一种抗感染和促进伤口愈合的止血剂及其制备方法

专利名称：一种抗感染和促进伤口愈合的止血剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种止血剂，特别是一种抗感染和促进伤口愈合的止血剂及其制备方法，制得的该止血剂能够与人体良好相容并自行吸收，促进伤口快速愈合。
背景技术：
人体中的血液是维持人类生命的重要物质，一般成人的总血量大约在4000毫升左右。当人体受到外伤而引起大出血时，如果短时间内丢失总血量的1/3(约1300毫升)， 人体就会发生休克，表现为脸色苍白、出冷汗、血压下降和脉搏细弱等症状；如果丢失总血量的一半(约2000毫升)，则人体的组织器官就会处于严重缺血状态，并可导致很快死亡。在我们的日常生活中，每天都会有许多人因为各种原因造成出血而致残甚至危及生命。战争、车祸、严重的烧烫伤以及各种意外的激烈碰撞等都会引起人体大量出血。如果能在受伤初期就给予及时而有效的止血，将会使很多濒临死亡的生命得到挽救。例如在战场上，导致伤员死亡的一个最重要的原因就是失血过多。一个人如果每小时失血超过400-500毫升时就必须进行输血，否则将面临死亡的威胁。如果重伤员能够得到及时止血救治的话，将有可能从死神的手里逃脱出来，而在艰苦的战场环境下只能依靠简易的止血方式来阻止伤员血液的流失。传统的止血工具通常由野战止血敷剂和止血带组成，在十分紧急的情况下也可简单的用纱布缠绕敷裹并用一根橡胶带紧紧勒住周围的主动脉，以此来减少伤员在运送救助途中的失血量。但在某些时候这种方法并不可取，一方面，当伤员的出血点位于那些不便于包扎的地方，如头部、四肢根部和躯干等部位时，这种方法就不能有效地快速止血；另一方面，当伤员被运送到医院后，必须清除这些止血敷剂和止血带，而这会给伤员带来更大的痛苦和更多的出血。正是由于战场上恶劣的医疗救护条件，让许多伤员白白的牺牲掉了生命。虽然早在越南战争时期，美军就依靠战场救护直升机赢得了宝贵的伤员抢救时间，这种快速的运载工具弥补了医疗条件的不足，使98%的危重伤员被抢救了过来，但还有2%的危重伤员永远失去了继续生存的机会。鉴于此，美国国防部已经将止血急救包作为陆军和海军陆战队人员的标准装备之一，并且在近几年的阿富汗战争和伊拉克战争期间为每一位士兵配备了止血急救包。据统计，仅在2004年的伊拉克战争期间，美军共向作战区运送了 17.2万条急救止血带，同时美国海军陆战队也订购了 20万条急救止血带，仅仅这项开支，其成批订购价格就达7440万美元。据统计，我国每年的出血患者数量约在900万人以上，主要分布在手术科室及部分内科科室。数据显示，我国止血药销售金额逐年增长，2004年较上年增长55%，2005年国内止血药的市场规模约在20亿元左右。因此，研究和开发快速、有效和廉价的止血剂和止血方法仍然是目前迫切需要解决的问题。根据美国五角大楼的一份报告，出血损伤是导致士兵在战场上死亡的首要原因。为此，仅在一种超声波止血带的研究和开发上，美国五角大楼就拨款5100万美元，由美国国防先进技术研究计划署组织美国国内各类研究所共同完成这一项目。
1、创伤和止血创伤可分 为两种，闭合性创伤和开放性创伤。(1)闭合性创伤皮肤外表完整而内部组织受损，又称内伤。闭合性创伤会引起内出血，有皮下出血或发青现象，也可能没有任何表面迹象。(2)开放性创伤皮肤及下层的组织均受到伤害，又称外伤。开放性创伤又可分为以下几种1)擦伤皮肤与粗糙物体相磨擦而造成，出血量不多，伤口上常留有污物、砂粒， 很容易感染。2)穿刺伤由尖锐物品插入造成，一般出血量不多，但可能伤及体内器官造成内出血，如果伤口较深，感染的机会便会增加，也有感染破伤风的危险。3)切割伤由锐利之物品，如刀、金属片、玻璃等造成，可能直接切断血管，易引起大量出血，须立即止血。4)撕裂伤由巨大之外力碰撞所造成，伤口呈不规则状，常易受感染。5)断裂伤某一部份的肢体因外力之伤害而脱离身体，例如四肢、耳朵等，常附随有撕裂伤及切割伤，必须立即止血。断肢以装有冰块的干净塑胶带装好，并将断裂之肢体连同伤者以最快的速度送到医院。6)枪伤会引起严重内伤。子弹射入人体时留下一个伤口，而穿出时会留下更大的伤口，可能伤及组织、内部器官和血管。枪伤除了会引起外出血外，也可能造成内出血。内出血和外出血的止血方法是不同的(1)内出血的止血内出血病人应尽快送就近医院进行手术止血。据统计，外科医生在手术台上的一半时间都用在止血上。尽管外科医生可以使用止血钳、烧灼伤口、药物收缩血管等止血方法，但它们都有不尽如人意的地方，而血流不止就会在短时间内夺走病人的性命。(2)外出血的止血外出血的止血方法有以下几种1)包扎止血以消毒纱布置于伤口上，然后以手掌或手指施压5 10分钟，等出血停止后，用绷带或胶带包扎固定。2)指压止血手指压在出血动脉近心端的邻近骨头上，阻断血运来源。3)止血带止血较大的肢体动脉出血，且为运送伤员方便起见，应上止血带。用橡皮带、宽布条、三角巾、毛巾等均可。4)抬高伤肢止血除非有骨折现象，可让伤肢平躺后，将上肢或下肢抬高，以高于心脏高度为宜。2、微孔淀粉淀粉属多糖的一种，是植物体中储藏的养分，它与蛋白质、纤维、油脂、糖、矿物质等共同存在于农作物的籽粒、根、块根中。淀粉是无色无臭的白色粉末，具有颗粒结构和吸湿性，密度1. 499 1. 513。淀粉颗粒不溶于水，工业上便是利用这种性质，采用水磨法工艺，将非淀粉杂质除去，得到纯度较高的淀粉产品。微孔淀粉是指采用物理、机械或生化方法使淀粉颗粒由表面至内部形成孔洞的一种新型变性淀粉。目前，有下面三种方法可以制得微孔淀粉
1)物理方法如超声波处理、喷雾等方法.2)机械方法如机械撞击等。 3)生化方法如醇变性、酸水解、酶(或组合酶)水解等。在上述几种方法中，当单独使用某一种方法进行微孔淀粉的制备时，不但每一种方法本身存在着一定的局限性。如，超声波处理和机械撞击法的生产成本较高，不易实现产业化；喷雾法与醇变性法形成的微孔淀粉是一种实心的端聚物球体，吸附作用只发生在表面凹凸不平的沟壑内，吸附量有限；酸水解法在糊化温度下反应速率较慢，降解不一，随机性强，不易形成孔状；而酶水解法尽管效果较好，但酶本身价格昂贵，其生产成本较高，而且所得到的微孔淀粉的比表面积都较小，对水和油脂的吸附能力都有限。因此，实际生产中常常用上述几种方法的组合来进行。例如，酸酶序解法就是一种制备微孔淀粉的较好方法，在这种方法中，淀粉经过除杂和预处理后，首先经过酸初步水解，再经过一定时间的酶解，所得到的微孔淀粉的比表面积要比单独使用酸解和酶解方法时所得到的比表面积显著增大，对水和油脂的吸附能力都有显著提高。用酸酶序解法制备微孔淀粉的一般过程如下首先去除原淀粉中的蛋白质和脂类等杂质并对淀粉进行预处理，然后对处理过的淀粉进行有限程度的酸水解后，最后再经过一定时间的酶解。这种制备微孔淀粉的过程主要包括以下几步(1)原淀粉的选择不同品种的淀粉对酸和酶的敏感性差异很大，甚至在同一淀粉粒的不同区域也存在差别。生淀粉酶水解生淀粉一般受淀粉植物来源和酶来源的影响，谷类淀粉的水解要比块根类淀粉容易，而同一种来源淀粉的水解率取决于品种、生长状态、组织层等。如胰酶对不同淀粉的敏感性顺序为芋头>紫玉米>大米>小麦>普通玉米>甜马铃薯> 日本栗子 >莲子>高链玉米>中国甘薯(圆型)>银杏>百合>熟香蕉>生香蕉>中国甘薯(长型)>马铃薯。这主要是由这些淀粉中直链淀粉的含量、淀粉的粒度及颗粒表面淀粉分子链非还原末端的分布等的差异造成的。直链淀粉质量分数高不利于生淀粉酶发挥作用；淀粉粒度越小，越易被酶水解。但有时大颗粒能形成多孔结构，而小颗粒只在其表面腐蚀，这表明酶对颗粒的作用是不均一的。(2)原淀粉的除杂和预处理实验发现，与蛋白质或脂质复合的直链淀粉较难水解和酶解，而原淀粉经过预处理后能显着提高其对生淀粉酶的敏感性。如脱除淀粉粒中的蛋白质和脂质，可以增加生淀粉酶接近淀粉粒子的机会，提高其酶解的速度，更有利于微孔淀粉的形成；小麦淀粉和马铃薯淀粉，经过球磨或糊化或超声波处理后，不但溶解性提高，而且对生淀粉酶的敏感性也增强；在糖化酶酶解前对淀粉进行湿热预处理，能增加其对酶的敏感性，且对谷物类淀粉的效果好于根茎类淀粉。(3)酸和酸解条件的选择一般常用的酸是稀硫酸和稀盐酸，而稀硝酸由于具有一定的氧化性，可能会使淀粉在变性时产生一些不必要的负反应，因此很少使用。而其它的酸也一般很少使用。酸解条件主要包括酸的用量、反应温度和反应时间等，在一些条件下，一些添加剂也会对酸解产生重要影响。如当用硫酸水解法制备微孔淀粉时，在反应液中加入一定量的尿素，其酸解能力会大大提高。
(4)生淀粉酶和酶解条件的选择 常用生淀粉酶的有α-淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶、脱枝酶、普鲁蓝酶、磷酸化酶等等，其来源为动物、植物和微生物。不同来源的淀粉酶活力差别很大，如葡萄糖淀粉酶的活力一般顺序是黑曲霉>黄曲霉>麦芽；α “淀粉酶的活力顺序一般是 胰液 > 唾液 > 真菌。在选择生淀粉酶时，除了大豆β-淀粉酶一般没有生淀粉降解能力外， 细菌淀粉酶以及不同来源的糖化酶、α-淀粉酶均或多或少地有降解各种生淀粉的能力。实验发现，α-淀粉酶产生的孔是倒锥形的，内大外小，而葡萄糖淀粉酶产生的孔则是锥形的，内小外大。因此，单独使用α-淀粉酶或葡萄糖淀粉酶酶解淀粉，得到的微孔都不理想，而如果将它们以一定比例混合使用，却会产生较好的结果，复合酶协同制备微孔淀粉的效果优于单独使用某一种酶。如在玉米淀粉中加入等量的α-淀粉酶和糖化酶，在 PH为5. 0、25°C条件下处理8h，酶解制得微孔淀粉的孔径比单独使用一种酶的都要大；在小麦淀粉中采用α “淀粉酶和葡萄糖淀粉酶组合制备微孔淀粉效果较好，而且两者的质量比为1 1 1 4时所形成的微孔淀粉的吸水率、吸油率和淀粉颗粒的微观形态结构最佳。制备的微孔淀粉既要使淀粉粒表面布满一定孔径的小孔，又要保持颗粒的完整性。影响生淀粉酶解的因素主要有淀粉酶的用量、作用时间、温度、PH值等，而吸油率和吸水率是制备微孔淀粉的重要控制指标，它们能直接反映出微孔淀粉的吸附性能。例如，我们在研究一种玉米淀粉的水解时，得出的最佳酶解条件是反应温度50°C，反应时间为20h， 酶液添加量(质量分数)为1.0%，pH值在4.8左右；而在研究另一种玉米淀粉的水解时， 得出的最佳酶解条件反应温度50°C，pH值5.0，反应时间12h，复合酶的添加量(质量分数)1· 5%。

发明内容
本发明的目的在于，提供一种抗感染和促进伤口愈合的快速止血剂及其制备方法，制得的该以止血剂能够与人体良好相容并可自行吸收，促进伤口快速愈合。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案—种抗感染和促进伤口愈合的止血剂，其特征在于，制得的该止血剂由微孔淀粉为主要原料，每100克微孔淀粉中含有抗菌剂10微克 100微克和生长因子5微克 50微克。上述抗菌剂是基因重组抗菌肽CecropinA冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽 CecropinB冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽CecropinC冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽CecropinD冷冻干燥纯品干粉或天然抗菌肽冷冻干燥纯品干粉。上述生长因子是表皮生长因子(EGF)、碱性或酸性成纤维细胞生长因子(bFGF)或碱性或酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)或角质细胞生长因子(KGF)其中之一，或者其中两种以上的组合。上述抗感染和促进伤口愈合的止血剂的制备方法，其特征在于，按以下工艺步骤进行1)微孔淀粉的活化称取一定量的微孔淀粉，在室温的真空干燥器中留置24-48小时，然后依次用5-10倍体积的无水乙醇洗涤两次和10-15倍体积的丙酮洗涤三次后，用G2砂心漏斗抽滤至干，于40-45°C真空干燥器中留置24-48小时后，然后将微孔淀粉转入一个事先充满高纯氮气的容器中；2)抗菌剂的加入在上述充满高纯氮气的容器中，按每100克微孔淀粉加入 10微克 100微克的抗菌剂与微孔淀粉搅拌混勻，所述的抗菌剂是基因重组抗菌肽CecropinA冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽CecropinB冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽CecropinC冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽Cecropin D冷冻干燥纯品干粉或天然抗菌肽冷冻干燥纯品干粉；3)生长因子的加入在上述充满高纯氮气的容器中，再按每100克微孔淀粉加入生长因子5微克 50 微克，所述的生长因子是表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子或酸性成纤维细胞生长因子或角质细胞生长因子其中之一，或者其中两种以上的组合；继续搅拌混勻，得到抗感染和促进伤口愈合的止血剂。本发明制备的抗感染和促进伤口愈合的止血剂，既可以直接用于受伤伤口，还可以保存在一储压式罐中，装入一定量的抗感染和促进伤口愈合的止血剂，然后在罐中充入纯氮气使达到一定压力，储藏，以备分装。由于抗菌剂的加入，既可以防止止血剂本身在储藏和运输过程中的细菌感染和变质，又可以对受伤伤口进行初步的抗感染处理；既可以直接涂抹于伤口，也可以将其放入一种小型储压装备中，使用时在压力作用下直接喷于伤口。在罐中加入氮气是为了驱除空气中的水分。该止血剂一旦喷洒在伤口上，如同海绵一样会迅速吸收血液中的水分而使血小板和血蛋白等得到迅速浓缩，从而触发最初的凝血，然后在凝血过程完成后，由淀粉酶将其分解为人体所吸收。由于该止血剂粉末有助于血液凝结和闭合伤口，可能替代胶原和其它动物源类产品，从而成为外科手术中的辅助方法，用于各种中小动脉之下的创伤止血。本发明的抗感染和促进伤口愈合的止血剂与现有的止血剂相比较，具有以下优点1、可以安全、有效、迅速地止血，从而免去了可能需要输血的危险；2、不但能够有效加快创伤伤口的愈合，而且能够对创伤伤口进行消炎和抗感染；3、使用该止血剂几周后在生物体内会自动降解为生物体可以吸收的小分子，被周边细胞吸收，无毒无副作用，不会引起体内通常会有的排异反应，因此在手术中和手术后无须将它移除，从而避免了伤口受到污染的可能，给其在无菌环境下进行手术提供了必要条件。4、不论是对各种中小动脉之下的小伤口或大伤口表面，都能迅速有效地止血，而且无论伤口多深或者形状如何，都不会影响它的效果。


图1是培养24h后显微镜下的各组细胞形态图；图2是培养72h后显微镜下的各组细胞形态图；图3是培养120h后显微镜下的各组细胞形态图；图4是培养168h后显微镜下的各组细胞形态上述图1 图4中，从左至右依次为a、100%浸提液组，b、50%浸提液组，c、25% 浸提液组，d、阴性对照组。图5是术后实验组手术切口周围组织大体观察图片，从左至右依次为a、植入抗感染和促进伤口愈合的止血剂2d后，b、植入抗感染和促进伤口愈合的止血剂6d后。图6是植入抗感染和促进伤口愈合的止血剂2d后肝、肾和伤口周围组织的HE染色图，从左至右依次为a、植入2d后肝脏HE染色，b、植入2d后肾脏HE染色，C、植入2d后伤口周围组织HE染色。图7是植入抗感染和促进伤口愈合的止血剂6d后肝、肾和伤口周围组织的HE染色图，从左至右依次为a、植入6d后肝脏HE染色，b、植入6d后肾脏HE染色，C、植入6d后伤口周围组织HE染色。 图8是植入抗感染和促进伤口愈合的止血剂IOd后肝、肾和伤口周围组织的HE染色图，从左至右依次为a、植入IOd后肝脏HE染色，b、植入IOd后肾脏HE染色，C、植入IOd 后伤口周围组织HE染色。图9是植入抗感染和促进伤口愈合的止血剂14d后肝、肾和伤口周围组织的HE染色图，从左至右依次为a、植入14d后肝脏HE染色，b、植入14d后肾脏HE染色，C、植入14d 后伤口周围组织HE染色。图10是创伤处施加抗感染和促进伤口愈合的止血剂后用医用纱布加压的止血时间与单纯用纱布加压的止血时间比较图。从左至右依次为a、抗感染和促进伤口愈合的止血剂组，b、云南白药组。图11是抗感染和促进伤口愈合的止血剂的止血时间和用纱布加压的止血时间比较图。从左至右依次为a、抗感染和促进伤口愈合的止血剂组，b、云南白药组。以下结合附图和各实验对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式按照上述技术方案，申请人制备的抗感染和促进伤口愈合的止血剂，选用微孔淀粉为主要原料，每100克微孔淀粉中含有抗菌剂10微克 100微克和生长因子5微克 50微克。抗菌剂选择基因重组抗菌肽CecropinA冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽 CecropinB冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽CecropinC冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽CecropinD冷冻干燥纯品干粉或天然抗菌肽冷冻干燥纯品干粉。生长因子选择表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子或酸性成纤维细胞生长因子或角质细胞生长因子其中之一，或者其中两种以上的组合。申请人:对所制备的抗感染和促进伤口愈合的止血剂的有效性和安全性进行了多方面的实验，其中包括动物实验和人体实验，结果表明，该止血剂能够快速、有效和安全地用于止血。下面通过发明人给出的实施例作进一步说明，本发明并不局限于这些实施例。 实施例1 酸酶序解法制备小麦微孔淀粉1)小麦淀粉中蛋白和脂类杂质的去除将适量小麦原淀粉(市售)用浓度0. 2%的稀碱液浸泡后进行胶体磨，然后过筛， 离心，洗涤，干燥，然后进行预处理；
2)小麦淀粉的预糊化和超声波处理配制35% (W/V)处理过的淀粉乳浊液，70°C搅拌IOmin后离心，沉淀在40°C条件下常压干燥后粉碎，然后进行超声波预处理；预糊化后的淀粉配制成乳浊液，用超声波在室温、25kHz、无搅拌情况下进行约30min的超声处理；3)小麦淀粉的有限酸解称取一定量超声波处理 后的淀粉于200mL烧杯中，用浓度12%的HCl溶液调成含淀粉38%的均勻淀粉乳，置于40°C的水浴锅中加热，同时用电动搅拌机搅拌。4小时后停止反应，用饱和碳酸钠溶液中和盐酸，然后抽滤洗涤。4)初步酸解后小麦淀粉的双酶解称取适量上述初步酸解后的淀粉，用pH为5. 8的缓冲液(弱酸及其盐的混合溶液，如HAc与NaAc)配制成浓度为60%的淀粉乳，在55°C恒温水浴锅中预热20min，同时用电动搅拌机搅拌，往淀粉乳中加入按理论水解50%淀粉的配比为5 1的酶(α-淀粉酶与糖化酶)量，然后恒温水浴振荡24h，停止酶反应。反复抽滤、水洗，得湿淀粉样品，置烘箱内于50°C烘干至恒重，用粉碎机粉碎，得到微孔淀粉。5)孔密度以及吸水性和吸油性的测定上述经过酸酶序解的微孔淀粉用扫描电镜观察表明，微孔淀粉呈蜂窝状，颗粒表面分布的微孔约为0. 45个/ μ m2，孔径约为1. 0 μ m，孔深不一且最深的可达颗粒中心。与仅仅用双酶解法所制备的微孔小麦淀粉的孔密度0. 3个/ μ m2相比较，孔密度提高了约50%; 吸水性或吸油性是微孔淀粉所吸收的水或色拉油与微孔淀粉的质量比。在恒温下将一定质量的微孔淀粉与水或色拉油混合搅拌30min，转入砂芯漏斗后用真空泵抽滤，直至无水或油滴滴下，然后根据吸收前后的样品质量差计算其吸水性和吸油性。结果表明，用上述酸酶序解的方法制备的微孔小麦淀粉的吸水性率约为95%，吸油率约为75%，与仅仅用双酶解法所制备的微孔小麦淀粉80%的吸水性率和60%的吸油率相比较，其吸水性率和吸油率分别增加15%。实施例2 抗感染和促进伤口愈合的止血剂的制备1)小麦微孔淀粉的活化称取1. 0千克上述用酸酶序解法制备的小麦微孔淀粉，将其在室温真空干燥器中留置24小时，然后依次用5倍体积的无水乙醇洗涤两次和12倍体积的丙酮洗涤三次后，用 G2砂心漏斗抽滤至干，于45°C真空干燥器中留置24小时后，转入一事先充满高纯氮气的容器中；2)抗菌剂的加入在上述充满高纯氮气的容器中，加入200微克申请人自己生产的基因重组夕古比蚕抗菌肽Cecropin B和200微克基因重组夕古比蚕抗菌肽Cecropin D冷冻干燥纯品干粉， 搅拌混勻；3)生长因子的加入在上述已加入基因重组抗菌肽Cecropin B和基因重组抗菌肽Cecropin D的充满高纯氮气的容器中，分别入约100微克申请人自己生产的冷冻干燥人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子纯品干粉，搅拌混勻即成抗感染和促进伤口愈合的止血剂。在一种储压罐装入0. 5千克上述以小麦微孔淀粉为主要原料制成的抗感染和促进伤口愈合的止血剂，然后在瓶体内充入纯氮气使压力达到ο. 15MP，锁好把锁后备用。实施例3 抗感染和促进伤口愈合的止血剂的生物相容性测定(1)、细胞毒 性实验1、材料干燥的抗感染和促进伤口愈合的止血剂实验室自制；人胚肺二倍体细胞(MRC-5)细胞系中国人民解放军第四军医大学提供；新生胎牛血清美国Gibco公司产品；DMEM培养基购于美国Gibco公司产品；HEPES 美国Sigma公司产品；无水碳酸氢钠美国Sigma公司产品；二甲基亚砜北京鼎国生物技术有限公司产品；噻唑蓝科昊生物工程有限公司产品；EDTA 北京鼎国生物技术有限公司产品；胰蛋白酶美国Gibco公司产品。2、方法称取2g干燥的抗感染和促进伤口愈合的止血剂置于50mL已灭菌的血清瓶中，加入IOmL全DMEM培养基，置于37°C恒温水浴箱中浸提24h 士 2h，离心后取上清，即100%微孔淀粉全DMEM培养基浸提液，后用全DMEM培养基将其稀释成50 %浸提液和25 %浸提液，4°C 冷藏备用。将培养48h至72h的人胚肺二倍体细胞弃去原培养基，加入ImL消化液洗涤一次， 后加入2mL消化液，将细胞培养瓶置于二氧化碳培养箱内3 4min后取出，于倒置显微镜下观察，若是胞质回缩，细胞间隙增大，细胞收缩变圆，则立即加入5mL全DMEM培养基，并用移液管吹打成单个细胞悬液，置于光学显微镜下计数，再加入适量的全DMEM培养基稀释成 IX IO7个/L的细胞悬液。将上述细胞悬液接种于96孔培养板上，每组6孔，共4组。置于二氧化碳培养箱内培养24h后取出，吸弃原培养基，分别加入100%抗感染和促进伤口愈合的止血剂浸提液 (以下称100%浸提液)、50%抗感染和促进伤口愈合的止血剂浸提液(以下称50%浸提液)、25%抗感染和促进伤口愈合的止血剂浸提液(以下称25%浸提液)和全DMEM培养液， 放入二氧化碳培养箱内继续培养。分别于l、3、5、7d各取一块96孔细胞培养板，置于倒置显微镜下观察并拍照后，力口入20 μ LMTT溶液，在二氧化碳培养箱内继续培养4h后取出，小心吸去培养基并加入150 μ L 二甲基亚砜，常温下震荡IOmin后用酶联免疫测定仪于490nm下测吸光值。细胞相对增殖率用下式计算细胞相对增值率RGR(% ) = [OD1ZOD2] X 100%式中，OD1 浸提液组的吸光度；OD2 阴性对照组的吸光度。实验数据采用I士 s表示，统计学处理采用SPSS17.0分析软件，组间差异采用单因素方差分析，P <0.01具有统计学意义。3、细胞形态观察由图1可知，倒置相差显微镜下观察发现，培养24h后，各组细胞生长基本正常，细胞呈梭形并贴壁生长，折光性好，胞浆内有离散颗粒，无细胞溶解现象。由图2可知，经72h培养后，细胞贴壁并呈梭形，折光性好，25%浸提液组和阴性对照组相比无明显区别，而100%浸提液组和50%浸提液组与阴性对照组相比细胞密度明显较低。由图3可知，经120h培养后，阴性对照组和25%浸提液组细胞伸展并呈梭形，折光性好，二者细胞密度较大。100%浸提液组和50%浸提液组细胞密度相对较低。二者细胞中有少量收缩，折光性较差并有少量细胞破碎。由图4可知，经168h培养后，25%浸提液组、50%浸提液组和阴性对照组细胞密度极高并已重叠生长，细胞伸展呈梭形。而100%浸提液组细胞密度相对较低，折光性差。其中100%浸提液组细胞密度更低并有部分细胞收缩，生长状态较差，细胞溶出物较多。二者细胞中有少量收缩，折光性较差并有少量细胞破碎。4、MTT 比色1、3、5、7d的100 %浸提液组、50 %浸提液组、25 %浸提液组和阴性对照组的MTT实验检测结果如下列表所示。培养Id后MTT吸光值
权利要求
1.一种抗感染和促进伤口愈合的止血剂，其特征在于，制得的该止血剂由微孔淀粉为主要原料，每100克微孔淀粉中含有抗菌剂10微克 100微克和生长因子5微克 50微克。
2.如权利要求1所述的抗感染和促进伤口愈合的止血剂，其特征在于，所述的抗菌剂是基因重组抗菌肽CecropinA冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽CecropinB冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽CecropinC冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽CecropinD冷冻干燥纯品干粉或天然抗菌肽冷冻干燥纯品干粉。
3.如权利要求1所述的抗感染和促进伤口愈合的止血剂，其特征在于，所述的生长因子是表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子或酸性成纤维细胞生长因子或角质细胞生长因子其中之一，或者其中两种以上的组合。
4.权利要求1-3其中之一所述的抗感染和促进伤口愈合的止血剂的制备方法，其特征在于，按照如下工艺步骤进行1)微孔淀粉的活化称取一定量的微孔淀粉，在室温的真空干燥器中留置24-48小时，然后依次用5-10倍体积的无水乙醇洗涤两次和10-15倍体积的丙酮洗涤三次后，用G2砂心漏斗抽滤至干，于 40-45°C真空干燥器中留置24-48小时后，然后将微孔淀粉转入一个事先充满高纯氮气的容器中；2)抗菌剂的加入在上述充满高纯氮气的容器中，按每100克微孔淀粉加入10微克 100微克的抗菌剂与微孔淀粉搅拌混勻，所述的抗菌剂是基因重组抗菌肽CecropinA冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽CecropinB冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽CecropinC冷冻干燥纯品干粉、基因重组抗菌肽Cecropin D冷冻干燥纯品干粉或天然抗菌肽冷冻干燥纯品干粉；3)生长因子的加入在上述充满高纯氮气的容器中，再按每100克微孔淀粉加入生长因子5微克 50微克，所述的生长因子是表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子或酸性成纤维细胞生长因子或角质细胞生长因子其中之一，或者其中两种以上的组合，继续搅拌混勻，得到抗感染和促进伤口愈合的止血剂。
全文摘要
本发明涉及一种抗感染和促进伤口愈合的止血剂及其制备方法，制得的该止血剂由微孔淀粉为主要原料，每100克微孔淀粉中含有抗菌剂10微克～100微克和生长因子5微克～50微克。与传统止血剂相比，这种止血剂不但能够更迅速和有效的止血，而且能够对伤口进行消炎和抗感染并能够加快伤口的愈合。
文档编号A61K38/18GK102327601SQ20111028840
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者冀旭, 刘成程, 边六交 申请人:西北大学