Smad7的治疗应用
【专利说明】SMAD7的治疗应用
[00011本申请是申请号为201180051033.3的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申 请PCT/US2011/052499的中国国家阶段申请。
[0002] 申请号为201180051033.3的中国专利申请要求2010年9月22日提交的美国临时申 请序列号61/385，445的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
[0003] I.联邦资助研究
[0004]本发明的实施方案的一部分由美国国立卫生研究院授予的资助号GM70966支持。 美国政府享有本发明的某些权利。 N.技术领域
[0005]本发明一般地涉及肿瘤和癌症治疗、炎性疾病及慢性伤口愈合领域。更特别地，本 发明涉及用于治疗炎性疾病、慢性伤口愈合/溃疡和由化学治疗和放射治疗以及军人/工 人/安全员/救援人员过度暴露于放射所引起的副作用的方法和组合物。在某些实施方案 中，副作用可包括口腔粘膜炎、肠粘膜炎和骨髓衰竭。在一些具体的实施方案中，提供了 Smad7(mothersagainstdecapentaplegic-7)蛋白组合物预防或治疗上述适应症的用途。 NI.【背景技术】
[0006]炎症是生物体去除损伤性刺激和起始愈合过程的保护性尝试。没有炎症，伤口和 感染永远不会愈合。类似地，组织的进展性破坏将危害生物体的存活。但是，慢性炎症也可 引起多种疾病，例如花粉热、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、银肩病甚至癌症(例如，胆囊 癌），而急性炎症可通过对急性刺激的过度应答而引起损伤。因此，炎症通常受到机体的密 切调节。
[0007] 如上所述，炎症可分为急性或慢性。急性炎症是机体对有害刺激的初始应答，并且 是通过血浆和白细胞(特别是粒细胞)从血液到受损组织增加的移动实现的。一系列生物化 学事件传播炎性应答并使其成熟，涉及局部血管系统、免疫系统和受损组织内的多种细胞。 持久的炎症(称为慢性炎症）引起存在于炎症部位的细胞类型的进展性改变，并且特征在于 组织在炎性过程中同时破坏和愈合。
[0008]急性炎症在组织损伤后数秒至数分钟之内开始。损伤可以是纯物理损伤，或者其 可涉及免疫应答的活化。发生3个主要过程：（a)由血管(小动脉)扩张引起增加的血流供应 该区；（b)毛细血管增加的渗透性使得流体和血液蛋白质移动进入间质空间；以及(c)嗜中 性粒细胞（以及可能少许巨噬细胞)迀移出小静脉并进入间质空间。
[0009] -种特定类型的炎性损伤源于治疗剂的使用，许多治疗剂旨在于患病组织或器官 中产生炎症，但不幸的是，它们很少能够特异性地靶向那些区域。例如，超过80%的口腔癌 患者采用放射治疗来治疗，而这些个体中的至少75 %将发生口腔粘膜炎。口腔粘膜炎还发 生于接受造血干细胞移植的患者和需要放射治疗和/或化学治疗的其它癌症患者中，并且 通常是放射治疗最严重的并发症。严重的口腔粘膜炎极其疼痛，并且不利于经口摄取。患有 口腔粘膜炎的对象通常需要长期疼痛药物治疗以缓解该病症的症状。除炎症之外，化学和 放射诱导的DNA损伤和细胞死亡二者也引起骨髓衰竭，导致死亡。这只是两个实例，如果更 好地调节，不仅可以显著节省医疗保健花费，还可以在相当大程度上防止痛苦、患者的功能 丧失、死亡。
【发明内容】
[0010] 因此，根据本发明，提供了用于在对象中治疗炎性病症和/或组织损伤病症的方 法，其包括向所述对象提供治疗有效量的Smad7(mothersagainstdecapentaplegic homolog7)aSmad?可作为蛋白质、编码Smad7蛋白的表达载体（例如病毒载体或非病毒载 体)提供。组合物可包含与蛋白质转导结构域(PTD)融合的Smad7蛋白，并且所述Smad7蛋白 融合物还可包含防止Smad7在不存在活化剂时发挥功能的调节结构域，所述方法还包括提 供所述活化剂。Smad7可于贴剂(patch)上的制剂中、凝胶状组合物中、在微球中、在微珠中 或在其组合中提供。所述贴剂可包括生物可降解贴剂，例如藻酸聚合物(alginate)。
[0011]Smad7可局部提供到受影响的区域或者全身提供。所述方法还可包括向所述对象 施用第二粘膜炎治疗，例如粘性2%利多卡因、小苏打溶液(bakingsodasolution)、盐水 溶液、ΒΑΧ溶液(利多卡因、苯海拉明、山梨醇和胃能达(Mylanta))、i3胡萝卜素、生育酚、激光 照射、硝酸银、米索前列醇(misoprostol)、甲酰四氢叶酸（leucovorin)、全身性角质形成细 胞生长因子、己酮可可碱(pentoxifylline)、别嘌呤醇、全身性硫糖铝、葡萄糖酸氯己定或 冷冻治疗。所述组合物可包含可检测标志物。所述炎性病症选自：粘膜炎、银肩病、自身免疫 病、慢性伤口、创伤(trauma)、化学治疗、放射治疗或细胞因子治疗。所述方法还可包括再次 向所述对象施用所述组合物。
[0012] 在另一实施方案中，提供了用于在进行放射治疗和/或化学治疗的对象中治疗或 预防口腔粘膜炎的方法，其包括向所述对象提供治疗有效量的Smad7(mothers against decapentaplegic homolog 7)cSmad?可作为蛋白质、编码Smad7蛋白的表达载体(例如病毒 载体或非病毒载体)提供。组合物可包含与蛋白质转导结构域(PTD)融合的Smad7蛋白，并且 所述Smad7蛋白融合物还可包含防止Smad7在不存在活化剂时发挥功能的调节结构域，所述 方法还包括提供所述活化剂。Smad7可于贴剂上的制剂中、在凝胶组合物中、在微球中、在微 珠中或在其组合中提供。贴剂可包括生物可降解贴剂，例如藻酸聚合物。
[0013]Smad7可局部提供到受影响的区域或者全身提供。所述方法还可包括向所述对象 施用第二粘膜炎治疗，例如粘性2 %利多卡因、小苏打溶液、盐水溶液、ΒΑΧ溶液(利多卡因、 苯海拉明、山梨醇和胃能达）、β胡萝卜素、生育酚、激光照射、硝酸银、米索前列醇、甲酰四氢 叶酸、全身性角质形成细胞生长因子、己酮可可碱、别嘌呤醇、全身性硫糖铝、葡萄糖酸氯己 定或冷冻治疗。所述对象可包括具有移植物的对象、患癌症的对象或患需要放射治疗之病 症的对象，所述对象患癌症时所述癌症选自：口腔癌、结肠癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌和用 上半身放射或重复的化学治疗周期治疗的其它癌症。所述对象可以已接受上半身放射。该 方法还可包括再次向所述对象施用所述组合物。
[0014] 在又一实施方案中，提供了用于在对象中治疗口腔粘膜炎的药盒，其包含：（a) Smad7试剂组合物；和(b)递送系统。所述试剂可包括Smad7蛋白，其任选地与蛋白质转导结 构域(PTD)融合，和/或任选地与防止Smad7在不存在活化剂时发挥功能的调节结构域融合， 并且所述药盒还包含所述活化剂。所述试剂可以是Smad7表达载体，例如病毒表达载体或非 病毒表达载体。所述递送系统可包括凝胶、油膏或贴剂递送系统。所述组合物可以是冻干 的。所述药盒还可包含可药用缓冲剂、溶剂或稀释剂。
[0015] 一些实施方案涉及在患有或被怀疑发生口腔粘膜炎或银肩病的对象中上调TGF-β 和/或NF-κΒ抑制分子。在某些实施方案中，本文的组合物和方法涉及对对象诱导Smad7 (mothersagainstdecapentaplegichomolog7)基因或蛋白水平或者引入Smad7组合物以 治疗患有本文所公开之病症的对象。另一些实施方案涉及在有此治疗需要的对象中过表达 Smad7(mothersagainstdecapentaplegichomolog7)基因和/或诱导Smad7蛋白水平。一 些实施方案涉及使用Smad7重组形式的组合物在对象中表达Smad7。
[0016]本文的另一些实施方案涉及在接受或将接受放射治疗或化学治疗的对象中治疗 或预防口腔粘膜炎。在某些实施方案中，这些对象正接受癌症治疗，所述癌症包括但不限于 口腔癌、头颈癌和使用重复的化学治疗周期治疗的其它癌症，包括但不限于结肠癌、乳腺 癌、胰腺癌和其它癌症。
【附图说明】
[0017]以下附图构成本说明书的一部分并且用来进一步说明本发明的某些实施方案。通 过参考这些附图中的一个或更多个并联合本文给出的一些具体实施方案的详细描述可以 更好的理解实施方案。
[0018] 图1.Smad7转基因小鼠对放射诱导的口腔粘膜炎的抗性。H&E中的虚线突出上皮-基质边界。Smad7小鼠有完整的口腔上皮层，但野生型(wt)小鼠有口腔溃疡。pH2AX(DNA损伤 的标志物(绿色））在口腔粘膜炎的wt上皮(K14，红色）中明显，但在Smad7转基因病变中显著 减少。针对总白细胞(棕色)染色的⑶45在野生型病变中示出严重炎症，但在Smad7转基因病 变中显著减少。CD45免疫染色在角质层中具有非特异性染色。就免疫染色而言，取邻近溃疡 的野生型上皮图像，并且从大多数白细胞接近基膜的区域取Smad7图像。
[0019] 图2 .Smad7转基因表达逆转K5 .TGFmwt小鼠的银肩病。上图：3周龄K5 .TGFmwt/K5.Smad7小鼠（光滑皮肤)及其胞小鼠（发炎的皮肤，眼睛和耳朵)的总体外观。 下图：K5.TGFmw^肤示出表皮增生和皮肤炎症，但K5.Smad7皮肤和K5.Smad7/TGFmwt皮肤 与正常野生型(WT)皮肤类似。
[0020] 图3.Tat-Smad7蛋白转导入角质形成细胞。左图和中图：经转导细胞的Tat-Smad7 染色（绿色），由角蛋白K14抗体(红色)复染。右:pSmad2(绿色)对经载剂处理的（对照）角质 形成细胞有染色，但对转导有Tat-Smad7的细胞没有。使用V5抗体的Tat-Smad7染色示出经 转导细胞的核和/或胞质染色，但对照细胞并非如此。
[0021] 图4.Tat-Smad7蛋白到口腔粘膜的局部递送。左:经PBS缓冲剂处理的颊粘膜。右： 经口Tat-Smad7处理后24小时的颊粘膜。使用V5抗体对Tat-Smad7进行染色（由K14抗体复 染)。
[0022]图5.由Tat_Smad7蛋白引起的皮肤的炎症消除。上：处理前，K5.TGFi31小鼠的总体 照片及其皮肤活检的切片，由于严重炎症而具有加厚(起皱)的皮肤和皮疹。下:相同的小鼠 处理后27天示出显著的改善，具有减少的pSmad2和NFkBp50。经载剂处理的小鼠显示效果 (未显示）。虚线突出了表皮。
[0023]图6.20Gy照射后，由Tat_Smad7蛋白的经口处理引起的加速的体重恢复。在照射后 第5天开始每日的Tat-Smad7处理。用16Gy照射给出类似的结果(未示出）。* :p<0.05。 [0024]图7.经口Tat_Smad7处理加速口腔粘膜炎的愈合。上图中的黑色虚线突出受损区 域的中心，白色虚线突出上皮-基质边界。注意在20Gy照射后第9天(D9)，经载剂对照处理的 口腔粘膜发生口腔粘膜炎，上皮层完全损失，而经Tat_Smad7处理的粘膜保留了口腔上皮薄 层和大量浸润白细胞。到第14天，对照粘膜完成了再上皮化，基质中具有薄的未分化上皮和 大量白细胞，而经Tat_Smad7处理的粘膜具有几乎完全恢复的形态和分化。用16Gy照射在第 9天诱导对照小鼠的口腔上皮变薄，但经Tat-Smad7处理的口腔上皮并非如此。
[0025]图8.Tat_Smad7消除了放射诱导的口腔粘膜炎的损伤。所有切片来自紧邻20Gy照 射后第14天的受损区域中心的口腔粘膜，CD45染色除外，其选自照射后第9天损伤最严重的 区域。使用K14抗体来复染上皮层(除了在Tunel测定中）。
【具体实施方式】
[0026]如上所述，超过80%的口腔癌患者使用放射来治疗，并且这些个体中的至少80% 发生口腔粘膜炎。此外，使用标准化学治疗方案或上半身放射来治疗的个体中至少40%和 多至70%发生口腔粘膜炎。例如，由于反复化学治疗，约70%的结肠癌患者发生严重的口腔 粘膜炎。因此，口腔粘膜炎的治疗仅在美国就与数百万患者相关。目前，仍然没有用于癌症 患者口腔粘膜炎的真正有效的疗法。其它炎性疾病状态对改良疗法有类似的需要。
[0027]在下文中公开的Smad7疗法将对口腔粘膜炎及其它慢性、急性或周期性/间歇性炎 性状态具有显著的治疗作用。因为与现有疗法(例如，Kepivance?)相比，该蛋白质对炎 症具有强得多的作用，并且更好地促进伤口愈合，因为局部治疗可以是使用者友好的（例 如，由患者施用口服溶液、凝胶或贴剂），所以这些疗法代表了相当大的进步。的确，因为严 重口腔粘膜炎患者通常需要延长的住院时间以应付进食管、脱水和施用阿片类以控制疼痛 感，所以本文所述的实施方案代表改善患者的生活质量并显著减轻医疗花费负担的重大机 会。
[0028]使用Smad7作为口腔粘膜炎治疗剂的该方法是完全独特的。特别地，本发明人提出Smad7蛋白可容易地重组产生并直接使用或者包封进转导靶细胞的递送载剂(例如贴剂、溶 液和凝胶）中使用并发挥生物活性。此外，该类型的Smad7递送因而应示出有几乎没有副作 用的治疗效力。但是，也涵盖Smad7的病毒载体递送以及体内诱导和活化。
[0029] 根据本发明的多种实施方案，可以采用本领域技术中的常规分子生物学、微生物 学和重组DNA技术。在文献中充分地解释了这些技术。参见，例如，Sambrook等（1990)。
[0030] A.Smad7 组合物
[0031 ]