专利名称：丝氨酸蛋白酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有醚键合精氨酸置换的丝氨酸蛋白酶抑制剂，含有它们的药物组合物，以及所述丝氨酸蛋白酶抑制剂在制备药物中的应用。
丝氨酸蛋白酶是在凝血级联中起重要作用的酶。除凝血酶和凝血因子Xa之外，此类蛋白酶的其它实例包括凝血因子VIIa、IXa、XIa、XIIa和蛋白质C。凝血酶在凝血级联中是最终的丝氨酸蛋白酶。凝血酶的主要功能是裂解血纤蛋白原生成血纤蛋白单体，它们交联形成不溶性凝胶。此外，凝血酶通过在级联早期激活凝血因子V和VIII来调节其自身的产生。它在细胞水平也具有重要作用，其中凝血酶在特定受体起作用引起血小板聚集、内皮细胞活化和成纤维细胞增殖。因而凝血酶右淤血栓形成中具有中心调节作用。由于凝血酶的抑制剂具有广泛的治疗性用途，所以人们一直在尝试发现新的丝氨酸蛋白酶抑制剂。上述努力中存在的困难是发现一种可将治疗安全性、选择性、有效性与合成可行性相结合的化合物。特别是，口服途径给药的生物利用度对于选择性凝血酶抑制剂而言是难题。在WO 97/16444中公开了具有修饰的三肽序列苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酸的凝血酶抑制剂，其中羧基存在于氨基末端并且精氨酸被通过醚键与脯氨酰类似物相连的碱性(氨基亚氨基甲基)苯基或碱性(氨基亚氨基甲基)吡啶基所置换。
本发明的目的是提供新的化学上可行的丝氨酸蛋白酶抑制剂，这些丝氨酸蛋白酶抑制剂具有良好的药理学和毒理学性能和足够的治疗用效能。
迄今已发现本目的可以通过式(I)的丝氨酸蛋白酶抑制剂，特别是凝血酶抑制剂来实现， 其中J为H、R1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R3OOC-(CHR2)p-、(R2a，R2b)N-CO-(CHR2)p-或Het-CO-(CHR2)p-；D是式-NH-CHR1-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)OR1]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)N(R2a，R2b)]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)Het]-C(O)-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Pig或D-3-Pig的氨基酸；E是-NR2-CH2-或片段 其选择性地被(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基或苄氧基取代；R1选自(1-12C)烷基、(2-12C)链烯基、(2-12C)炔基、(3-12C)环烷基和(3-12C)环烷基(1-6C)亚烷基，这些基团可以被(3-12C)环烷基、(1-6C)烷氧基、氧代、OH、CF3或卤素选择性取代；和选自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基、(8-16C)芳烯基和(14-20C)(双芳基)烷基，其中所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)环烷基、(1-6C)烷氧基、OH、CF3或卤素选择性取代；R2、R2a和R2b分别独立地选自H、(1-8C)烷基、(2-8C)链烯基、(2-8C)炔基、(3-8C)环烷基和(3-6C)环烷基(1-4C)亚烷基，它们可以分别被(3-6C)环烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或卤素选择性取代；和选自(6-14C)芳基和(7-15C)芳烷基，其中的芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或卤素选择性取代；R3如R2定义或Het-(1-6C)烷基；R4是H或(1-3C)烷基；X和Y是CH或N，条件是它们不同时为N；Het是含有一个或多个选自O、N和S的杂原子的4-、5-或6-元杂环；m是1或2；p是1、2或3；q是1、2或3；t是2、3或4；及其前药；和它们的药学上可接受的加成盐和/或溶剂化物。
特别是，本发明的化合物在口服给药后具有改进的生物利用度。
在本发明的优选实施方式中化合物具有式(I)，其中J为H、R1、R1-SO2-、R3OOC-(CHR2)p-、(R2a，R2b)N-CO-(CHR2)p-或Het-CO-(CHR2)p-；更优选是被(1-6C)烷氧基选择性取代的(3-12C)环烷基；或D是式-NH-CHR1-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)OR1]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)N(R2a，R2b)]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)Het]-C(O)-的氨基酸；更优选是式-NH-CHR1-C(O)-的氨基酸或式-NR4-CH[(CH2)qC(O)N(R2a，R2b)]-C(O)-的L-氨基酸；或E是-N(3-6)环烷基-CH2-或片段 它们被(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基或苄氧基选择性取代；更优选不被取代；或R1选自(1-12C)烷基、(3-12C)环烷基和(3-12C)环烷基(1-6C)亚烷基，这些基团可以被(3-12C)环烷基、(1-6C)烷氧基或氧代选择性取代，并且选自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(14-20C)(双芳基)烷基，其中所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)环烷基、(1-6C)烷氧基、OH、CF3或卤素选择性取代；更优选选自(3-12C)环烷基和(3-12C)环烷基(1-6C)亚烷基，它们可以被(3-12C)环烷基一(1-6C)烷氧基选择性取代，并且选自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(14-20C)(双芳基)烷基，其中所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)环烷基、(1-6C)烷氧基或卤素选择性取代；或R2是H；或R2a和R2b分别独立地选自H、(1-8C)烷基、(3-8C)环烷基和(3-6C)环烷基(1-4C)亚烷基，它们可以分别被(3-6C)环烷基或(1-6C)烷氧基选择性取代，并且选自(6-14C)芳基和(7-15C)芳烷基，其中的芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或卤素选择性取代；或R3选自H、(1-8C)烷基、(3-8C)环烷基和(3-6C)环烷基(1-4C)亚烷基，它们分别可以被(3-6C)环烷基或(1-6C)烷氧基选择性取代，并且选自(7-15C)芳烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或卤素选择性取代；和选自Het-(1-6C)烷基；更优选选自(1-8C)烷基和(3-8C)环烷基，它们分别可以被(3-6C)环烷基或(1-6C)烷氧基选择性取代，并且选自(7-15C)芳烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或卤素选择性取代，和选自Het-(1-6C)烷基；或R4是H或(1-3C)烷基；或X和Y是CH；或Het是含有一个或多个选自O、N和S的杂原子的4-、5-或6-元杂环；m是2；或p是1；或q是2；或t是3或4；更优选是4。
在进一步优选的实施方案中，D是式-NH-CHR1-C(O)-的氨基酸或谷氨酰基[或它们的(1-6C)烷基酯]；R1选自(3-12C)环烷基和(3-12C)环烷基(1-6C)亚烷基，它们可以被(3-12C)环烷基或(1-6C)烷氧基选择性取代，并且选自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(14-20C)(双芳基)烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)环烷基、(1-6C)烷氧基或卤素选择性取代；和R3选自(1-8C)烷基和(3-8C)环烷基，它们分别可以被(3-6C)环烷基或(1-6C)烷氧基选择性取代，并且选自(7-15C)芳烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或卤素选择性取代，和选自Het-(1-6C)烷基。
特别优选的化合物是其中J为-CH2COO(1-6C)烷基、(3-8C)环烷基、-SO2-10-樟脑、-CH2CONH苯基或-CH2CONH(3-8C)环烷基。其它非常优选的化合物是那些其中D为D-环己基丙氨酰基、D-苯基丙氨酰基、D-二苯基丙氨酰基或谷氨酰基[或它们的(1-6C)烷基酯]的化合物。另外特别优选的其中E是片段 其中t是3或4的化合物。
本发明中术语具有下列含义(1-12C)烷基、(1-8C)烷基、(1-6C)烷基、(1-3C)烷基是指分别具有1-12、1-8、1-6和1-3个碳原子的支链或非支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、己基、辛基等。(2-12C)烯基和(2-8C)烯基是指分别含有2-12和2-8个碳原子的支链或非支链烯基，例如乙烯基、2-丁烯基等。(2-12C)炔基和(2-8C)炔基是指分别具有2-12和2-8个碳原子的支链或非支链炔基，例如乙炔基、丙炔基等。(1-6C)烷氧基是指具有1-6个碳原子的烷氧基，烷基部分具有如上定义的含义。(3-12C)环烷基、(3-8C)环烷基、(3-6C)环烷基是指分别具有3-12、3-8和3-6个碳原子的一-或双环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。(1-6C)亚烷基、(1-4C)亚烷基是指分别含有1-6和1-4个碳原子的支链或非支链亚烷基，例如-(CH2)a-(其中a相当于碳原子的数量)-CH(CH3)-和-CH(CH3)-CH2-等。(2-10C)亚烯基是指具有2-10个碳原子和一个或多个双键的支链或非支链烯基，例如-CH＝CH-CH2-、-(CH2)2-CH＝CH-CH(CH3)-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-等。(6-14C)芳基、(6-12C)芳基是指分别具有6-14或6-12个碳原子的芳族烃基，例如苯基、萘基、四氢萘基、茚基等。(7-15C)芳烷基是指具有7-15个碳原子的芳烷基，其中“烷基”表示(1-8C)亚烷基而芳基是(6-14C)芳基，两者如上述定义。(8-16C)芳烯基是指具有8-16个碳原子的芳烷基，其中“烯基”表示(2-10C)亚烯基而芳基是(6-14C)芳基，两者如上述定义。(14-20C)(双芳基)烷基是指在同一碳原子上或在不同碳原子上被两个独立选定的芳基取代的(1-3C)烷基，所述芳基如(6-12C)芳基所述定义，例如双苯基甲基。卤素是指F、Cl、Br或I。Tiq是指1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸。Atc是指2-氨基四氢萘-2-羧酸。Aic是指2-氨基二氢茚-2-羧酸。Pig是指全氢异喹啉基羧酸。术语“前药”是指在给药后代谢为一种或多种具有式I的活性化合物的化合物。适用的前药例如是式I化合物的N-烷氧基羰基保护(优选N-乙氧基羰基)的衍生物。
由于氨基异喹啉、氨基喹唑啉或氨基酞嗪中的氨基所具有的碱性小于赖氨酸和精氨酸中的氨基，意外地是新发明的化合物具有足够的丝氨酸蛋白酶抑制功效。
如上所述，本发明的化合物是参与凝血级联的丝氨酸蛋白酶的抑制剂，特别是凝血酶和/或凝血因子Xa的抑制剂。这些化合物可以应用在临床和兽医治疗中，即用来治疗和预防凝血酶介导性和凝血酶相关性疾病。这包括许多其中凝血级联被激活的血栓形成和前血栓形成病症。此类疾病和病症是或伴随有例如深度静脉血栓形成、肺栓塞、血栓静脉炎、血栓形成或栓塞引起的动脉闭塞、血管成形术或血栓溶解期间或之后的动脉再闭塞、动脉损伤或侵入性心脏手术继发的再狭窄、术后静脉血栓形成或栓塞急性或慢性动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞、某些类型的癌症和转移，以及某些种类的神经变性疾病。本发明的化合物也可以用作体外抗凝剂或用作体外血液循环的抗凝剂，例如在透析和外科手术中所必需的那些。
按照另一方面，本发明提供一种治疗和/或预防动物或人体中凝血酶介导和凝血酶相关性疾病的方法，该方法包括用治疗有效量的本发明化合物治疗损伤动物或人体。
本发明的化合物可以经肠道(例如口服、直肠经鼻或局部)或非肠道(例如经肌肉内、皮下、静脉内或腹膜内注射)给药。
这些化合物及其组合物的精确给药剂量和给药方案必然取决于本发明化合物所施用的个体对象的需要、药物的形式、病情的程度或需求以及医药人员的判断。通常，非肠道给药需要的剂量需要比其它给药方法较低的剂量，这更取决于吸收作用。然而，用于人体的日剂量优选是O.001-100mg/kg体重，更优选0.01-10mg/kg体重。
一个日剂量可以以一个或多个适合如口服、直肠、舌下或经鼻途径或经皮(如透皮贴剂，或膏剂形式)的剂量单位施用。
本发明化合物的另一种给药途径是通过其它方式将所述化合物引入(透析)循环中，例如渐进地或一次性地注射到透析膜的系统上游中，同时将血液引入该回路。而且，本发明的化合物可以提供给所述体外循环的线路和/或其它设备，优选通过涂层的方式(但不限于此)。另外，设备的部分材料中可以吸收有本发明的化合物，例如在透析用薄膜中。
本发明涉及一种在哺乳动物中抑制血小板聚集的丧失、抑制血纤蛋白的形成、抑制血栓形成和抑制栓塞物形成的药物组合物，该组合物含有本发明的化合物和适当的辅料。这些组合物可以选择性地含有抗凝剂、抗血小板剂和溶血栓药。可以将该组合物加入血液、血液制品或哺乳动物器官中以便产生预期的抑制作用。本发明还涉及一种预防或治疗哺乳动物中的不稳定心绞痛、顽固性心绞痛、心肌梗塞、暂时性局部缺血发作、心房纤维性颤动、血栓形成性中风、栓塞性中风、深度静脉血栓形成、播散性血管内凝血以及再造管血管的再闭塞和再狭窄的药物组合物，该组合物含有本发明的化合物。这些药物组合物可以选择性地含有抗凝剂、抗血小板剂和溶血栓药。本发明还涉及一种降低哺乳动物中表面的血栓形成性的方法，该方法通过共价或非共价地将本发明的化合物连接在表面上。
本发明进一步涉及一种与适合该组合物的包装材料相结合的药物组合物，该药物组合物如上所述，所述包装材料内带使用所述药物组合物的说明书。
为了制备给药形式，如丸剂、片剂、栓剂、(微)胶囊、散剂、乳剂、霜剂、软膏、植入物、喷雾剂、溶液或混悬液形式的注射制剂，可以采用适当的辅料如载体、填充剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、乳化剂、稳定剂、表面活性剂、抗氧剂、着色剂、防腐剂等，如标准参考文献Gennaro等人的《Remington氏药物科学》(第18版，Mack发行公司，1990，尤其参见第8部分药物制剂及其制备)中所述的。通常，任何不妨碍活性化合物功能的药学可接受辅料均适宜并且可采用。
适宜本发明活性剂给药的载体和填充剂包括，例如琼脂、醇、纤维素衍生物、脂肪、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、二氧化硅、灭菌盐水等。
粘合剂是用来赋予药物组合物粘结性质的试剂，目的是减小药物组合物在生产和处理中的损耗。粘合剂例如是纤维素、淀粉类、聚乙烯吡咯烷酮等。
适合本发明活性剂给药的润滑剂例如是硬脂酸镁。
表面活性剂是化合物在不同物理环境如亲水性和疏水性环境中易于接触和迁移的试剂。多种表面活性剂是药物组合物制备领域中所公知的，例如公开在《Remington氏药物科学》(第18版，作者A.R.Gennaro，Mack发行公司，1990，Easton，宾西法尼亚)第19章中。在制备药物制剂过程中可采用的表面活性剂例如是聚乙二醇(PEG)等。
所述化合物也可用于可植入药物装置内，例如US专利4767628中所述的那些，其内容在此引入作为参考。所述装置应含有足够量的化合物以缓慢释放该化合物(例如一个月以上)。
式(I)的化合物可以由式(II)的化合物或其衍生物制得，其中位于芳基上的氨基(芳基氨基)被保护为尿烷如Alloc或酰胺如苯甲酰基，其中D、E、X、Y和m具有上述定义并且Pg是N-保护基(优选尿烷如Boc)。 本申请中所用的术语N-保护基是指肽化学中常用来保护α-氨基的基团，例如烯丙氧基羰基(Alloc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Z)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)或邻苯二甲酰基。可以以不同方式脱除保护基，这取决于那些保护基的性质。有关氨基保护基及其脱除方法的概述公开在上文提及的《肽、分析、合成、生物学》第3卷和T.W.Greene&P.G.M.Wuts的《有机合成中的保护基》第2版，(1991，John Wiley&Sons，Inc.，)中。
利用该领域中的已知方法如肽偶联、烷基化或还原胺化，脱除N-保护基Pg并且选择性修饰脱保护氨基可以得到式(I)的化合物。
式(II)的化合物可以由式(III)的化合物或其衍生物制得，其中芳基氨基被保护为尿烷如Alloc或酰胺如苯甲酰基，其中E、X、Y、m和Pg具有上述含义。脱除式(III)化合物中的N-保护基Pg并且使肽与式Pg-D-OH的化合物偶联可以生成式(II)的化合物，其中D和Pg具有上述含义。 另外，式(I)的化合物可直接由式(III)的化合物制得。脱除式(III)化合物中的N-保护基Pg并且使肽与式J-D-OH的化合物偶联可以生成式(I)的化合物，其中J和D具有上述含义并且可以选择性地含有附加保护基。
由式(IV)的那些化合物在标准Mitsunobu条件下(三丁基膦，二烷基偶氮二羧酸)通过与式J-D-E-(CH2)m-OH、Pg-D-E-(CH2)m-OH或Pg-E-(CH2)m-OH反应可得到式(I)、(II)和(III)的化合物或其衍生物，其中X和Y具有上述含义，其中芳基氨基被保护为尿烷如Alloc或酰胺如苯甲酰基，其中D、E、J、m和Pg定义如上并且选择性地含有保护基(R.L.Elliot，H Kopecka，D.E.Gunn，H.-N.Lin&D.S.Garvey，《生物有机、医学和化学通讯》(Bioorg.Med.Chem.Lett.)6.2283(1996)；K.Wisniewski，A.S.Koldziejczyk&B.Falkiewicz，《肽科学杂志》(J.Pept.Sc.)4，1(1998))。 通过相应的胺R3NH2与丙烯酸乙酯共轭加成，用氢化锂铝还原酯官能团并且进而引入N-保护基Pg制备得到其中E＝-R3NCH2-和m＝2的式Pg-E-(CH2)m-OH类的醇。
通过与BBr3[J.F.W.McOmie&D.E.West，《有机合成合集》(Org.Synth.Collect.)第V卷，412(1973)]或EtSNa[A.S.Kende&J.P.Rizzi，《四面体通讯》，22，1779(1981)]反应可以实现将式(V)的甲基芳基醚脱甲基化为式(IV)相应的酚类化合物。 适合制备式(V)化合物的起始原料是式(VI)的化合物，其中X和Y具有上式含义。式(VI)化合物的氯基通过与氨在加压下加热可以被直接转变为氨基。另外，通过与酚在碱性条件下反应可以使式(VI)化合物的氯基转化为苯氧基，随后用醋酸铵处理得到式(V)化合物的氨基。式(V)的化合物也可以通过用叠氮化钠处理式(VI)的化合物且进而用PPh3还原该叠氮芳烃来获得。 由式(VII)的化合物通过用磷酰氯处理可以获得其中X和Y定义如上的式(VI)的化合物。式(VII)的化合物公开在文献中；7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮Chapman等人《化学会志》890(1947)，6-甲氧基-2H-酞嗪-1-酮，Consonni P.&A.Omodei-Sale，Farmaco，Ed.Sci.，76，691(1976)(化学文摘85-177191)。通过例如用过酸(如间-氯过苯甲酸)使6-甲氧基-异喹啉(Hendrickson，J.B.；Rodriguez，C.；《有机化学杂志》1983，48，3344-3346)转化为N-氧化物盐，然后用HCl处理，并且此后令该N-氧化物盐与氯化试剂(如磷酰氯)反应(J.Robinson，《美国化学学会会志》69，1941(1939))可以制备其中X＝CH和Y＝CH的式(VI)化合物(1-氯-6-甲氧基-异喹啉)。 作为上述制备本发明化合物的方法中提及的一个过程步骤，肽偶联可以通过所属领域常用于偶合-或缩合-肽片段的已知方法来进行，例如通过叠氮法、混合酐法、活化酯法，或优选通过碳二亚胺法，尤其是催化和消旋抑制化合物如N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基苯并三唑的加入。适用的方法公开在《肽、分析、合成、生物学》第3卷，E.Gross&J.Meienhofer编辑(Academic Press.New York，1981)，R.Knorr，A.Trzeciak，W.Bannwarth&D.Gillessen，《四面体通讯》，30，1927(1989)和L.A.Carpino，《美国化学学会会志》115，4397(1993)。
本发明的化合物可以是游离碱的形式，也可以是由反应混合物中分离出的药学可接受盐的形式。通过用有机或无机酸处理式I的游离碱也可以制得药学可接受盐，有机或无机酸例如是盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、马来酸、丙二酸、甲磺酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸和抗坏血酸。
本发明的化合物具有一个或多个手性碳原子，由此可能获得纯的对映异构体，或对映异构体的混合物，或含有非对映异构体的混合物。获得纯对映异构体的方法为所属领域所熟知，例如结晶由旋光酸和外消旋混合物获得的盐，或用手性柱层析。对于非对映异构体可以采用正相或反相柱。
本发明通过下列实施例举例说明。
时间(分钟) ％A％B％C0 20 60 2030 20 20 6032 20 0 8037 20 0 8050 20 60 20收集适当馏分后，用0.1N盐酸将混合物脱盐，随后冷冻干燥，生成227mg(54％)的标题化合物，其为白色蓬松固体。ESI-MS693.6(M+H)+，637.6(M-H)-，673.4(M+Cl)-。分析HPLC(SupelcosilLC-18-DB5um，250*2.1mm)流动相A＝0.5M NaH2PO4+H3PO4pH2.1；B＝H2O；C＝CH3CN/H2O(3∶2，v/v)。梯度时间(分钟)％A％B ％C0 20 602030 20 0 8040 0 0 10050 0 0 100保留时间39.27分钟(纯度96.0％)。
通过分光光度分析法测量在凝血酶作用下显色底物s-2238的水解率可以评估本发明的抗凝血酶活性。这种在缓冲体系中的抗凝血酶活性实验用来评估试验化合物的IC50值。试验介质氨丁三醇-NaCl-聚乙二醇6000(TNP)缓冲液参比化合物12581(Kabi)载体TNP缓冲液可以用二甲基亚砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇促进溶解，它们在最终的反应混合物中浓度高达2.5％时也不产生不利影响。技术试剂*1.氨丁三醇-NaCl(TN)缓冲液缓冲液的组成氨丁三醇(Tris)6.057g(50mmol)NaCl 5.844g(100mol)水至 1L37℃下溶液的pH用HCl(10mmol.1-1)调至7.42.TNP缓冲液将聚乙二醇6000溶解在TN缓冲液中得到浓度3g.l-13.S-2238溶液将一瓶S-2238(25mg；Kabi Diagnositica，瑞典)溶解在20mlTN缓冲液中得到浓度1.25mg.ml-1(2mmol.l-1)4.凝血酶溶液将人凝血酶(16000nKat/瓶；Centraal Laboratorium voorBloedtransfusie，Amsterdam，The Netherlands)溶解在TNP缓冲液中得到储备液835nKat.ml-1。
使用前即时用TNP缓冲液稀释该溶液至浓度为3.34nKat.ml-1。
*-所用全部组分为分析级-采用超纯水水溶液(Milli-Q质量)。试验和参比化合物溶液的制备将试验和参比化合物溶解在Milli-Q水中得到10-2mol.l-1的储备浓度。用载体分步稀释至各种浓度得到10-3、10-4和10-5mol.l-1。试验使用稀释液(包括储备溶液)(反应混合物中的终浓度分别为3·10-3、10-3、3·10-4、10、3·10-5、10-5、3·10-6和10-6mol.l-1)方法室温下，将0.075ml和0.025ml试验化合物或参比化合物溶液或载体分别吸量至微量滴定平板的孔中并且分别用0.115ml和0.0165mlTNP缓冲液稀释这些溶液。将0.030ml S-2238溶液的等份试样加入各孔中，37℃下将平板在恒温箱(Amersham)中预热和预培养10分钟。预培养后，通过向各孔加入0.030ml的凝血酶引发S-2238的水解。37℃下培养平板。培养1分钟后，利用动力学微量滴定平板读数器(Twinreader plus，Flow Laboratories)在405nm下每2分钟测量各个样本的吸光度，共持续90分钟。
所有数据利用LOTUS-MEASURE采集在IBM个人计算机中。对于各种化合物浓度(表示为mol.l-1反应混合物)和空白对照，绘制吸光度与反应时间(分钟)的曲线。反应的评估对于各个最终浓度，由实验曲线计算出最大吸光度。按照Hafner等人所述方法(Arzneim，-Forsch，/药物研究(Drug Res.)1977；27(II)1871-3)利用对数变换分析计算出IC50值(终浓度，表示为μmol.l-1，抑制50％的空白最大吸光度时)。抗凝血酶活性
权利要求
1.具有式(I)的丝氨酸蛋白酶抑制剂， 其中J为H、R1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R3OOC-(CHR2)p-、(R2a，R2b)N-CO-(CHR2)p-或Het-CO-(CHR2)p-；D是式-NH-CHR1-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)OR1]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)N(R2a，R2b)]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)Het]-C(O)-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Pig或D-3-Pig的氨基酸；E是-NR2-CH2-或片段 其选择性地被(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基或苄氧基取代；R1选自(1-12C)烷基、(2-12C)链烯基、(2-12C)炔基、(3-12C)环烷基和(3-12C)环烷基(1-6C)亚烷基，这些基团可以被(3-12C)环烷基、(1-6C)烷氧基、氧代、OH、CF3或卤素选择性取代；和选自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基、(8-16C)芳烯基和(14-20C)(双芳基)烷基，其中所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)环烷基、(1-6C)烷氧基、OH、CF3或卤素选择性取代；R2、R2a和R2b分别独立地选自H、(1-8C)烷基、(3-8C)链烯基、(3-8C)炔基、(3-8C)环烷基和(3-6C)环烷基(1-4C)亚烷基，它们可以分别被(3-6C)环烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或卤素选择性取代；和选自(6-14C)芳基和(7-15C)芳烷基，其中的芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或卤素选择性取代；R3如R2定义或Het-(1-6C)烷基；R4是H或(1-3C)烷基；X和Y是CH或N，条件是它们不同时为N；Het是含有一个或多个选自O、N和S的杂原子的4-、5-或6-元杂环；m是1或2；p是1、2或3；q是1、2或3；t是2、3或4；及其前药；和它们的药学上可接受的加成盐和/或溶剂化物。
2.按照权利要求1的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中m为2；X是CH和Y是CH。
3.按照权利要求2的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中J为H、R1、R1-SO2-、R3OOC-(CHR2)p-、(R2a，R2b)N-CO-(CHR2)p-或Het-CO-(CHR2)p-；D是式-NH-CHR1-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)OR1]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)N(R2a，R2b)]-C(O)--NR4-CH[(CH2)qC(O)Het]-C(O)-的氨基酸；E是-N(3-6)环烷基-CH2-或片段 它们被(1-6C)烷基或(1-6C)烷氧基选择性取代；R1选自(1-12C)烷基、(3-12C)环烷基和(3-12C)环烷基(1-6C)亚烷基，这些基团可以被(3-12C)环烷基、(1-6C)烷氧基或氧代选择性取代，并且选自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(14-20C)(双芳基)烷基，其中所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)环烷基、(1-6C)烷氧基、OH、CF3或卤素选择性取代；R2是H；R2a和R2b分别独立地选自H、(1-8C)烷基、(3-8C)环烷基和(3-6C)环烷基(1-4C)亚烷基，它们可以分别被(3-6C)环烷基或(1-6C)烷氧基选择性取代，并且选自(6-14C)芳基和(7-15C)芳烷基，其中的芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或卤素选择性取代；或R3选自H、(1-8C)烷基、(3-8C)环烷基和(3-6C)环烷基(1-4C)亚烷基，它们分别可以被(3-6C)环烷基或(1-6C)烷氧基选择性取代，并且选自(7-15C)芳烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或卤素选择性取代，和选自Het-(1-6C)烷基；p是1；q是2；t是3或4。
4.按照权利要求3的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中D是式-NH-CHR1-C(O)-的氨基酸或谷氨酰基[或它们的(1-6C)烷基酯]；R1选自(3-12C)环烷基和(3-12C)环烷基(1-6C)亚烷基，它们可以被(3-12C)环烷基或(1-6C)烷氧基选择性取代，并且选自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(14-20C)(双芳基)烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)环烷基、(1-6C)烷氧基或卤素选择性取代；R3选自(1-8C)烷基和(3-8C)环烷基，它们分别可以被(3-6C)环烷基或(1-6C)烷氧基选择性取代，并且选自(7-15C)芳烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)环烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或卤素选择性取代，和选自Het-(1-6C)烷基。
5.按照权利要求4的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中J为-CH2COO(1-6C)烷基、(3-8C)环烷基、-SO2-10-樟脑、-CH2CONH苯基或-CH2CONH(3-8C)环烷基；D为D-环己基丙氨酰基、D-苯基丙氨酰基、D-二苯基丙氨酰基或谷氨酰基[或它们的(1-6C)烷基酯]；和E是片段 其中t是3或4。
6.一种药物组合物，含有权利要求1-5任一项的丝氨酸蛋白酶抑制剂和适合药用的辅料。
7.权利要求1-5任一项的丝氨酸蛋白酶抑制剂用于治疗。
8.权利要求1-5任一项的丝氨酸蛋白酶在制备治疗或预防凝血酶介导和凝血酶相关疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及具有式(I)的丝氨酸蛋白酶抑制剂,其中J为H、R
文档编号A61P9/10GK1348444SQ99812496
公开日2002年5月8日 申请日期1999年10月19日 优先权日1998年10月23日
发明者C·M·蒂默斯, J·B·M·里温克尔 申请人:阿克佐诺贝尔公司