞源)，购于市场，批号201001、201003、 201004。1. 3试验用兔体重1. 5 3. OKg的健康家兔，购于江苏南京某兔场。
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1. 4试验用猪经中和试验方法检测无猪瘟抗体的健康易感断奶猪，购于江苏省某猪场。注苗前观察5 7日，每日上下午各测温一次，挑选体温、精神、食欲正常者使用。1. 5效检强毒猪瘟病毒石门系强毒。2、方法和结果2.1物理性状检验肉眼观察疫苗物理性状。两组疫苗(各3批)均为乳白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。2. 2无菌检验按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)附录42 44 页进行检验，两组疫苗(各3批)均无菌生长。2. 3支原体检验按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)附录49进行检验，两组疫苗(各3批)均无支原体生长。2.4鉴别检验将疫苗分别用灭菌生理盐水稀释成每Iml毫升含100个兔的最小感染量的病毒悬液，与等量的抗猪瘟病毒特异性血清充分混合，置10 15°C中和1小时， 其间振摇2 3次。同时设立阳性对照组(病毒对照)和阴性对照组(生理盐水)。中和结束后，分别接种家兔2只，每兔耳静脉注射1ml，测温方法及体温反应标准同效力检验项。 结果，除阳性对照组出现热反应外，两组疫苗(各3批)在接种后120小时内均未出现热反应。2. 5外源病毒检验按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)附录40 42页进行，两组疫苗(各3批)均无外源病毒污染。2. 6安全检验用灭菌生理盐水将疫苗稀释成每Iml含6头份疫苗，每批疫苗分别肌肉注射健康易感猪4头，每头5ml (含30个使用剂量)。接种后，每日上下午各测体温观察一次，观察21日。按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)“猪瘟活疫苗(兔源)”中“安全检验”(2)项进行判定，结果见表1。2.7效力检验2. 7. 1用家兔效检用灭菌生理盐水将每头份疫苗稀释750倍、1500倍、3000倍、 7500倍、10000倍，每个稀释度分别耳静脉注射家兔2只，每只1ml。接种后，上下午各测体温一次，48小时后，每隔6小时测体温一次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)“猪瘟活疫苗(兔源)”中“效力检验”⑴项进行判定，结果见表2。2. 7. 3用猪效检将每头份猪瘟活疫苗(兔肾或兔睾丸细胞源)稀释3000倍，每头份猪瘟活疫苗(牛睾丸细胞源)稀释300倍，分别肌肉注射无猪瘟中和抗体的健康易感猪4头，每头1ml。14日后，连同条件相同的对照猪3头，注射猪瘟石门系血毒Iml (IO5最小致死量)，观察16日。结果见表3。2. 8剩余水分检测按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)附录38页进行检验，两组疫苗(各3批)均符合规定。2. 9真空度测定按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2010年版)附录48页进行检验，两组疫苗(各3批)均符合规定。表1安全检验结果
权利要求
1.用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于包括以下技术步骤(1)制苗用细胞的选择为健康乳兔或成年兔的肾脏或睾丸；(2)制苗用细胞的制备A)兔肾(或兔睾丸)的采集和处理先以常水泡湿兔毛，取出后浙干，再放入新洁尔灭液中浸泡30秒钟，经体表消毒后，移入无菌室，以无菌手术采取兔肾(或兔睾丸)，迅速放入含400IU/ml青霉素和400 μ g/ml链霉素的汉克氏液中，浸泡30分钟，再用无菌操作除去被膜、肾盂、肾盏、附睾，组织称重后，将其剪成1 2mm小块，用汉克氏液反复冲洗，至上清液清亮为止；B)消化将组织块移入消化瓶中，兔肾加入5 6倍(兔睾丸加入6 8倍)组织质量体积比的0. 25%胰酶溶液，塞紧瓶口，置37°C水浴消化60分钟。消化过程中，每隔10分钟轻摇消化瓶一次，直到组织块周围出现棉絮状时，轻取消化瓶，弃上清，再沿瓶壁缓缓注入汉克氏液(含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml链霉素)，轻洗2次，以除去残存胰酶；C)细胞分散加入生长液，以玻璃珠振摇法分散细胞。轻摇消化瓶十五次，静止，待组织沉淀后，将上清细胞悬液经过管道流入已加生长液的内装有四层纱布袋的收集瓶中。如此反复分散3 4次。D)细胞分装和培养将收集瓶中的细胞悬液充分摇勻后，分装于培养瓶中，补加生长液至瓶容积的1/10，塞紧瓶口，继续培养，形成良好单层时，用于接种病毒(兔肾细胞)或继续传代(兔睾丸细胞)E)细胞传代兔睾丸原代细胞长成单层后，用EDTA-胰酶细胞分散液消化，以 (1 3) (1 5)制成次代细胞悬液，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于接种病毒。(3)细胞毒种的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成病毒悬液接种生长良好的上述细胞单层，继续培养；每隔4 5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；(4)制苗毒液的繁殖取已形成良好单层细胞的上述细胞培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪瘟兔化弱毒的维持液，继续培养；接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置_15°C以下保存；(5)配苗、分装及冻干将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器中，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇勻，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0. 015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。
2.根据权利要求1所述的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于步骤(2)、(3)、(4)中所述的细胞培养温度是36 37.5°C。
3.根据权利要求1所述的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于步骤(2) 中所用生长液的配方是90% 92%乳汉液、8% 10%犊牛血清、加适宜抗生素，pH值调整为7. 0 7. 2。
4.根据权利要求1所述的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于步骤(3)、(4)中所用维持液的配方是90% 98 %乳汉液、2 % 4 %犊牛血清或8 10 %马血清、加适宜抗生素，PH值调整为7. 2 7. 4。
5.根据权利要求1所述的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于步骤(3)中所述的接种量为含0. 3% 0. 5%脾毒种的维持液。
6.根据权利要求1所述的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于步骤(4) 中所述的接种量为含3% 5%生产用细胞毒种或0. 2% 0. 3%脾毒种的维持液。
全文摘要
本发明的用兔源细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其步骤包括制苗用细胞的选择、制苗用细胞的制备、细胞毒种的繁殖、制苗毒液的繁殖、配苗，分装及冻干，其特征在于用兔源易感细胞替代牛睾丸或羊肾细胞制造猪瘟活疫苗，可解决牛源和羊源外源病毒污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性和有效性；还在于用兔源易感细胞替代传代细胞系制造猪瘟活疫苗，可避免传代细胞系可能致瘤的隐患，疫苗的安全性更高。由于采用本发明培养的猪瘟细胞毒液病毒含量高，可比现有疫苗的抗原滴度高出10倍及以上，可以大大提高疫苗的免疫效力，克服了现行疫苗临床使用中的缺点。
文档编号A61K39/187GK102327610SQ201110288660
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者吴旋, 柯浩 申请人:南京创启生物科技有限公司