促进伤口愈合的制剂及其制备方法及使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明相关于一种医药制剂，特别是相关于一种促进伤口愈合的制剂及其制备方 法及使用方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病为全球常见的慢性疾病，是一种生物体将葡萄糖（糖类）转换成能量的方 式出现变化的疾病。原因为身体无法制造足够的胰岛素，或是无法有效利用体内制造的胰 岛素以进行糖类的转换。糖尿病易引发多种并发症，其中之一为血管病变。高血糖使红血 球的细胞膜变硬，导致血流不易通过微细血管而到达伤口组织。且，糖尿病患体内的血红素 亦不易释放出氧气，而造成伤口组织缺氧以及营养素不足。此外，高血糖亦会影响纤维母细 胞以及上皮细胞的增生，因此，糖尿病患的伤口容易停滞在发炎期，而演变成慢性溃疡。
[0003]目前相关于糖尿病患者伤口愈合的治疗方式主要包括高压氧治疗、含银活性碳纤 维敷料、以及人类血小板衍生生长因子（platelet-derivedgrowthfactor,FOGF)凝胶。高 压氧治疗系将病患置于高压舱内，舱内加压并维持在2. 5绝对大气压下，使人经由其头上 所载的氧气面罩吸取纯氧气，以提高血中含氧浓度，进而改善组织缺氧、促进伤口愈合、以 及增强白血球的杀菌能力。然而此方式可能因高压造成肺部、耳膜、以及鼻窦的压力伤害、 因高浓度氧气而造成抽搐、以及治疗后因水晶体变肿而导致视力改变。再者，此治疗方式对 于病患极为不便，因病患无法自行于家中操作。含银活性碳纤维敷料系由PET不织布、含银 活性碳纤维布、以及聚乙烯（polyethylene,PE)膜三层结构所组成。当敷料接触伤口渗液 时，可藉由活性碳纤维本身良好的吸附性，以吸附血水渗液及细菌。同时，银离子可破坏细 菌的细胞膜及细胞核，而达到杀菌的效果。此外，活性碳纤维的远红外线的功能具有促进血 液循环以及加速新陈代谢的功效，进而缩短伤口愈合的时间。然而，此产品对于糖尿病患伤 口的愈合仍需花费较长的时间。且，将纳米银粒均匀镀设于活性碳纤维布上，是一件繁复 且加工不易的制作工序，加上纳米银粒的造价并不便宜，因而导致此产品的成本提高，从而 降低商业竞争力。另外，人类血小板生长因子凝胶，含有基因重组的人类血小板源生长因子 (Recombinatehumanplatelet-derivedgrowthfactor,rh-PDGF)，藉由其所含的生长因 子以促进伤口愈合，然而其费用昂贵。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的即在于提供一种促进伤口愈合的制剂及其制备方法及使用方法，能 藉由简易且成本相对较低的制备方法以制备出具有加速伤口愈合的制剂，且此制剂能随时 随地应用于病患身上。
[0005] 本发明为解决习知技术的问题所采用的技术手段提供一种促进伤口愈合的 制剂，包括细胞培养基（cellculturemedium),细胞培养基将经转质的内皮前躯细胞 (endothelialprogenitorcell)予以培养而形成，且经转质的内皮前驱细胞为将微小核 醣核酸（microRNA)let-7g转质至一内皮前驱细胞而形成。
[0006] 在本发明的一实施例中系提供一种制剂，细胞培养基于培养内皮前躯细胞之前系 为内皮细胞基础培养基（endothelialbasalmedium,EBM)。
[0007] 在本发明的一实施例中系提供一种制剂，还包括至少一种医药学上可接受的载 剂、稀释剂或赋形剂。
[0008] 在本发明的一实施例中系提供一种促进伤口愈合的制剂，赋形剂为一甘油。
[0009] 本发明为解决习知技术的问题所采用的另一技术手段系提供一种促进伤口愈合 的制剂的制备方法，包括以下步骤：分离步骤：自人类全血分离出单核球细胞，并将单核球 细胞种在涂布有人类纤维连接蛋白的孔盘（human-fibronectin-coatedplate)以得到内皮 前躯细胞；转质步骤：将微小核醣核酸let_7g转质至内皮前驱细胞，以得到经转质的内皮 前驱细胞；以及培养步骤：将经转质的内皮前驱细胞予以培养一预定时间而得到促进伤口 愈合的制剂。
[0010] 在本发明的一实施例中系提供一种制备方法，于培养步骤中，将经转质的内皮前 驱细胞的培养系为培养于内皮细胞生长培养基（endothelialgrowthmedium-2，EGM-2)7 天，并于第7天将内皮细胞生长培养基更换为内皮细胞基础培养基，接着持续培养2天以收 集内皮细胞基础培养基而得到促进伤口愈合的制剂。
[0011] 在本发明的一实施例中系提供一种制备方法，预定时间为6至10天。
[0012] 在本发明的一实施例中系提供一种制备方法，分离步骤中，藉由梯度剂 Histopaque-1077以密度梯度离心法自人类全血中分离出单核球细胞。
[0013] 本发明为解决习知技术的问题所采用的另一技术手段系提供一种促进伤口愈合 的方法，包括：将治疗有效量的制剂投予至一生物体的伤口。
[0014] 在本发明的一实施例中系提供一种促进伤口愈合的方法，生物体为一患有糖尿病 的患者。
[0015] 经由本发明所采用的技术手段，在本发明中，特别选用内皮前驱细胞以及微小核 糖核酸let_7g以共同制备出促进伤口愈合的制剂。其系因内皮前驱细胞具有分化成血 管内皮细胞，以修复不完整的血管内皮层，以及促使血管新生的能力。而微小核醣核酸中 let_7g则在过往研究发现其可保护血管内皮细胞，治疗及预防血管硬化等疾病。
[0016] 藉由将let_7g转质入内皮前驱细胞，以调控内皮前驱细胞的表现，并培养此经转 质let-7g的内皮前驱细胞，使内皮前驱细胞释放出具有加速伤口愈合的因子至培养基中。 此培养基不仅具有良好的治愈伤口的效果，且，制备方法简单，所费的时间及成本皆不高， 因此可普遍地应用于伤口不易愈合的患者，例如糖尿病患，而不增加病患于经济上的压力。 此外，本发明的制剂的使用方法为直接将制剂施用于病患的伤口处，操作方式简便而可随 时随地使用。
【附图说明】
[0017] 图1为显示根据本发明的一实施例的一促进伤口愈合的制剂的流程图。
[0018] 图2为显示根据本发明的实施例的一促进伤口愈合的制剂用于一测试糖尿病小 鼠伤口愈合表现的实验中，糖尿病小鼠的伤口建构的不意图。
[0019] 图3为显示根据本发明的实施例的促进伤口愈合的制剂用于测试糖尿病小鼠伤 口愈合表现的实验中，各组糖尿病小鼠伤口愈合程度的实际影像图。
[0020] 图4为显示根据本发明的实施例的促进伤口愈合的制剂用于测试糖尿病小鼠伤 口愈合表现的实验中，各组糖尿病小鼠伤口愈合速率的趋势的折线图。
[0021] 符号说明
[0022] S1 分离步骤
[0023]S2 转质步骤
[0024]S3 培养步骤
【具体实施方式】
[0025] 以下根据图1，而说明本发明的实施方式。该说明并非为限制本发明的实施方式， 而为本发明的实施例的一种。
[0026] 依据本发明的一实施例的一促进伤口愈合的制剂，包括细胞培养基（cell culturemedium)，细胞培养基将经转质的内皮前躯细胞（endothelialprogenitorcell) 予以培养而形成，且经转质的内皮前驱细胞为将微小核醣核酸（microRNA)let-7g转质至 一内皮前驱细胞而形成。
[0027] 详细而言，细胞培养基于培养内皮前躯细胞之前为内皮细胞基础培养基 (endothelialbasalmedium,EBM)，用以特别培养内皮前躯细胞。
[0028] 为了使本发明的促进伤口愈合的制剂稳定性佳、应用范围广泛、或减少其刺激性 等因素，本发明的制剂还包括至少一种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。举例而 言，将一甘油添加至制剂中，藉由甘油的黏性使得原本为液态的制剂转变为半流体，以便于 本制剂应用在外敷的用途上。
[0029] 在本实施例中，促进伤口愈合的制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0030] (1)分离步骤：自人类全血分离出单核球细胞，并将单核球细胞种在涂布有人类 纤维连接蛋白的孔盘（human-fibronectin-coatedplate)以得到内皮前躯细胞（步骤 S1)；
[0031] (2)转质步骤：将微小核醣核酸let_7g转质至内皮前驱细胞，以得到经转质的内 皮前驱细胞（步骤S2);以及
[0032] (3)培养步骤：将经转质的内皮前驱细胞予以培养一预定时间而得到促进伤口愈 合的制剂（步骤S3)。
[0033] 详细而言，在本实施例中系藉由梯度剂Histopaque-1077以密度梯度离心法自人 类全血中分离出单核球细胞以得到内皮前躯细胞。将l〇ml的梯度剂Histopaque-1077以 及l〇ml的人类全血加入50c.c.的离心管中均匀混合后，以700g的离心速度将其离心30 分钟，离心后收集含有高浓度的单核球细胞的棕黄层（buffy-coatlayer)。接着，将棕黄层 悬浮于 30ml的DMEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)中，以 250g的离心速度将其离 心10分钟，舍弃上清液且保留细胞团块，再将细胞团块悬浮于DMEM中并予以离心，并重复 此步骤2~3次以得到单核球细胞团块。最后，将单核球细胞团块回溶于内皮细胞生长培 养基-2(EndothelialCellGrowthMedium-2,EGM-2)，以 3xl06cells/ml的密度种在涂布 有人类纤维连接蛋白的孔盘以得到内皮前躯细胞。
[0034] 于转质步骤中，将75ng的let_7g稀释在100μ1的培养基中，并将之震荡以均匀 地混合。接着，加入3μ1的转质液至经稀释的let-7g，均匀混合后置于15~25°C的环境 下5~10分钟以形成转质复合物。将转质复合物加到内皮前躯细胞，静置3小时后，再加 入培养基以完成转质。
[0035] 于培养步骤中，将经转质let_7g的内