专利名称：一种制备猪瘟活疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用激流灌注式生物反应器制备猪瘟活疫苗的方法，属于生物技术领域
背景技术：
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)俗称“烂肠瘟”，在美国称为猪霍乱，欧洲一些地区称为古典猪瘟。本病是由猪瘟病毒引起的一种急性热性全身性败血性传染病,各种年龄猪只均可发病，病程从急性到慢性等多种多样。一年四季流行，传染性极强，具有高度发病率和死亡率，一旦发生具有毁灭性，严重地威胁养猪业的发展和影响人民的生活。在猪病中，猪瘟是危害最大、最受重视的一种病，此病被国际兽医卫生组织法定为必检的A类16种传染病之一，在我国被列为一类传染病。我国研制的猪瘟病毒兔化弱毒(C株)是国际公认的最佳猪瘟病毒疫苗株，已被欧洲很多国家采用，有效的控制了猪瘟的流行。近年来猪瘟常有免疫失败的报道，其原因虽然很多，但疫苗的质量有很重要的影响。猪瘟活疫苗的传统转瓶培养或静置培养工艺虽已沿袭数年，但难以摆脱效价不稳定，批间差异大，病毒滴度低等弊病，极大地限制了猪瘟活疫
苗的质量与产量。近几年，随着兽用疫苗行业的发展，生物反应器被广泛关注，利用生物反应器替代传统的转瓶生产工艺已成为行业发展的趋势。国内已有应用生物反应器生产猪瘟活疫苗的研究报道。从行业整体发展来看，应用生物反应器生产猪瘟活疫苗比转瓶工艺有很大的进步，但在生产工艺优化与成本控制等方面均有很大的发展空间。应用激流灌注式生物反应器生产猪瘟活疫苗的研究未见报道。`
发明内容
本发明的目的是提供一种利用激流灌注式生物反应器制备猪瘟活疫苗的方法。由以下技术方案实现的:
一种制备猪瘟活疫苗的方法，它利用激流灌注式生物反应器作为培养工具，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵、第二蠕动泵、第三蠕动泵、第一硅胶管、第二硅胶管、第三硅胶管、有孔硅胶管、纸片载体、灌注袋、混匀器与激流罐；其中，混匀器是具有加热或保温功能、并能对内部液体进行混匀的罐状装置；所述反应器中液体的流向为:灌注袋——娃胶管一混匀器一硅胶管一激流罐一硅胶管一灌注袋；
活疫苗制备按以下步骤进行:
a.细胞接种
将细胞悬液即猪睾丸细胞ST和细胞生长液混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋(9)，使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体(8)上，细胞接种密度为:每克载体接种0.8
1.5 X IO7个细胞；
b.制苗用细胞培养设定设备参数:温度 Tl:36.5 37.5°C、T2:40 42°C、T3:34 36°C，pH:7.2 7.4，DO:50% 70%，振荡速度15 30r/min，空气流量100ml/min 1000ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞；
c.病毒接种
当细胞单日耗糖趋于平稳时，表明细胞达到接毒要求，排空反应器内液体，将猪瘟病毒接种制苗用细胞，接种剂量为有效培养体积的0.3% 1% (V/V)，吸附15 30min ;加入细胞维持液；
d.病毒培养与收获
设定设备参数:温度 Tl:36 37°C、T2:39 41°C、T3:33 35°C，pH:7.3 7.5，DO:50% 70%，振荡速度15 3 0r/min，空气流量400ml/min 4000ml/min，启动病毒培养程
序，扩增培养猪瘟病毒；
e.病毒液收获
接毒后每72h收获一次,多批次收获病毒液，保存备用；
f.疫苗制备
向病毒液加入冻干保护剂，分装、冻干，制得猪瘟活疫苗。上述制备猪瘟活疫苗的方法，所述步骤a中，种子细胞为猪睾丸传代细胞ST，为经过有限稀释法克隆纯化筛选的细胞，应用有限稀释法将待筛选细胞进行单克隆化，扩大培养建立单克隆化细胞库，通过兔体定型热反应法筛选猪瘟病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株。上述制备猪瘟活疫苗的方法，所述步骤b中，细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液，当残糖量低于1.5g/L时，流加补充细胞生长液，流加速度以培养液含糖量维持在1.5 2g/L之间为准，当培养液体积达到有效培养体积时，更换培养液。上述制备猪瘟活疫苗的方法，所述步骤b中，逐日增加空气流量，每24h增加100ml/min 1000ml/mino上述制备猪瘟活疫苗的方法，所述步骤d中，接毒24h后开始持续流加补充η倍浓缩DMEM液，流加速度以培养液残糖量维持在I 2g/L之间为准；所述η等于2 5。上述制备猪瘟活疫苗的方法，所述η倍浓缩DMEM液配制方法为:I份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成I X DMEM液后，再加入(η-1)份无Na-DMEM干粉培养基，溶解即成；所述η等于2 5。上述制备猪瘟活疫苗的方法，所述步骤e中，收获方式为多批次收获；每72h收获一次，持续收获10 15次，每次收获量为培养液总体积的90% 100%。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
1.在本发明中，制苗用细胞经过纯化筛选，提高了细胞对病毒的敏感性，保证了种子细胞的状态均一，减小批次间差异，确保生产工艺参数和产品质量的稳定。2.在本发明中，与常规激流灌注式生物反应器培养系统相比，增加了一个混匀器，增大了循环体系培养液的体积，减少了换液次数，简化了操作流程，优化了细胞生长环境，提闻了病毒液广量。3.本发明细胞培养过程中逐渐增大空气流量，加快系统内气体循环，有利于培养液内C02的溢出，减少NaHC03的使用量。
4.本发明使用的浓缩营养液，既可以倍增多种氨基酸含量，又不会明显增加培养液的渗透压，为病毒繁殖提供了充足的营养，有利于提高病毒滴度。5.本发明多批次收获病毒液，既保证了收获病毒液的滴度，又大大提高了病毒液产量。
图1是激流灌注式生物反应器的液体循环系统组成平面示意 图2 AP20C 12批次收获病毒液效价曲线 图3AP200 10批次收获病毒液效价曲线 附图或文字中各标号清单为:1.第一蠕动泵(灌注出液泵)、2.第二蠕动泵(灌注进液泵)，3.第三蠕动泵、4.第一硅胶管、5.第二硅胶管、6.第三硅胶管、7.有孔硅胶管、8.聚酯纤维纸片载体、9.灌注袋、10.混匀器、11.激流罐；
Tl为激流罐内液体温度，T2为激流罐加热膜的温度，T3为灌注袋外环境温度，pH为激流罐内液体PH值，DO为激流罐内液体溶氧率，振荡速度为激流罐的振荡速度，空气流量为激流罐内空气流通量。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明，其中各实施例仅用于说明本发明而并非限定本发明的专利保护范围。实施例1有限稀释法克隆纯化筛选制苗用细胞(猪睾丸细胞ST)
猪睾丸细胞ST购自中国兽医药品监察所；
猪瘟病毒疫苗株为猪瘟病毒兔化弱毒株(C株)，购自中国兽医药品监察所；
细胞生长液的配方为体积百分含量90%高糖DMEM液，10%新生牛血清，调整PH值为
7.4 ；
细胞维持液为体积百分含量96%高糖DMEM液，4%新生牛血清，调整PH值为7.4 ;
A.单克隆细胞株制备 a.细胞悬液的制备
细胞瓶中培养猪睾丸细胞ST，待细胞长满为致密的单层、轮廓清晰时，用0.025%胰酶进行消化，制成细胞悬液。b.细胞的有限稀释
对所制备的猪睾丸细胞ST悬液进行细胞计数，加入无血清的DMEM培养液稀释细胞悬液，使得细胞密度约为1.0 X IO5个/ml ;用无血清DMEM培养液将稀释后的猪睾丸细胞ST悬液10倍梯度稀释至IO3个/ml，再用细胞生长液10倍梯度稀释到IO1个/ml，即每0.1ml含I个细胞。
c.细胞的克隆培养
将上述稀释好的细胞悬液加入96孔细胞培养板中，0.1ml/孔，显微镜下观察，弃去非单一细胞并且细胞状态不佳的细胞孔，置于37°C，5% CO2培养，每天观察细胞生长状态并及时换液，待细胞增殖为克隆群落，选取生长状态良好的细胞孔，用0.025%胰酶进行消化，制成悬液，重复上述克隆方法广2次，直至筛选出单克隆生长孔。
d.单克隆化细胞株的扩大培养
选取单克隆生长孔，用0.025%胰酶消化，以小牛血清中和，以细胞生长液重悬，转移至24孔细胞培养板进行扩大培养，当细胞增殖到汇合度约为80%时，用0.025%胰酶消化，加入细胞生长液，接种于细胞培养瓶中扩大培养，培养6 10瓶，进行单克隆细胞的冻存及细胞
库的建立。B.猪瘟病毒疫苗株高适应性细胞株的筛选 a.ST单克隆细胞株的消化铺板
将长满单层的ST单克隆细胞株用0.025%胰酶消化并计数，每株单克隆细胞铺24孔细胞培养板，设复孔，30000个细胞/孔。置于370C，5% CO2培养24h。b.ST单克隆细胞株接种猪瘟病毒
弃去24孔细胞培养板中的细胞生长液，加入0.1M PBS,0.8ml/孔，吹洗2 3遍后，按V: V 3%接种量接种猪瘟病毒疫苗株，1.0ml/孔，37°C孵育Ih后弃去病毒液，添加细胞维持液1.0ml，置于370C，5% CO2培养72h，收获病毒液。c.ST单克隆细胞株培养猪瘟病毒疫苗株的病毒效力测定
以无菌生理盐水将收获的猪瘟病毒液进行5X104、1X105、2X105、3X105、4X105、5 X 105、IXlO6,2X IO6倍梯度稀释，每个梯度耳静脉注射体重2.0kg家兔2只，每只Iml。家兔接种后，上下午各测体温一次，48h后，每隔6小时测体温一次，根据家兔定型热反应标准进行判定。具体步骤参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》二〇〇〇年版。C.结果 a.ST单克隆细胞株的培养
通过有限稀释法扩大培养获得ST单克隆细胞株47株。液氮冷冻保存，每株单克隆细胞冻存5支，每支1.5ml，密度约为5X IO6个/ml。b.猪瘟病毒疫苗株高适应性ST单克隆细胞株的筛选。通过猪瘟病毒疫苗株感染ST单克隆细胞株72h后的病毒效力检测，筛选出2株效价最高的ST单克隆细胞株:第17株和第30株，在47株中病毒效力最高，为4X 105RID/ml和5 X 105RID/ml。与猪瘟病毒疫苗株感染普通猪睾丸细胞ST的效价(2 X IO4 5 X IO4RID/ml)相比，提高约10倍。由此，筛选获得第17株和第30株为猪瘟病毒疫苗株高适应性ST单克隆细胞株，并标号为S17和S30。S17号猪睾丸传代细胞ST，于2012年11月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉大学，保藏号为CCTCC NO:C2012180o所述细胞为本领域常用细胞，故对其特征描述不再赘述。实施例2 AP20C型激流灌注式生物反应器制备猪瘟活疫苗
本实施例中所用的AP20C型激流灌注式生物反应器，灌注袋9容积为4.5L，混匀器10容积为8L，激流罐11容积为15L，灌注袋9内含有200g聚酯纤维纸片载体8 ;理论有效培养体积为18L。制苗用细胞同实施例1中菌种保藏的猪睾丸细胞(ST)；
种毒同实施例1中猪瘟兔化弱毒株(C株)，某一批次种毒效价为5X105RID/ml ； 细胞生长液为体积百分含量92%高糖DMEM液，8%新生牛血清，调整PH值为7.3 ; 细胞维持液为体积百分含量97%高糖DMEM液，3%新生牛血清，调整PH值为7.4 ;无Na-DMEM干粉培养基为不含有NaCl和酚红的高糖DMEM培养基，由InvitrogenCorporation生产销售；
A、准备工作:
检验系统气密性，校准电极，PBS处理纸片载体8，连接灌注袋9、混匀器10与激流罐11，用细胞生长液浸泡纸片载体8，平衡系统。B、制备工作，具体步骤如下: a.制苗用细胞的复苏与前期培养
从液氮罐中取出冻存的猪睾丸细胞ST复苏后，用细胞生长液于37°C培养，长成良好单层后消化转至IOL转瓶中培养、备用。b.制苗用细胞在生物反应器中的接种
取7个长满单层细胞的转瓶，用0.025%胰酶消化细胞，制备细胞悬液5L (含细胞和细胞生长液)，细胞总数约2.7 X IO9个。细胞接种采用两步接种法，第一步:灌注袋9中各从下部泵入细胞悬液4.0L，静置吸附Ih ;第二步:将灌注袋9中的液体泵出1.0L，再从灌注袋9上部深层管泵入1.0L剩余细胞悬液，静置吸附0.5h ;同时在激流罐11内补充4L细胞生长液预热；细胞接种密度为:每克载体接种1.35 X IO7个细胞。c.制苗用细胞培养
吸附过程完成后，设置设备参数如下:T1:37.2。。、T2:41°C、T3:35°C, PH:7.3，DO:50 70%，震荡速度30r/mi n，液体循环速度300ml/min，空气流量100ml/min。启动细胞培养程序，进行细胞培养。 每日取样2次测残糖量，计算单日耗糖量，细胞培养36h培养液残糖量低于1.5g/L，开始流加补充细胞生长液，流加速度为4.4ml/min ;细胞培养72h泵出系统内培养液泵出总培养体积70%的培养液，泵入生长液3.6L，流加速度为6.2ml/min ；
细胞培养液循环灌注速度随培养时间的增加逐渐增大，使硅胶管4、硅胶管6内液体颜色保持基本一致。逐日增加空气流量，每24h增加100ml/min。d.猪瘟病毒接种制苗用细胞
细胞接种后第4日(96h)单日耗糖量达到2.lg/L/24h，且趋于平稳，确定细胞密度达到了接毒要求。排空反应器内液体，将150ml猪瘟病毒液泵入激流袋11内，连同激流袋11内的4L无血清单倍DMEM液，一同泵入灌注袋9内，静置吸附20min，同时在激流袋11中补充6L含血清5%的DMEM营养液，病毒接种剂量约为有效体积的0.83%。e.病毒培养与收获
吸附过程完成后，设置设备参数如下:T1:36 °C、T2:39 °C> T3:35°C, PH:7.3，DO:50 70%，震荡速度30rpm，液体循环速度500ml /min,通气量400ml/min，启动病毒培养程序开始培养。接毒24h后开始持续流加补充3倍浓缩DMEM液(I份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成I XDMEM液后，再加入2份无Na-DMEM干粉培养基，溶解而成)，流加速度2.5ml/min。接毒后每72h收获一次,第一次、第二次收获量为培养液总体积的90%,收获完毕后补充细胞维持液，使培养液总量为10L，24h后开始流加3倍浓缩DMEM液，流加速度为2.6ml/min。第三次开始，每次收获量为培养液总体积的100%，收获完毕后补充细胞维持液，使培养液总量为10L，24h后开始流加3倍浓缩DMEM液，流加速度为2.6ml/min。共收获12次。12 次收获量分别为:16.2L、16.2L、17.9L、18L、17.8L、18L、18L、17.9L、17.8L、18L、18L、
17.9L。每次收获的毒液，先经过0.5微米的过滤器，除去细胞碎片后，于_20°C冷冻保存。
f.病毒液效力检验
以无菌生理盐水将收获的猪瘟病毒液进行5X105、1X106、2X106、3X106、4X106、5X 106、6X 106、8X 106、1 X IO7倍梯度稀释，每个梯度耳静脉注射体重2.0kg家兔2只，每只Iml。家兔接种后，上下午各测体温一次，48h后，每隔6小时测体温一次，根据家兔定型热反应标准进行判定。收获的病毒液测定效价，10批次收获病毒液效价均> I X 106RID/ml (10批次收获病毒液效价曲线图见图2)
表I 12批次收获病毒液的效力(RID/ml)
权利要求
1.一种制备猪瘟活疫苗的方法，其特征在于:它利用激流灌注式生物反应器作为培养工具，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵(I)、第二蠕动泵(2)、第三蠕动泵(3)、第一硅胶管(4)、第二硅胶管(5)、第三硅胶管(6)、有孔硅胶管(7)、纸片载体(8)、灌注袋(9)、混匀器(10)与激流罐(11);其中，混匀器(10)是具有加热或保温功能、并能对内部液体进行混匀的罐状装置；所述反应器中液体的流向为:灌注袋(9)—硅胶管(4)—混匀器(10)—硅胶管(5)—激流罐(11)—硅胶管(6)—灌注袋(9); 活疫苗制备按以下步骤进行: a.细胞接种 将细胞悬液即猪睾丸细胞ST和细胞生长液混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋(9)，使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体(8)上，细胞接种密度为:每克载体接种0.8 1.5 X IO7个细胞； b.制苗用细胞培养设定设备参数:温度 Tl:36.5 37.5°C、T2:40 42°C、T3:34 36°C，pH:7.2 7.4，DO:50% 70%，振荡速度15 30r/min，空气流量100ml/min 1000ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞； c.病毒接种 当细胞单日耗糖趋于平稳时，表明细胞达到接毒要求，排空反应器内液体，将猪瘟病毒接种制苗用细胞，接种剂量为有效培养体积的0.3% 1% (V/V)，吸附15 30min ;加入细胞维持液； d.病毒培养与收获 设定设备参数:温度 Tl:36 37°C、T2:39 41°C、T3:33 35°C，pH:7.3 7.5，DO:50% 70%，振荡速度15 30r/min，空气流量400ml/min 4000ml/min，启动病毒培养程序，扩增培养猪瘟病毒； e.病毒液收获 接毒后每72h收获一次,多批次收获病毒液，保存备用； f.疫苗制备 向病毒液加入冻干保护剂，分装、冻干，制得猪瘟活疫苗。
2.根据权利要求1所述制备猪瘟活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤a中，种子细胞为猪睾丸传代细胞ST，为经过有限稀释法克隆纯化筛选的细胞，应用有限稀释法将待筛选细胞进行单克隆化，扩大培养建立单克隆化细胞库，通过兔体定型热反应法筛选猪瘟病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株。
3.根据权利要求2所述制备猪瘟活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤b中，细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液，当残糖量低于1.5g/L时，流加补充细胞生长液，流加速度以培养液含糖量维持在1.5 2g/L之间为准，当培养液体积达到有效培养体积时，更换培养液。
4.根据权利要求3所述制备猪瘟活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤b中，逐日增加空气流量，每24h增加100ml/min 1000ml/min。
5.根据权利要求4所述制备猪瘟活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤d中，接毒24h后开始持续流加补充η倍浓缩DMEM液，流加速度以培养液残糖量维持在I 2g/L之间为准；所述η等于2 5。
6.根据权利要求5所述制备猪瘟活疫苗的方法，其特征在于，所述η倍浓缩DMEM液配制方法为:1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成I X DMEM液后，再加入(η-1)份无Na-DMEM干粉培养基，溶解即成；所述η等于2 5。
7.根据权利要求6所述制备猪瘟活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤e中，收获方式为多批次收获；每7211收获一次，持续收获10 15次，每次收获量为培养液总体积的90% 100% ο
全文摘要
一种制备猪瘟活疫苗的方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤a.细胞接种；b.制苗用细胞培养；c.病毒接种；d.病毒培养与收获；e.疫苗制备。本发明对制苗用细胞进行了筛选，加强了细胞与病毒的适应性；采用激流灌注式生物反应器培养体系提高了病毒的增殖滴度及收获量；而且整个生产工艺不涉及其他生物安全和公共卫生问题，适合于大规模生产。
文档编号A61P31/14GK103157105SQ20121057812
公开日2013年6月19日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者李倬, 刘涛, 郑朝朝, 郁宏伟, 李建丽, 杨保收, 梁武, 吕茂杰, 邱贞娜, 柳珊 申请人:瑞普(保定)生物药业有限公司