颗粒蛋白前体pgrn在治疗脓毒症中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及医药生物技术领域，特别涉及PGRN新的药物用途。
【背景技术】
[0002]脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)，其病情凶险，病死率高，且发病率呈不断增长的趋势。据统计，全球每年有1800万人发病。在美国，脓毒症患者死亡率占住院患者的17%。而在中国，一项多中心的流行病学调查显示ICU严重Sepsis的发生率是8.68%，死亡率高达44.7%。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，Sepsis的病死率仍高达30%?70%，而在休克患者中其死亡率则高达70%?90% depsis治疗花费高，医疗资源消耗大，严重影响人类的生活质量，已经对人类健康造成巨大威胁。对此，欧洲重症学会、美国重症学会和国际脓毒症论坛发起“拯救脓毒症战役” (surviving sepsis campain，SSC)，2002年欧美国家多个组织共同发起并签署“巴塞罗那宣言”，并且进一步制定基于对脓毒症研究的循证医学证据，不断更新脓毒症治疗指南即SSC指南，以改进Sepsis的治疗措施，降低Sepsis的死亡率。
[0003]脓毒症是一种全身炎症反应综合征，与其他非感染因素引起的自身免疫性疾病的发生发展过程以及病理机制均不同，脓毒症进一步发展常引发多器官功能障碍综合征，弓丨起多器官功能衰竭，是引起患者死亡的主要原因。
[0004]由于脓毒症发生机制十分复杂，涉及感染、炎症、免疫、凝血及组织损害等一系列生理病理过程。感染导致释放的炎症因子通过神经-内分泌-免疫系统调动了全身多种细胞和多个脏器系统，构成了复杂的网络，级联放大，相互制约。因此临床救治十分困难，目前尚缺乏有效的诊治手段。目前的质量方法是以抗菌治疗和针对各系统改变的综合治疗为主，但仍然难以取得预期的效果，死亡率仍居高不下。鉴于脓毒症是由感染引发的全身炎症反应综合征，其失控性的炎症因子导致的免疫功能紊乱是导致患者多器官功能障碍而死亡的主要原因之一。
[0005]颗粒蛋白前体(Progranulin，PGRN)，也叫granulin/epithelin precursor ,proepithelin，acrogranin，或prostate cancer cell-derived growth factor，由GRN基因编码。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于在脓毒症复杂调控网络中，寻找到新的治疗、诊断、预防靶点，对脓毒症的防治带来新的突破。
[0007]本发明的目的是通过以下措施实现的:
[0008]颗粒蛋白前体(Progranulin，PGRN)在制备治疗、诊断或预防脓毒症药物中的用途。
[0009]优选地，颗粒蛋白前体(Pr ο gr anu 1 i η，PGRN)在制备治疗、诊断或预防脓毒症药物中的用途，剂量为0.1-10g/kg。
[0010]本发明提供了颗粒蛋白前体(PGRN)在脓毒症的治疗、诊断、预防中的应用，给予外源性的PGRN能够对脓毒症有显著治疗作用，可显著提高其生存率。
[0011]本发明发现PGRN缺失导致机体清除细菌的能力减弱，脾脏淋巴细胞凋亡增加，并使肝肺肾等多器官炎症损伤加重，通过给予外源性的PGRN蛋白，可以显著提高小鼠的生存率。
【附图说明】
[0012]图1:脓毒症患者血中PGRN检测实验:A为成年脓毒症患者血标本，B为儿童脓毒症患者的血楽标本。
[0013]图2动物脓毒症模型中PGRN检测实验:A标本为血清，B为腹腔灌溪液
[0014]图3细菌载量实验:A、B、C分别代表血、腹腔灌溪液和脾脏标本
[0015]图4各器官损伤的病理学检测
[0016]图5小鼠脓毒症模型中脾脏的淋巴细胞凋亡实验
[0017]图6脓毒症动物模型的生存率检测
[0018]图7给予外源性的PGRN蛋白后生存率检测。其中A实验对象为WT小鼠，B为PGRN—^一小鼠
[0019]图8 CLP建模过程图
图9流式细胞术检测PLF中的巨噬细胞结果图10脓毒症模型给予PGRN后生存率结果。
【具体实施方式】
[0020]以下所述是本发明的优选实施例，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
[0021 ] 实施例1
[0022]脓毒症动物模型的建立(盲肠结扎穿刺术Cecal ligat1n and puncture,CLP)
[0023]实验动物:实验所用小鼠为雄性，体重为18_22g，约6-8周龄。饲养在重庆医科大学实验动物中心SPF(Specific Pathogen Free)级实验室。该实验所用小鼠均为SPF级实验动物。野生型C57BL/6小鼠(Wild type，WT)购买自重庆医科大学实验动物中心，C57BL/6背景来源的PGRN基因敲除小鼠(PGRN—Λ)购买自美国的The Jackson Laboratory。
[0024]方法:成年C57小鼠，以100微升1.5%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，固定于操作板，腹部用宠物电推剪剃毛，消毒皮肤，于腹正中做lcm长的切口，结扎盲肠，以26号注射器针头穿刺，如图8。最后缝合伤口，消毒皮肤。(具体参考:Daniel Rittirsch，Peter AWard ? et al.1mmunodesign of experimental sepsis by cecal ligat1n andpuncture.Nat Protoc.2009; 4(1): 31-36)。该建模方法是脓毒症动物模型的经典建模方法，且该建模方法是目前研究脓毒症的金标准动物模型。
[0025]细菌载量的测定:
[0026]将小鼠建模24小时后，麻醉小鼠，固定，分别取腹腔灌洗液(Peritoneal lavagefluid，PLF)、心脏血和脾脏，将腹腔灌洗液和血做10倍系列稀释后取100微升铺板，脾脏先匀浆，然后做10倍系列稀释后取100微升铺板，18-24小时后计数血琼脂平板上的菌落数。
[0027]结果如图3所示，与WT小鼠相比，PGRN—Λ小鼠在建立脓毒症模型后，其PLF，血液和脾脏中具有更高的细菌载量，其机体清除细菌的能力减弱，PGRN缺失不利于细菌清除。
[0028]各器官损伤的病理学检测:
[0029]分别将WT小鼠和PGRN—Λ小鼠建脓毒症模型，在6小时和24小时后将小鼠麻醉后处死，取肺、肝、脾、肾，于4%多聚甲醛中固定24-48小时，分别进行脱水、浸蜡、包埋、切片，经HE染色后于显微镜下镜检。
[0030]结果如图4所示，与WT相比，PGRNV—小鼠各器官损伤明显加重，从病理切片可见明显的炎症加重，炎症细胞浸润，蛋白炎性渗出，组织充血水肿，细胞坏死等表现。以下几个生化指标反映的细胞损伤情况，其中ALT和AST是反映肝损伤的指标，ALT和AST升高提示干细胞损伤严重。LDH是反映肾脏、肺脏和心肌损伤的指标，LDH升高说明损伤较重。
[0031 ] 将WT小鼠和PGRN—Λ小鼠建模后，分别在6h和24h将小鼠麻醉后处死，取脾脏，经4 %多聚甲醛固定24小时后，进行脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片，然后用TUNEL法(DAB显色)检测细胞凋亡，结果如图5所示:与WT小鼠相比，PGRNV—小鼠脾细胞凋亡显著增加，且24小时比6小时更加明显，PGRN缺失加剧了脓毒症时淋巴细胞的凋亡。
[0032]生存率实验:
[0033]将小鼠建脓毒症模型，盲肠大部结扎，做重症脓毒症模型，观察记录小鼠的生存情况，每天观察两次，连续观察2周，至小鼠不再死亡为止。
[0034]结果如图6所示，与WT相比，PGRN—Λ小鼠生存率显著降低。表现为PGRN—Λ小鼠在建立脓毒症模型三天之内全部死亡，生存率降为0，而WT小鼠在建立脓毒症模型后仍能长期存活。说明PGRN缺失不利于小鼠在脓毒症中的生存。
[0035]ELISA检测样本中的PGRN:结果如图1和图2所示，PGRN在脓毒症的患者和动物体内均表达显著升高。
[0036]外源PGRN对脓毒症的治疗效果:
[0037]PGRN(重组的小鼠PGRN蛋白(Recombinant Mouse Progranul in)购买自美国的R&D公司)
[0038]建模后2小时之内经腹腔给予建模小鼠注射20ygPGRN，然后将伤口缝合，消毒皮肤。观察记录小鼠的生存情况，每天观察两次，连续观察2周，至小鼠不再死亡为止。
[0039]结果如图7所示，建模后，无论是WT小鼠还是PGRN—Λ小鼠，给予外源性的PGRN均能显著提高小鼠的生存率。
[0040]如图7(A)，将WT小鼠分为三组，对照组(假手术组)、治疗组(脓毒症模型)和非治疗组(脓毒症模型)，从图中可以看出，非治疗组在建模后5天小鼠全部死亡，而PGRN治疗组在建模10天后仍能保持大约50%的生存率。
[0041 ]如图7(B)，用PGRNV—小鼠重复上述实验得出了一致的结果，即PGRN治疗组在建模两周后仍能保持大约50%的生存率，直至小鼠不在死亡。而非治疗组的小鼠建模后最终全部死亡，生存率降为0。
[0042]以上两组实验均说明PGRN对小鼠脓毒症具有良好的治疗效果。
[0043]PLF中巨噬细胞的检测:
[0044]将WT小鼠和PGRN—/―小鼠建立脓毒症模型，分别在6小时和24小时取PLF，以PE标记的抗F4/80抗体和APC标记的抗⑶1 lb抗体标记细胞，经流式细胞术检测PLF中的巨噬细胞比例，结果如图9所示。然后给予WT小鼠腹腔注射200μ1 Clophosome将小鼠体内的巨噬细胞敲除掉之后，再建立脓毒症模型，然后再给予PGRN治疗，结果如图10所示。
[0045]与WT小鼠相比，PGRN—/―小鼠在建模后，PLF中的巨噬细胞显著减少，即PGRN—八小鼠募集巨嗤细胞的能力减弱。
[0046]本发明首次发现PGRN作为药物治疗脓毒症的作用，通过用WT小鼠和PGRN—Λ小鼠建模后细菌载量和生存率等实验发现PGRN在脓毒症中发挥作用的保护性作用，注入外源性的PGRN能够对脓毒症起到显著的治疗作用，明显提高其生存率。该治疗效果显著客观，具有良好的临床应用前景。
【主权项】
1.颗粒蛋白前体在制备治疗、诊断或预防脓毒症药物中的用途。2.颗粒蛋白前体在制备治疗、诊断或预防脓毒症药物中的用途，剂量为0.1-10g/kg。
【专利摘要】本发明提供了颗粒蛋白前体（PGRN）在制备治疗、诊断或预防脓毒症的治疗中的应用，有效提高了脓毒症的生存率。本发明为脓毒症的诊断、治疗、预防寻找到新的靶点，带来新的技术突破。
【IPC分类】A61K38/18, A61P31/00, A61P31/04
【公开号】CN105457017
【申请号】CN201610017964
【发明人】曹炬, 尹一兵, 宋志新, 徐昉
【申请人】重庆医科大学, 曹炬
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月12日