在骨形成中发挥调控作用的应力敏感性microRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及在骨形成中发挥调控作用的应 力敏感性microRNA。
【背景技术】
[0002] 机械应力刺激通过力学信号传导途径对于骨重建稳态的调控作用至关重要。作为 一种动力学器官，骨组织的结构和功能在很大程度上依赖于所处的力学环境。通过骨细胞， 成骨细胞等力学信号感受器感受机械应力刺激并将之转导为生物学信号传递至骨表面主 要的效应细胞（成骨细胞和破骨细胞）完成相关应答。成骨细胞的分化可由机械应力刺激 介导并引起系列激素，生长因子，转录因子等的级联反应，进而影响细胞增殖分化。临床上， 载荷缺失如长期卧床患者，长期处于重力缺失环境如宇航员可导致骨量丢失进而迅速进展 为废用性骨质疏松症。而长期超载荷状态如体育运动员将导致骨小梁微骨折进而进展为应 力性骨折或疲劳性骨折。
[0003] microRNAs(miRNAs)是一类内生单链，长度约为22个核苷酸的小分子非编码RNA， 在许多生物进程中起重要调控作用。通过转录后调节机制，miRNAs通过与靶基因mRNA的 3'UTR种子区域结合降解或抑制靶基因翻译进而抑制靶基因表达。miRNA调节着人类约三 分之一的蛋白编码基因，提示其在调控基因表达中的关键作用。多条miRNAs已在体外水平 被证实可通过靶标于成骨分化相关特异性基因的表达进而调控成骨分化进程。
[0004] 然而，关于机械应力载荷与miRNA的相互关系以及在成骨分化中的调控作用还有 待研究，有待找到适用于调控成骨分化的miRNA分子。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供在骨形成中发挥调控作用的应力敏感性microRNA。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种miR_103a的下调剂在制备预防或治疗骨代谢疾 病（为应力相关性骨代谢疾病，如宇航员长期太空微重力环境或长期卧床患者所导致的载 荷缺失导致的废用性骨质疏松症）的药物中的用途。
[0007] 在一个优选例中，所述的miR_103a抑制剂包括：化学合成的miR_103a抑制剂；以 表达质粒为载体的抑制miR-103a的病毒和非病毒产品；与miR-103a互补的核酸序列或序 列片段。
[0008] 在另一优选例中，所述的miR_103a的下调剂选自：antagomir-103a，其核苷酸序 列如SEQIDN0:49所示；或inhibitor-103a，其核苷酸序列如SEQIDN0:47所示。
[0009] 在另一优选例中，所述的miR-103a的下调剂是经修饰的下调剂，所述的修饰包括 (但不限于）：甲氧基化修饰、硫代修饰、胆固醇修饰、烷基修饰（如在核糖的2'位置进行 烷基修饰）、锁核酸修饰、肽核酸修饰、和/或磷酸骨架由磷脂连接代替的反义核苷酸；较佳 地，所述的antagomir_103a的修饰包括：3'端进行胆固醇修饰，5'端两个硫代骨架修饰，3' 端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。
[0010] 在另一优选例中，所述的药物还用于：
[0011] 增加Runx2蛋白的表达；
[0012] 增强成骨细胞分化中ALP和Ocn的表达水平；或
[0013] 增强胞外基质矿化。
[0014] 在本发明的另一方面，提供一种miR-103a的用途，用于筛选预防或治疗骨代谢疾 病的药物。
[0015] 在一个优选例中，所述的骨代谢疾病包括：骨质疏松、成骨分化异常、骨量丢失。
[0016] 在本发明的另一方面，提供一种预防或治疗骨代谢疾病的药物，所述的药物 是miR-103a的下调剂，选自：antagomir-103a，其核苷酸序列如SEQIDN0:49所示；或 inhibitor_103a，其核苷酸序列如SEQIDN0:47所不。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种筛选预防或治疗骨代谢疾病的潜在物质的方法， 所述方法包括：
[0018] (1)用候选物质处理表达miR-103a的体系；和
[0019] (2)检测所述体系中miR_103a的表达；
[0020] 其中，若所述候选物质可降低miR_103a的表达，则表明该候选物质是预防或治疗 骨代谢疾病的潜在物质。
[0021] 在一个优选例中，所述的体系中还表达Runx2蛋白，所述方法还包括：检测所述体 系中Runx2蛋白的表达；
[0022] 其中，若所述候选物质通过下调miR_103a的表达而增加（优选显著增加，如增加 20%以上，较佳的增加50%以上；更佳的增加80%以上）Runx2蛋白的表达，则表明该候选 物质是预防或治疗骨代谢疾病的潜在物质。
[0023] 在另一优选例中，步骤（1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达miR_103a或 共表达miR-103a和Runx2蛋白的体系中；和/或
[0024] 步骤⑵包括：检测测试组的体系中miR_103a和/或Runx2蛋白的表达，并与对 照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miR-103a和/或Runx2蛋白的 体系；
[0025] 如果测试组中miR_103a的表达在统计学上低于（优选显著低于，如低20%以上， 较佳的低50%以上；更佳的低80%以上）对照组，或还使得Runx2蛋白的表达显著增加，就 表明该候选物是预防或治疗骨代谢疾病的潜在物质。
[0026] 在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系（或细胞培养物体系）、亚细胞体系、 溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
[0027] 在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验 和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗骨代谢疾病有用的物 质。
[0028] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0029] 图1、应力载荷促进体内骨重建、骨形成。
[0030] (a)实验小鼠模型设计BS，baseline基准组。WB，weightbearing承重组。HU, hind-limbunloading后肢去负荷组；
[0031] (b-h)BS，WB，HU组小鼠远端股骨骨重建相关参数指标分析。（b)WB组和HU组小 鼠股骨大体形态改变（c)BS，WB，HU组小鼠股骨远端microCT骨结构。标尺，1mm。（d)BS， WB，HU组小鼠股骨远端microCT三维骨骨密度等指标。（e)各组小鼠中钙黄绿素双标实 验反映新骨形成情况。标尺，l〇ym。（f)BS，WB，HU组小鼠骨组织形态学分析：骨形成相 关参数指标（〇b.S/BS，MAR和N.Ob/B.Pm)检测。（g)BS，WB，HU组小鼠远端股骨TRAP染 色（Tartrate-resistantacidphosphatase，TRAP，抗酒石酸酸性憐酸酶染色染色）。标 尺，100μm。（h)BS，WB，HU组小鼠组织形态学分析：骨吸收相关参数指标（0c.S/B.S，N. 0c/ B.Pm)分析。
[0032] *Ρ〈0· 05,林Ρ〈0· 01，*林Ρ〈0· 001。NS，无显著性差异。P值计算基于Student'st test。数据以平均值土标准差表示，代表4次独立实验。
[0033] 图2、CMS载荷在体外水平调控成骨细胞分化
[0034] (a)人股骨近端有限兀分析模型（Athree-dimensionalfiniteelement， FE，含29841有限元元素）。FE分析显示人股骨近端骨组织承载的应力载荷约为 815±57με(375με~1，583μe)Q(b)8%CMS载荷加载hFOBl.19人成骨细胞系3天后， 9訂-?0?检测0〇141^，(：〇11&1表达水平，以静置组为参照。（(3)8%013载荷加载1^(?1.19 人成骨细胞系3天后ALP定量检测，以静置组为参照。（d) 8 %CMS载荷加载hFOBl. 19人成骨 细胞系3天后，ALP染色检测，以静置组为参照。标尺，10mm。（e) 8%CMS载荷加载hFOBl. 19 人成骨细胞系3天后，细胞骨架免疫荧光染色显示较之静置组细胞骨架微丝发生向心性重 排列。（f) 8%CMS载荷加载hFOBl. 19人成骨细胞系3天，细胞增殖无显著性差异，以静置 组为参照。（g)8%CMS载荷加载hFOBl. 19人成骨细胞系3天后，Westernblot检测Wnt/ β-catenin和Erkl/2MAPK信号通路活化程度。（h)8%CMS载荷加载hFOBl. 19人成骨细胞 系3天后，Westernblot检测Runx2蛋白表达水平变化，以静置组为参照。（i)8%CMS载 荷加载hFOBl. 19人成骨细胞系3天后，qRT-PCR检测Runx2的mRNA表达水平变化，以静置 组为参照。
[0035] *Ρ〈0· 05,林Ρ〈0· 01，*林Ρ〈0· 001。NS，无显著性差异。P值计算基于Student'st test;数据以平均值土标准差表示，代表3次独立实验。
[0036] 图3、miR_103a在体外水平通过靶标于Runx2抑制成骨细胞功能。
[0037] (a)TargetScan，miRDB，miRanda和miRWalkmiRNA革巴基因预测筛选软件生物信 息学分析筛选Runx2标靶。（b) 8%CMS加载hFOBl. 19人成骨细胞系3天后，qRT-PCR检测 预筛选miRNAs的表达水平变化。miRNAs的表达变化比率比例倍数以静置对照组为参照。 (c)hFOBl. 19人成骨细胞系中，12条筛选miRNAs及U6内参对WTRunx2 3'UTR双荧光素 酶报告载体活性的影响。（d)在hFOBl. 19人成骨细胞系中，Westernblot检测12条筛选 miRNAs及U6内参对Runx2蛋白表达水平的影响。（e)在hFOBl. 19人成骨细胞系中分别转 染mimic-103a，inhibitor_103a及其对应NC参照（mimic-NC，inhibitor-NC)后，qRT-PCR 检测miR-103a的表达水平变化。（f)在hFOBl. 19人成骨细胞系中分别转染mimic-103a， inhibitor_103a及其对应NC参照（mimic-NC，inhibitor-NC)后，Westernblot检 测Runx2蛋白水平表达变化。（g)在hFOBl. 19人成骨细胞系中分别转染mimic-103a， inhibitor_103a及其对应NC参照（mimic-NC，inhibitor-NC)后，qRT-PCR检测Runx2 的mRNA水平表达变化。（h)WTRunx23'UTR双荧光素酶报告载体及MutantRunx2 3'UTR双 突光素酶报告载体不意简图。hRluc，humanRenillaluciferase人海肾萤光素酶。（i) 在hFOBl. 19中分别转染mimic-103a，inhibitor-103a及其对应NC参照后，检测WTRunx2 3'UTR，MUTRunx2 3'UTR双荧光素酶报告基因活性。
[0038] *Ρ〈0· 05,林Ρ〈0· 01，*林Ρ〈0· 001。NS，无显著性差异。P值计算基于Student'st test;Real-timePCR以GAPDH为内参。*Ρ〈0· 05 ;#Ρ〈0· 01 ;数据以平均值土标准差表示， 代表3次独立实验。
[0039] 图4、miR_103a在体外CMS介导的成骨细胞分化过程中对成骨分化起负调控作用
[0040] (a)qRT-PCR显示8%CMS介导的hFOBl. 19人成骨细胞系分化中miR_103a的表 达水平（8%elongation,Sin,0.5Hz，3d)。miR_103a的表达以静置组对照为参照。（b) miR-103a和miR-107在基因组中定位示意简图。PANK基因的外显子以长方形表示，内含子 以曲线标识。（c) 8%CMS加载hFOBl. 19人成骨细胞系3天后，qRT-PCR检测PANK2和PANK3 表达水平。（d) 8%CMS加载hFOBl. 19人成骨细胞系21天，qRT-PCR检测成骨细胞分化成 熟胞外基质矿化过程中miR-103a的表达水平（上）；Westernblot检测Runx2蛋白表达水 平（下）。（e) 8 %CMS加载hFOBl. 19人成骨细胞系21天，qRT-PCR检测成骨细胞分化成熟 胞外基质矿化过程中〇cn，ALP，Runx2mRNA表达水平。
[0041] *Ρ〈0·05,林Ρ〈0·01，*林P〈0.00