治疗脓毒症的方法

专利名称：治疗脓毒症的方法
本申请要求于1998年10月22日提交的，临时申请序列号为No.60/105,239的申请的优先权。
本发明涉及医疗科学，尤其是利用蛋白C和杀菌通透性增加(BPI)蛋白所进行的脓毒症的治疗。
蛋白C是一种丝氨酸蛋白酶和天然存在抗凝剂，其通过在凝聚级联中灭活因子Ⅴa和Ⅷa，从而在止血中发挥其作用。人蛋白C以2-链酶原的形式在体内循环，但经凝血酶和细胞表面膜蛋白-凝血调控蛋白的限制性蛋白水解后，其将转变为活化的蛋白C(aPC)，该蛋白会在内皮和血小板表面起作用。
连同其他蛋白，aPC可能是以血液凝聚的最重要的负调节物起作用，故可防止血栓的生成。除了抗凝聚功能外，通过抑制细胞因子(如TNF和IL-1)的产生，aPC具有抗炎症效果，并且aPC还有血纤维蛋白溶酶原的性质，故可促进血凝块的裂解。因而，蛋白C酶系统代表了主要的抗凝聚，抗炎症和血纤维蛋白溶解的生理学机制。
杀菌通透性增加蛋白(BPI)是从哺乳动物多形核嗜中性细胞(PMNs)颗粒中分离得到的一种蛋白。通过酸提取和层析的方法(Elsbach,1979,J.Bio.Chem.254:11000；Weiss et al.1987,Blood69:652)，人们已从PMNs中分离得到人BPI，该蛋白具有有效的针对广谱革兰氏阴性菌的杀菌活力。除了具有针对革兰氏阴性菌的杀菌作用外，BPI还能结合并中和脂多糖(LPS)。由于其刺激的炎症应答，LPS还被认为是一种内毒素。
脓毒症，包括严重性脓毒症和脓毒性休克，是对感染或外伤的系统性炎症应答，该应答涉及并由众多宿主防御机制的激活所介导，上述宿主防御机制包括细胞因子网，白细胞和补体，和凝聚/血纤维蛋白溶解系统。[Mesters，等Blood 88:881-886,1996]。散布的血管内凝聚[DIC]具有多器官的微血管内纤维蛋白的广泛沉积的特征，其是脓毒症和脓毒性休克的早期表现。DIC在多器官衰竭综合症的发生过程中是一种重要的介质，并使脓毒性休克病人预后不良。[Fourrier,等Chest 101:816-823,1992]。
脓毒症可由细菌(革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌)，真菌，病毒和其他的感染，以及非传染性刺激物如复合外伤，严重烧伤和器官移植等引发。
虽然任何细菌感染均能导致脓毒症，但其往往是与革兰氏阴性菌感染有关。脓毒症通常是从震颤、发烧、血压下降，吸收和心跳加速，和皮肤损伤开始。在数小时或数天内，脓毒症将发展成血管内自发性凝块，严重性低血压，多器官衰竭和死亡。
多数损害源于内毒素而不是侵染的细菌。内毒素结合到细胞上如单核白细胞/巨嗜细胞或内皮细胞并诱导他们产生多种类型的介质如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和多种白细胞介素(IL-1,IL-6和IL-8)，这一过程表明了其作用。过量TNF-α,IL-1,IL-6和IL-8能诱发脓毒性休克。
近来，有许多为治疗人类脓毒症而进行的尝试，其中的绝大部分是使用阻断与上述疾病病理生理学有关的炎症介质的试剂。然而，利用阻断炎症介质的试剂所进行的临床研究还未成功[综述见Natanson等Ann.Intern.Med 120:771-783,1994；Gibaldi,Pharmacotherapy13:302-308,1993]。由于参与炎症的许多介质是补偿应答的，因而具有有益的作用，故一些研究者认为阻断他们的作用可能是不合适的[如Parrillo,N.Engl.J.Med.328:1471-1477,1993]。
目前，已经有数个利用蛋白C在脓毒症的不同动物模型中所进行的令人鼓舞研究的相关报道。Taylor等[J.Clin.Invest.79:918-25,1987]利用活化的，来源于血浆的人蛋白C进行了狒狒脓毒症模型的研究。上述动物进行了预防性注射(如，在LD100E.coli两小时注入之前，给上述动物施用aPC)。全部的5个受试动物均存活了7天，因而，认为它们是实验方案的永久存活者。接受同样E.coli注入的5个对照动物在24-32小时内全部死亡。此外，源于血浆的人蛋白C酶原作为挑战传统疗法的成功的附属物，可用于治疗患有细菌性脓毒症引发的急性紫癜的病人(Gerson等Pediatrics 91:418-422,1993；Smith等Thromb.Haemost,PS1709,p419,1997；Rintala等Lancet 347:1767,1996；Rivard等J.Pediatr.126:646-652,1995)。
重组BPI蛋白已表现出中和内毒素的致死性和亚致死性的作用(Fisher等Crit.Care Med.,22(4):553-558,1994)，该内毒素施用给了小鼠，大鼠和兔。由于具有中和内毒素的能力和其针对革兰氏阴性菌的杀菌活力，BPI能应用于患有革兰氏阴性菌所诱发疾病的病人的治疗中，上述疾病包括菌血症、内毒素血症和脓毒症。
本发明首次描述了在脓毒症治疗中aPC和BPI的组合使用。aPC和BPI的组合使用产生了协同作用，该作用导致aPC和BPI用剂量的减少和接受治疗的病人的临床效果的改善。组合疗法中药量的减少降低了任一药剂可能出现的负作用。因而，结合aPC的抗凝聚/抗炎症性质和BPI的杀菌与内毒素中和的活力，可提供针对脓毒症的有效的协同疗法，该疗法可减少或减轻副作用并可改善脓毒性病人的临床效果。
本发明提供治疗脓毒症病人的方法，该方法包括给病人联合施用药学上有效量的蛋白C和杀菌通透性增加(BPI)蛋白。
本发明进一步提供治疗脓毒症方法，该方法包括给病人施用药学上有效量的BPI蛋白和活化的蛋白C，因而，血浆中活化的蛋白C的水平为约2ng/ml-约300ng/ml.
如本文所公开和要求的，对本发明来说，术语定义如下。
蛋白C是指维生素K依赖型丝氨酸蛋白酶，其具有抗凝聚、抗炎症和纤维蛋白溶酶原的性质，该蛋白包括，但不局限于，来源于血浆的和重组获得的蛋白。蛋白C包括且优选地是人蛋白C，尽管还可能包括具有其蛋白水解的、酰胺裂解的、脂水解的和生物学的(抗凝聚、溶解纤维蛋白和抗炎症)活力的其他种类的蛋白C或其衍生物。蛋白C衍生物的实例见于Gerlitz等人的美国专利No.5,453,373和Foster等人的美国专利No.5,516,650，其中的内容在此均被引入作为参考。
酶原-即酶学上蛋白水解酶的无活性的前体。前述的蛋白C酶原是指分泌型的、无活性的形式，其具有蛋白C的一条或两条链。
活化的蛋白C或aPC是指蛋白C酶原经限制性蛋白酶解作用而转化成具有活性的形式。蛋白C包括且优选地是人蛋白C，尽管还可能包括具有其蛋白水解的、酰胺裂解的、脂水解的和生物学的(抗凝聚、溶解纤维蛋白和抗炎症)活力的其他种类的蛋白C或其衍生物。前述蛋白C的叙述中提及了蛋白C衍生物的实例。
r-hPC-重组人蛋白C酶原。
r-aPC-活化的重组蛋白C，优选地，其是通过激活r-hPC或由原核细胞、真核细胞和转基因动物或植物直接分泌蛋白C的活化的形式而获得，包括，例如，由人肾脏293细胞以酶原的形式分泌，再通过技术人员熟知的方法加以纯化和激活，上述技术方法见于授于Yan的美国专利No.4,981,952和Cottingham,WO97/20043，上述两项专利的内容在此均被引入作为参考。
来源于血浆的活化的蛋白C-通过激活血浆蛋白C以制备活化的蛋白C。Eibl的美国专利No.5,478,558中有关于上述内容的描述，其中的内容在此被引入作为参考。
连续注入-在特定的一段时间内，大体上连续地、不间断地向静脉内引入溶液。
大药妨浓注-在不超过约120分钟的一段时间内定量地(称为大药丸)注入药物。
适与给药的-冻干的制剂或溶液，其适于以治疗药物的形式给药。
单位剂量形式-适于为人类受试者单位药剂的完全分离的单位，每一单位包含预定量的，估计可产生预期治疗效果的活性物质和合适的药物赋形剂。
药学上有效量的-指表示本发明中能治疗人类脓毒症的蛋白C的量。根据上述目的，所施用的蛋白C的具体剂量将由主治医师在评估病例的具体情况后确定。
BPI蛋白-包括天然的和重组获得的杀菌通透性增加(BPI)蛋白；天然的、人工合成的和重组的，并具有生物学活力的BPI蛋白的多肽片段；具有生物学活力的BPI蛋白或其片段的多肽变体，包括杂交融合蛋白和其二聚体；BPI蛋白或其片段或其变体的类似物，包括半胱氨酸替代的类似物和源于BPI的肽段。人BPI的全氨基酸序列和编码BPI的DNA的核苷酸序列由Gray等加以说明(1989,J.Biol.Chem264:9505)。BPI蛋白重组体的基因编码和其表达的方法,包括BPI全蛋白和BPI的片段，见于美国专利No.5,198,541，其中的内容在此被引入作为参考。
本发明涉及利用蛋白C结合BPI蛋白来治疗脓毒症。aPC和BPI的联合使用产生了协同作用，该作用导致aPC和BPI用剂量的减少和接受治疗的病人的临床效果的改善。联合疗法中药剂量的减少降低了任一药剂可能出现的负作用。因而，联合aPC的抗凝聚/抗炎症性质和BPI的杀菌与内毒素中和的活力可提供针对脓毒症的有效的协同疗法，该疗法可减少或减轻不利的状况并可改善脓毒性病人的临床效果。
根据本发明所施用的蛋白C可由本领域中任何已知方法或美国专利No.4,981,952和美国专利No.5,550,036中所述的方法生产和/或分离，本文在此引入作为参考。例如，本发明提供可以从细胞中制备和分离全长的，可溶性蛋白C，或具有生物活力的蛋白C的多肽变体的方法，该方法包括(a)构建一个包含编码蛋白C的DNA的载体；(b)用载体转染细胞；(c)在如下所述的条件下在培养基中培养上述已转染的细胞，在该条件下，细胞可分泌全长的可溶性蛋白C，或具有生物活力的蛋白C的多肽变体。进一步而言，细胞可以是真核细胞，例如，哺乳动物的细胞如金黄仓鼠AV12，人类胚胎293细胞，或小仓鼠的肾细胞。
上述结合施用的蛋白C可根据已知的方法制备成药学上有用的组合物。例如，理想的制剂是稳定的，冻干的，高纯度产品，该产品包含填料(bulking agent)如蔗糖，一种盐如氯化钠，一种缓冲液如柠檬酸钠和蛋白C或aPC。
蛋白C可肠胃外给药，通过在约1小时-约240小时内连续注入合适的剂量以确保其以有效的形式进入血液循环。
与BPI结合治疗时，施用的蛋白C的量为约5μg/kg/hr-约250μg/kg/hr。优选地，与BPI结合施用的蛋白C是活化的蛋白C。施用aPC的量为1.0μg/kg/hr-约50μg/kg/hr。更优选地，施用aPC的量为1.0μg/kg/hr-约40μg/kg/hr。更优选地，施用aPC的量为1.0μg/kg/hr-约35μg/kg/hr。更优选地，施用aPC的量为约5.0μg/kg/hr-约30μg/kg/hr。更优选地，施用aPC的量为约20μg/kg/hr-约30μg/kg/hr。最优选地，施用aPC的量为约24μg/kg/hr。与BPI联合施用的aPC的合适剂量可导致效果的改善或每一药剂量的减少或前述两种结果。
施用的血浆内aPC的浓度范围为约2ng/ml-约300ng/ml。优选地，血浆内的浓度范围为约2ng/ml-约200ng/ml。最优选地，血浆内的浓度范围为约30ng/ml-约150ng/ml，更优选地，约100ng/ml。
通过下列步骤进行aPC的给药每小时以大药丸注射的方式施用1/3的合适剂量；以连续注入1小时的方式施用剩余的2/3的合适剂量；以连续注入23小时的方式施用合适的剂量。通过上述步骤即可在24小时左右完成合适剂量的施用。此外，以1.5倍与正常速率的流速，经静脉内袋状滴泵或注射泵以大药丸注射的方式给药40-50分钟，再以2倍与正常速率的流速，给药10-20分钟。给药者可选择上述两种给药方式中的任意一个。正常的速率即每一时间段内给药者确定的治疗药物的合适的剂量水平，该时间段持续24小时-240小时。
根据本发明，适于使用的BPI蛋白包括，但不局限于，天然的和重组获得的BPI蛋白，例如，Gray等(1989)和美国专利No.5,733,872描述的重组BPI全蛋白，其中的内容在此被引入作为参考；天然的、人工合成的和重组的，并具有生物学活力的BPI蛋白的多肽片段，例如，Ooi等在J.Exp.Med174:649(1991)和Gazzano-Santoro等在Infect.Immun60:4754-4761(1992)中所描述的；具有生物活力的BPI蛋白或其片段的多肽变体，包括杂交融合蛋白和二聚体；具有生物活力的BPI蛋白质或其片段或其变体的多肽类似物，包括半胱氨酸替代的类似物和BPI衍生的蛋白质，上述实例见于美国专利No.5,733,872,5,627,262,5,753,620,5,607,916和5,756,464,此处引入作为参考。
更可取地，本发明的BPI蛋白质包括与天然人类的BPI全蛋白具有相同或者相似氨基酸序列的生物活性分子。这类BPI蛋白质的非限制性例子有如Ooi等人(1991)所描述的天然人类BPI蛋白质的25kd的N-末端片段和Gazzano-Santoro等人(1992)描述的编码天然人类BIPN-末端1到193或者199氨基酸DNA重组表达产物。
本发明的可给药的BPI蛋白质可以通过该领域任何已知的方法产生和/或者分离，或者如U.S.专利No.5,308,834中所描述，此处合并引用。例如，本发明提供一个方法，可以从细胞中生产和分泌全长的，可溶的BPI全蛋白，具有生物活性的多肽片段，或者具有生物活性的BPI全蛋白或者其片段的变异体，这个细胞包括(a)构建一个含有编码BPI DNA的载体；(b)用载体转染细胞和(c)在培养基中培养已转染的细胞，一定条件下，分泌全长可溶的BPI全蛋白，具有生物活性的多肽片段，或者具有生物活性的BPI全蛋白或者其片段的变异体。进一步而言，细胞可以是一个真核细胞，例如金黄仓鼠AV12，人类胚胎的293细胞或者小仓鼠的肾细胞等哺乳动物的细胞。另一可选用的，细胞可以是原核细胞，例如，酵母细胞或者细菌细胞。
术语“联合”指的是BIP蛋白质和蛋白质C同时，按次序的或者作为一个组合的给药。所用的BPI蛋白质和正确的剂量水平在该领域是已知的或者如U.S.专利No.5,756,464所描述的，此处合并引用。本领域的技术人员可以确定所用的剂量水平，取得一个治疗脓毒的药物有效量。含有BPI蛋白质的药物有效成分可以通过全身或者局部给药。全身的给药路线包括静脉的，肌内的或者皮下注射(包括为了长期释放的贮存)，眼内的和眼球后的，鞘内的，腹膜内的(例如，腹膜腔灌洗法)，肺内的用气溶胶或者喷雾药，经皮的。优选的路线是静脉给药。当胃肠外给药时，BPI蛋白质的注射剂量的范围是大约0.04μg/kg/hr到大约4mg/kg/hr。优选地，BIP蛋白质的给药范围是大约4μg/kg/hr到大约420μg/kg/hr。更优选，BPI蛋白质的注射剂量的范围是大约50μg/kg/hr到大约300μg/kg/hr。最优选，BPI蛋白质的注射剂量的范围是大约100μg/kg/hr到大约200μg/kg/hr。治疗可以通过连续灌输或者间歇的注射或者灌输，同时，减少或者增加每天的剂量，例如24小时到240小时，另外，可以由治疗的医师决定。BPI蛋白质优选的给药是开始静脉大药丸注射，然后连续输注。优选的剂量方案是大约0.1mg/kg到大约10mg/kgBPI蛋白质的静脉大药丸注射，接下来的静脉输注的剂量范围是大约4μg/kg/hr到大约420μg/kg/hr，一直持续到10天。本领域技术人员可以确定最佳的药物有效剂量和含有BPI蛋白质治疗成分的给药方案，这些可以根据好的医疗实践和通过个体病人的临床条件确定。
内毒素的抑制和BPI蛋白质的革兰氏阴性杀菌活性以及aPC的抗炎性的联合，导致治疗脓毒效能的加强。这种增效作用使联合治疗中试剂剂量的减少成为可能。
下面的提供的例子只是为了进一步说明本发明。本发明的范围不应该仅仅理解为由下面的例子所组成。
制剂1
人类蛋白质C的制备重组的人类蛋白质C(r-hpc)可以通过杨领域技术人员所熟悉的技术，在人类肾293细胞中产生，例如，在Yan,U.S.专利No.4,981,952公布的，在此处被引入作为参考。编码人蛋白C的基因被Bang等人在U.S.专利N0.4,775,624中公开并要求保护，在此处均被引入作为参考。在293细胞中用来表达人类蛋白质C的质粒是质粒pLPC,Bang等人在U.S.专利No.4,992,373中公开，在此处被引入作为参考。质粒pPLC的构建也在欧洲专利公开No.0 445 939中描述，Grinnell等人在1987,Bio/Technology5:1189-1192中描述，在此处均被引入作为参考。简而言之，质粒被转染到293细胞中，也使稳定的转化体得到鉴定，并亚培养和生长于无血清培养基中。发酵后，通过微量过滤，获得无细胞的培养基。
人类蛋白C采用Yan,U.S.专利No.4,981,952中的技术，进而在培养液中获得分离。在吸附于离子交换树脂(Fast-FlowQ,Pharmacia)之前，澄清的培养基在EDTA中确定终浓度为4mM。用4倍柱体积的20mM Tris,200mM NaCl,pH7.4的溶液和2倍柱体积的20mM Tris,150mM NaCl,pH7.4的溶液洗涤后，结合的重组人类蛋白质C酶原用20mM Tris,150mM NaCl,10mM CaCl2pH 7.4的溶液洗脱。洗脱后，洗脱的蛋白质用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度大于95％。
在NsCl溶液中确定蛋白质的浓度为3M，然后吸附于用20mMTris,3M NaCl,10mMCaCl2,pH7.4的溶液平衡的疏水作用树脂，可以进一步提纯蛋白质。用两倍柱体积的不含CaCl2平衡缓冲液洗涤后，重组蛋白质用20mM Tris,pH7.4的溶液洗脱。
通过去除残留的钙，可以准备将洗脱的蛋白质激活。重组蛋白质过金属亲合柱(Chelex-100,Bio-Rad)，去除钙并再次结合到离子交换树脂(Fast-Flow Q,Pharmacia)上。这些柱子按系列排布，并用20mM Tris,150mM NaCl,5mM EDTA pH7.4的溶液平衡。上蛋白质之后，Chelex-100柱子在从系列中切断之前，用一倍柱体积的相同缓冲液洗涤。在用0.4M NaCl,20mM Tris-乙酸，pH6.5溶液洗脱之前，离子交换树脂用3倍柱体积的平衡缓冲液洗涤。
重组人类蛋白质C的蛋白质浓度和重组活性的蛋白质C溶液分别用UV280nm消光测定，E0.1％=1.81或者1.85。
制剂2重组人类蛋白质C的激活在4℃,50mM HEPES,pH7.5溶液中，将牛的凝血酶偶联到活化的CH-Sepharose 4B上(Pharmacia)。偶联反应在已经装入柱子中的树脂上完成，比例为5000个单位的凝血酶/ml树脂。在循环溶液中加入浓度为0.6ml/L的2-氨基-乙醇之前，凝血酶溶液在柱子中循环3个小时。含有MEA的溶液再循环10-12个小时，以确保完全封闭树脂上未反应的氨基。封闭之后，凝血酶偶联的树脂用10倍柱体积的1MNaCl,20mM Tris,pH6.5的溶液洗涤，以去除所有的非特异性结合的蛋白质，在活性缓冲液中平衡后，再用于活性反应。
提纯的r-hPC在EDTA确定终浓度为5mM(螯合任何残留的钙)，并用20mM Tris,pH7.4或者20mM Tris-乙酸，pH6.5的溶液稀释至2mg/ml。这些材料通过在37℃用50mM NaCl和20mM Tris,pH7.4的溶液或者20mM Tris-乙酸，pH6.5溶液平衡的柱子。流速调整到允许r-hPC和凝血酶接触时间为大约20分钟。收集流出物，立刻鉴定酰胺袭解的活性。如果流出物浮有可以和已建立的aPC标准相仿的比活性，则该材料重新在凝血酶的柱子中循环，完成r-hPC的激活。在等待下一个步骤时，用上述的20mM的缓冲液，pH7.4或者pH6.5的溶液1∶1稀释材料，保持较低浓度。
从aPC的材料中去除被过滤的凝血酶，可以通过将aPC结合到用含有150mM NaCl的活性缓冲液(20mM Tris,pH7.4或者20mM Tris-乙酸，pH6.5)平衡的离子交换树脂(Fast-Flow Q,Pharmacia)上完成。在这些条件下，凝血酶不与离子交换树脂反应，但通过柱子，进入样品流出物中。一旦aPC结合到柱子上，在用含有0.4M NaCl的5mM Tris-乙酸pH6.5或者20mM Tris,pH7.4洗脱结合的aPC这一步骤之前，用2-6倍柱体积的20mM平衡缓冲液洗涤柱子。柱子的大容积洗涤有助于更完全去除十二肽。从柱子中洗脱的原料以冷冻的溶液(-20℃)或者冻干粉末的形式保存。
激活的蛋白质C的抗凝聚活性可以通过测定在活化的不完全凝血激酶时间(APTT)的凝血测定中延长凝血时间的方法测定。制备标准曲线，在稀释的缓冲液(1mg/ml放射免疫测定级牛血清白蛋白[BSA]，20mM Tris,pH7.4,150mM NaCl,0.02％NaN3)中，蛋白质C的浓度变化范围是125-1000ng/ml，而样品在这一浓度范围之内，制备几种不同稀释度。在每一个样品杯中，加入50μl冷的马血浆和50μl的重建活化的不完全凝血激酶时间试剂(partial thromboplastin timeagent)(APTT试剂，Sigma),37℃温浴5分钟。温浴后，50μl适量的样品或者标准样加入到每一个杯子中。稀释缓冲液用来替代样品或者标准样，以便决定基础的凝血时间。向样品或者标准样中加入50μl 37℃的30mM CaCl2之后，立刻开始计时。样品中活化的蛋白质C的浓度可以通过标准曲线的直线回归方程计算得出。此处所报道的凝血时间包括标准曲线的样品至少是三次重复测量的平均值。
通过上文的描述，本领域的普通技术人员可以制备aPC，以用来与BPI蛋白质联合治疗脓毒症。
制剂3BPI蛋白质的表达为了在哺乳动物细胞中制备BPI蛋白和/或者BPI蛋白变体，cDNA序列插入到一个合适的质粒载体上，如美国专利No.5,171,739中所描述的，在此被引入作为参考。上述申请的合适载体是pSV-1，它含有复制的起始点和SV40的早期和晚期的启动子，接下来是重复的克隆位点，接下来是来源于乙型肝炎表面抗原基因的终止序列，质粒中还含有一个细菌DNA复制的起始点和编码氨苄青霉素抗性和二氢叶酸还原酶的基因。类似的载体也可以用来表达其他外源基因[McGrogan,等人。Biotechnology,6:172-177]。为了接受用HindⅢ和BamHⅠ消化的和用碱性磷酸酶去磷酸化的BPI蛋白质的cDNA序列，制备载体DNA。
用亲本质粒合适的限制内切酶进行消化，例如EcoRⅠ和BgⅢ，产生两个含有部分BPI蛋白质编码序列，在pSV-1中插入编码全长BPIDNA片段，制备一个含有插入片段的BPI蛋白质cDNA。这两个片段在制备的SV-1中连接起来，得到的重组克隆可以用限制性内切酶消化两个插入子而出现正确取向得方法进行筛选。
通过限制性消化分析，构成得到证实。为了转染CHO卵巢细胞品系DUXB11细胞，于是制备得到大量的重组克隆。用脂转染的方法执行转染。用标准的方案，将产生的转化细胞在不断增长氨甲喋呤挑选出来。
用转染池或者来源于转染池克隆的上清液，通过抑制TNr的释放，测定在内毒素存在时的结合活力。可以通过该领域已知的标准方案，可以纯化所选的上清液。
制剂4活化的蛋白C的制备通过冻干含有2.5mg/ml活化蛋白C，约15mg/ml蔗糖，约20mg/mlNaCl，和一个pH值介于5.5到6.5之间的柠檬酸钠缓冲液的方案，可以制备活化的蛋白C的稳定冻干制剂。另外，活化的蛋白C稳定冻干制剂包括冻干一种溶液，该溶液含有5mg/ml活化蛋白质C，约30mg/ml蔗糖，约38mg/mlNaCl，和一个pH值介于5.5到6.5之间的柠檬酸缓冲液溶液。
aPC、盐和填料三者之间的比率(w∶w∶w)是决定冻干过程是否合适的一个重要因素。比率的变化依靠于aPC的浓度，盐的选择和浓度以及填料的选择和浓度。特别是，优选的比率是一份活化的蛋白质C，7.6份的盐和6份填料的。
适于连续输注的单位剂量的活化蛋白质C可通过混合活化蛋白质C,NaCl，蔗糖和柠檬酸钠缓冲液而制备。混合后，4ml的溶液转移为一个单位剂量容器中并冻干。含有5mg-20mg活化蛋白质C，并适合给药的剂量为约0.01mg/kg/hr-约0.05mg/kg/hr，单位剂量被密封保存直到用时为止。
制剂5BPI蛋白药物组合物BPI蛋白药物组合物是通过下面的步骤制得的。在柠檬酸缓冲盐溶液中，含有重量百分比分别为0.1％的poloxamer 188(PluronicF-68,BASF Wyandotte,Parsippany)和0.002％聚山梨糖酸酯80(Tween 80,ICI Americas,Inc,Wilmington,Del.)，其中含有1mg/mlBPI蛋白质。另一个含BPI蛋白质药物组合物包括在5mM柠檬酸溶液中，浓度为2mg/ml的BPI蛋白质，150mM NaCl,0.2％poloxamer188和0.002％聚山梨糖酸酯80。这些组合在U.S.专利No.5,756,464中描述。
实施例1
在人脓毒症病人中联合施用活化的蛋白C和BPI蛋白中，用安慰对照进行的双盲实验该方法是在患有严重性脓毒症病人中进行的安慰剂对照进行双盲实验。病人分别用安慰剂、aPC、BPI治疗以及aPC、BPI联合治疗。在48个小时内，BPI蛋白以约100μg/kg/hr-约200μg/kg/hr的剂量连续给药注入。与此同时，在96个小时之内，aPC以约1μg/kg/hr-约50μg/kg/hr的剂量连续给药注入。
入选标准包括4个通常可接受的脓毒标准(心率、呼吸力量(effort)、升高/降低体温、升高/降低白细胞数目)中的3个。病人还表现一定程度的器官功能异常，例如休克、尿排出量减少或者低氧血症。
这项研究的最终终点是具有功能作用剂量的安全性和剂量耐受性，并比较用aPC或者BPI蛋白单独治疗与aPC和BPI蛋白联合治疗的具有功能作用剂量的安全性和剂量耐受性。一个28天导致的综合(all cause)死亡率是这些接受安慰剂对照和接受aPC和BPI联合治疗或者单独治疗的终点。
aPC和BPI蛋白质的联合治疗导致了协同作用，这种作用使得治疗更加安全有效，并减少了治疗脓毒所需的aPC和BPI蛋白质的剂量。
权利要求
1．一种治疗脓毒症病人的方法，该方法包括给病人联合施用药学有效量的蛋白C与杀菌/通透性增加蛋白(BPI)蛋白。
2．权利要求1的方法，其中所述的患者是人。
3．权利要求1的方法，其中所述的蛋白C是人蛋白C酶原。
4．权利要求1的方法，其中所述的蛋白C是活化的人蛋白C。
5．根据权利要求4的方法，其中所述的活化的人蛋白C的量为约1μg/kg/hr-约50μg/kg/hr。
6．权利要求5的方法，其中所述的活化的人蛋白C是以连续注入约1-240小时的方式进行给药。
7．权利要求1的方法，其中所述的BPI蛋白是以大药丸注射的方式进行给药。
8．权利要求7的方法，其中所述的BPI蛋白的量为约0.1mg/kg-约10mg/kg体重。
9．权利要求1的方法，其中所述的BPI蛋白是以连续注入约1-240小时的方式进行给药。
10．权利要求9的方法，其中所述的BPI蛋白的量为约4μg/kg/hr-约420μg/kg/hr。
11．一种治疗脓毒症的方法，该方法包括给病人联合施用药学上有效量的BPI蛋白与活化的蛋白C从而使血浆中活化的蛋白C的水平为2ng/ml-约300ng/ml。
12．权利要求11的方法，其中所述的蛋白C是以大药丸注射的方式进行给药。
13．权利要求11的方法，其中所述的活化的人蛋白C是以连续注入约1-240小时的方式进行给药。
14．权利要求11的方法，其中所述的活化的蛋白C先以大药丸注射的方式再以连续输注进行给药。
15．权利要求14的方法，其中为获得血浆中约2ng/ml-约300ng/ml活化的蛋白质C所需剂量的三分之一是采用大药丸注射给药，剩余三分之二的活化蛋白质C通过连续输注的方式给药。
全文摘要
本发明提供了一种治疗脓毒症患者的方法。所要求的治疗是使用蛋白C和BPI蛋白的组合疗法。组合蛋白C的抗凝聚/抗炎症特征和BPI的杀菌和内毒素中和活性,从而提供了一种有效地、协同的浓毒症的疗法,结果是可以减低或减轻副作用并改善临床上脓毒症患者的预后。
文档编号A61P31/04GK1324244SQ99812519
公开日2001年11月28日 申请日期1999年10月15日 优先权日1998年10月22日
发明者C·J·菲舍尔, S·－·C·B·彦 申请人:伊莱利利公司